具体实施方式

现在，参考图1-3，这些图说明了根据本发明一个方面，提供的细胞培养生物反应器100的一个实施例。在一些实施例中，生物反应器100包括构成内室的外壳或壳112及盖住内室的可取下盖子114，盖子114可以包括带可取下盖或帽C的各种开孔或端口P，用于选择性引入或移除流体、气体(包括通过鼓泡器)、探头、传感器、取样器等。如图2A、2B和2C所示，在一些实施例中，生物反应器100可以与外部储罐102和管道104连接(例如，正向连接和返回连接)，形成回路，用于将流体循环到生物反应器100。

在生物反应器外壳112形成的内室中，配备若干隔室或腔室，用于将流体或气体输送通过整个生物反应器100。如图3所示，在一些实施例中，所述室可以包括位于或靠近生物反应器100底座的第一室116。在一些实施例中，第一室116可以包括搅拌器，促使流体在生物反应器100内流动。在一些实施例中，搅拌器可以是“插入式”可旋转、非接触式磁性叶轮118(正如下文所阐述的那样，其可以放置或容纳于容器(未示出)内，该容器包括多个引入和释放流体的开孔)。在一些实施例中，由于提供的搅拌，流体之后可以沿生物反应器100外部或周边部分向上流动(如图2箭头A所示)到环形室120内。在一些实施例中，生物反应器适用于接收固定床，如结构化螺旋床122，该床使用中可以包含和截留生长的细胞。但是，本发明的生物反应器可以与任何类型的细胞培养装置一起使用，包括固定床、填料床、流化床或类似装置。如图3所示，在一些实施例中，螺旋床122可以是筒形，在使用时放入或置于室120内。在一些实施例中，螺旋床122可以在运输之前在工厂制造期间预先安装在所述室内。

在一些实施例中，离开室120的流体通过床122一侧(上侧)的室124，在此处，流体暴露于气体(如氧气或氮气)。在一些实施例中，然后，流体可以径向向内流动到中心回流室126。在一些实施例中，中心回流室实际上可以是圆柱形，可以通过无孔管或管道128形成或通过结构化螺旋床的中心开孔形成。在一些实施例中，室126将流体返回到第一室116(回流箭头R)，循环通过生物反应器100，从而形成连续回路(在这种情况下是“由下至上”)。在一些实施例中，还配备传感器，例如，温度探头或传感器T，用于探测室126内流体的温度。在一些实施例中，还在流体进入(或重新进入)室116之前的位置配备其它(例如，pH、氧气、溶解氧、温度)传感器。

图3A示出了基体材料的一个实施例，其用作本发明生物反应器中的结构化固定床，特别是螺旋(或“缠绕”)床122。在一些实施例中，在网状结构制造的一层或多层间隔层122b附近相邻设置一层或多层固定层122a。在一些实施例中，这种分层可以任选重复几次，以实现堆叠或分层构造。在一些实施例中，间隔层122b中包含的网状结构构成用于细胞的曲折路径，以使流体径向向外流动到固定层122a内(参见图3B中固定层122a材料中悬浮或捕获的细胞L)，细胞培养基可以构成本申请请求保护的任何发明的一部分。由于这种类型的布置，结构化固定床内保持了细胞的均匀性。在一些实施例中，可以采用构成所述曲折路径的其它间隔结构。在一些实施例中，如图3A所示，结构化固定床可以随后沿轴或芯(例如，管道128，可以设置在多个部件中)螺旋或同轴卷绕。在一些实施例中，结构化固定床的各层紧紧地缠绕。在一些实施例中，芯的直径、层的长度和/或数量将最终定义组件或基体的规格。在一些实施例中，层122a、122b每层的厚度可以是0.1至5mm，0.01至10mm，或0.001至15mm。

参考图4、5、6A和6B，描述了生物反应器200的第二实施例。在一些实施例中，生物反应器200包括第一室至第五室216、220、224、226和228，使流体按照上述方式循环。在此实施例中，外壳212任选包括多个模块化部件。在一些实施例中，这些部件包括底部部件230，一个或多个中间部件250，及盖子部件270。在一些实施例中，部件230、250、270可以适用于以流体密封方式相互作用，从而形成配备所述216、220、224、226和228室的生物反应器200。

在一些实施例中，及正如也许从图4中很好地了解的那样，底部部件230可以包括周边连接器(图中以槽232的形式示出)，用于接收和接合从其中一个中间部件250凸出的相应的周边连接器，如榫舌252。在一些实施例中，在内部，底部部件230可以包括直立壁234，其定义接收流体搅拌器(未示出)的第一室216。在一些实施例中，壁234可以包括开孔或通道，以允许流体径向流入到底部部件230的外部部分，所述外部部分定义了另一个室或第二室220。在一些实施例中，由于底部部件230的存在，流动被重新垂直引导，形成湍流，促进流体在整个生物反应器内的混合和均匀性，从而增强细胞培养过程。

两个中间部件250a、250b以堆叠形式示出，第一(下部)部件250a的周边连接器(槽254)与第二(上部)部件250b的相应连接器(榫舌252)接合。正如从图4可以了解的那样，在一些实施例中，每个中间部件250a、250b可以包括分别支承榫舌252和槽254的外侧壁256。在一些实施例中，径向向内，内壁258容纳内部和外部连接器，这些连接器的形式可以是直立突出物260、262，可以提供用于接收管236的相应末端，从而形成第五室或回流室228的周边。

在一些实施例中，第一中间部件或下部中间部件250a还可以包括开孔，如加长弓形槽264，其至少部分接收底部部件230的连接器，如从壁234突出的直立突起234a。在一些实施例中，内部突出物466可以在中间部件250a、250b内形成中心开孔266a，用于允许流体在壁234定义的内部柱中流动，以及用于接收任何温度传感器、导管等(位于流体离开固定床之后的位置)。在一些实施例中，第二中间部件250b可以以类似方式构建，从而促进互换性，其中如前所述，第二中间部件或上部中间部件250b中的开孔(槽264)允许在第五室或回流室228内建立流体薄层下降流动或降膜流动。

在一些实施例中，多个支架268在内壁256和外壁258之间延伸。在一些实施例中，支架268包括径向延伸支架268a和至少一个周向延伸支架268b，它们一起构成允许流体流动的类似多孔或网状板的结构(此实施例或任何实施例中的所述支架可以包括筛、网、格栅或其它骨架结构，可以是刚性的、半刚性的或挠性的)。实际上，支架268设计为通过最大限度地增加利用允许流体穿过的开孔创建的开放空间的数量，增强通过各床的流体流动。在一些实施例中，为了培养细胞，在部件250a、250b之间形成的室224内，可以安装围绕壁234的固定床，如螺旋床(未示出)。在一些实施例中，流体从上部中间部件250b通过，进入盖子部件270部分定义的第四室226，而且可以在回到第一室216进行循环之前，先流到第五室228形成的柱内。

在一些实施例中，盖子部件270包括连接器，如榫舌272，用于组装到第二中间部件250b的相应连接器(槽254)内。在一些实施例中，盖子部件270还可以包括第一或中心接收器，如直立壁274，用于接收可取下帽或盖276，帽或盖276可以包括各种端口P，用于连接管道，以将流体或其它物质输送到生物反应器400(和第五室228)内。在一些实施例中，帽或盖276还可以配备温度传感器或探头T，如图所示，以及其它传感器，还可以适用于向生物反应器200提供加入物或从生物反应器200中取出物质，或用于调节产品生产工艺。正如可以理解的那样，在一些实施例中，帽或盖276可以很好地定位，用于对经室228的回流进行探测或流体取样。在一些实施例中，第二周边接收器，如直立壁277，也可以适用于连接第二帽或盖278，用于接收传感器或向生物反应器和特别是其周边部分(包括其中完成细胞培养)的第三室226加入物质或取出物质(包括培养样品)。在一些实施例中，帽或盖276、278可以具有不同类型的端口P，可以是不同尺寸/形状，或它们可以是相同的，从而促进互换性。

在一些实施例中，可以在连接处采用粘合剂或胶将这些结构固定在一起。在一些实施例中，还可以使用螺纹或锁紧(如卡销方式)连接，从而维持流体密封，避免泄漏，并有助于确保维持无菌性。在一些实施例中，模块化部件230、250、270的布置允许生物反应器200可以在现场迅速预组装、组装或构建，而且拆卸也同样迅速。由于可能很容易加入其它管道增高壁234或中间部件250，因此，可以根据应用，调节固定床的数量或生物反应器200的高度，以适合特定的需求或工艺设置。

在一些实施例中，从室内一个固定床至下一个相邻固定床的流动是直接的或未中断的。在一些实施例中，接收床的外室224可以建立通过其内多个床的连续流动路径，这些床可以是结构化固定床、非结构化固定床或其它床。在一些实施例中，基本上无阻碍的连续流动有助于促进均匀性，就好像这些模块实际上是一个床一样，从而改善细胞培养工艺的可预测性和质量。均匀性指的是整个床中细胞分布是均匀的或具有某种程度上相同的分布。

图6A和6B还示出了包括固定床296的模块化生物反应器200的替代实施例。在一些实施例中，底部部件230和盖子部件270可以适用于连接外部外壳292，与中间部件250的周边建立间隙或空间。正如可以了解的那样，外部外壳292的高度可以基本上沿细胞培养第三室226的整个高度延伸，或者，可以细分为单独的几个室，这些室与细胞培养室的每个相应部分相连接。在一些实施例中，间隙G或空间可以用于提供加热或冷却效果，从而控制与中间部件250相连的床的温度。间隙G或空间还可以仅仅是为生物反应器中间区域的各壁提供保温，这些壁接近床中培养的细胞，可能对温度变动较为敏感。这种保温的作用是防止施加在生物反应器底部部件230底部的热量向上延伸到床296中的粘附细胞。

图6A还示出了鼓泡在生物反应器中的可能使用，所述鼓泡可以在任何公开实施例中提供。在所示布置中，鼓泡由位于第五室228内的鼓泡器294提供。产生的气泡可能因而向上流动，与回流流体形成逆流。

这些附图还示出了中间部件250可与内管236接合，内管236是流体无法渗透的，从而提供室228，用于将流体流返回到底部部件230，在此室228内，可以搅拌流体，流体返回并从下面进入床，向上流动通过床(任何公开实施例中)。这些管236可以这样提供：一根管道与每个存在的固定床296相对应，如图所示，两个中间部件250与每根管道236接合(例如，一个从下面接合和一个从上面接合)。但是，在此实施例或任何其它公开实施例中，应该了解的是，固定床最内部的表面，如螺旋床最内部的螺旋缠绕，可以通过将其制造为或调节为对流体不渗透而执行类似的功能。例如，表面可以涂布流体无法渗透的材料或疏水性材料，从而流体仍然保留在床中，保持流体明显的回流通过室228形成的中心柱。

根据本发明的另一个方面，生物反应器(可以是上述生物反应器100、200或任何其它已知形式中的任何一个生物反应器)用于处理细胞，产生目标产品(例如，病毒或蛋白质)，可以适用于将床中细胞冷冻到低于细胞内液体的凝固点(例如，从零度至-20℃，更优选是大约-5℃至-20℃)的温度，然后，通过解冻(包括可能通过辅助加热)，恢复到未冷冻状态(例如，室温)。这种温度周期导致细胞膜破裂，导致释放出细胞内的最终产品，从而回收目标产品。这种回收方法避免了损害生物反应器的完整性。根据本发明，为了避免在完全装满时，因冷冻液体膨胀而损害生物反应器，在冷冻之前先基本上排净液体，但也可以在液体排净期间进行冷冻。

生物反应器300的一个实施例适用于执行上述的“冷冻-解冻”操作，无需放在冷冻器内(由于尺寸限制，如果不是不可能的话，大多数生物反应器也都很难放在冷冻器内)。特别地，生物反应器300可以直接与冷冻器连接，连接可以采用各种形式，例如，作为示例，如图7、8、9、10和11所示。参考图7，生物反应器300包括外壳312，外壳312由多个模块化部件组成，比如底部部件330、一个或多个中间部件350和盖子部件370。还提供夹套390，该夹套390至少环绕包括一个或多个细胞培养室的中间部件350。夹套390可以包括定义一空间的圆柱状或环状部分，与冷却流体一起形成关联冷冻器，用于热调节生物反应器300内各室的温度，并与中间部件350连接。

或者，夹套390可以是便携式装置或可拆卸套筒形式。所述装置或套筒可以通过滑动或卡紧的方式包围生物反应器300，从而在需要冷冻时使用，不需要时不使用。套筒可以预冷却/冷冻，可以重复使用或制成一次性使用形式。

冷冻生物反应器300内细胞中的液体可以通过多种方式实现。一个示例是向夹套390(注意图8中的进口392和出口394)覆盖的空间提供流体(如冷空气)，从而与生物反应器300的外表面直接接触。流体可由泵M供应，泵M与进口和出口连通，将气体以连续方式循环通过夹套390，冷却器或致冷器N可以在流体在夹套390外面循环期间对流体进行冷却。从而，在此示例中，夹套390、泵M和冷却器或致冷器N一起作为冷冻器。

如图9所示，另一个方案是在夹套390中提供接收冷却流体(例如，防冻剂(如液体乙二醇，或混有液体乙二醇的水)，及可能的抗菌剂)的容器。这可以通过在夹套390限定的空间内提供一根或多根冷却管实现，例如，软管或硬管396。每根管道396还可以具有进口和出口396a、396b，使流体在冷冻器和泵的回路中循环(参见图8)。可以采用不止一根管道(例如，堆叠构造)，可以实现更好的热量控制，避免因各进口和出口位置交错而可能出现的“过热”点。管道396还可以浸在夹套390内作为良好的热导体的流体(例如，液体乙二醇)中，改善导热性和提高传热程度。在生物反应器300是圆柱形的典型情况中，管道396实际上可以是环形，可以以螺旋方式横穿生物反应器300。如下文所述，管道396还可以集成到生物反应器300的一个或多个器壁内。

还可以采用容器替代管道396，容器可以包括内胆，例如，一个或多个软袋398，如图10所示。软袋398也可以具有进口398a和出口398b，用于循环冷却流体。鉴于软袋398表面积较大且表面柔软，由于与中间部件350外表面接触的表面积增加，从而导致传热程度改善。同样，对典型圆柱形生物反应器300来说，袋398通常呈环状，从而各表面密切热接触，最大程度地提高了冷却传输。或者，内胆或袋398可以没有进口或出口，其温度通过在相邻结构(例如，中间部件350或另一个部件)中集成加热或冷却系统进行调节。在任何情况下，内胆或袋可以包括由耐受冷冻或周期温度变化的聚合物材料(例如，HDPE或PVC)制造的多层软袋，可以根据具体布置的要求，设计为环绕任何生物反应器的一个室或安装在一个室内。

在这些情况中的任何情况下或细胞内或细胞周围的液体被冷冻的其它情况下，可以仅仅通过停止向夹套390供应冷却流体而进行自然解冻。或者，可以向夹套390供应热流体来帮助解冻。在另一个替代方案中，正如下面进一步讨论的那样，是使用加热器帮助冷冻(或部分冷冻)细胞的解冻操作，可能涉及向夹套390或生物反应器300本身加入热流体或缓冲液。

解冻后，冷冻细胞的细胞膜破裂。可以向生物反应器300引入流体(例如，缓冲液)，收获目标产品或材料(例如，病毒或蛋白质)。生物反应器300在冷冻步骤之前至少可以部分排干，从而为其它流体(即缓冲液，同样，缓冲液可以加热以促进解冻)提供空间。一旦液化，流体可以泵送到生物反应器300之外的接收罐，然后可以进行提纯(与解冻流体分离或混合)。

根据本发明的另一个方面，并参考图11，可以通过向生物反应器500供应冷介质冷冻细胞，例如，-5℃至大约-20℃的冷空气，或者温度足够使任何细胞或全部细胞冷冻的冷空气。如图11所示，这可以通过采用冷冻器502，通过进口504或其它端口，向生物反应器500和特别是细胞培养室500a直接供应冷介质实现，并且可以任选通过位于冷冻器502上游或下游的除菌过滤器506实现。这一点与上面的实施例相反，在上面的实施例中，采用生物反应器的外室接收冷冻细胞的流体。还可以提供温度传感器或探头508来监测生物反应器500的温度，和特别是包括需冷冻细胞的任何部分的温度。

如果采用空气作为冷冻细胞的介质，空气可以任选进行脱水，从而避免水分在任何输送管道和除菌过滤器506(如果存在的话)中冷凝和凝固而导致这两个部件无法使用。如所示出的，可以通过采用脱水器510干燥环境空气来提供脱水空气，脱水器510可以是分子筛、换热器或其它热源形式，可以位于冷冻器502的上游或下游。此外，空气可以在输送之前(冷却之前或之后)通过接触温度低于-20℃的空气目标温度(如-30℃)的盘管或其它来源进行干燥。还可以采用其它气体代替空气。

如上文所述，在细胞冷冻之后，可以将细胞解冻。可以仅仅通过从相关冷冻器或冷冻装置撤走任何冷影响，然后等待而被动或自然实现解冻。但是，例如，还可以通过加热细胞或生物反应器的相关部分或室，对细胞进行主动解冻。

在一些实施例中，主动加热可以采用外部施加或传输的热实现，实现这种加热的各种实例在图12-16中示出。在图12中，生物反应器600的热源或加热器602包括导热块604。导热块604可以由金属制造，适用于接收至少部分生物反应器600(例如，其底座)。加热元件606可以应用于导热块604，如图13所示，包括软导电片，例如，由其上或其内连接(例如，胶水连接或封装)电线610的聚合物膜608制造，电线可以与电源S连接。或者，导热块604可以配备一个或多个接收流体流动的通道(未示出)。在任何情况下，生物反应器600可以与加热器602连接，实现需要的传热，并导致冷冻细胞或部分生物反应器600更迅速解冻。

正如从图12和12A中可以了解的那样，在生物反应器600和接收生物反应器600的导热块604的凹槽部分之间存在间隙P，导致传热达不到最佳状态。因此，根据本发明的另一个方面，并参考图14、15和16，加热器602可以直接或另外集成到生物反应器600内(此处或别处公开的任何形式)。图14示出了一种电阻加热元件，例如，导电线612，可以集成到生物反应器600的壁600a内，例如，通过注射成型(和特别是包覆成型，从而电线与生物反应器器壁600a的材料(塑料)密切接触)。替代地或附加地，电线612可以外部应用到器壁600a，如图15所示，最大程度地提高加热效果(例如，以蛇形方式应用，如图所示，但是可以采用最大程度提高覆盖面积的任何方式)。正如可以了解的那样，这样做可以根据细胞培养工艺和/或要求加热的地方(例如，仅仅是与细胞培养室相应的生物反应器的一部分)，以更精确地方式选择性加热生物反应器600的一部分，从而最大程度地提高效率。

参考图16，实现主动解冻的另一种温度调节方案是在生物反应器600的器壁600a内集成通道600b。流体(气体或液体)可以通过通道600b，实现需要的热交换(加热或冷却)。特别是，流体可以从进口I流动到出口O，并且可能地在与加热器614连通的循环回路中流动。还可以提供温度探头或传感器620，以更准确的方式监测生物反应器600的温度，并帮助确保不会发生过热和损害。

本发明还被认为涉及一种含冷冻细胞的细胞培养床，该床是生物反应器的一部分或不是其一部分。

如本文所使用的，下述术语具有以下含义：

除非上下文清楚表明，否则本文所述的“一”、“一个”及“所述”指的是单数和复数指代。举例来说，“一个室”指的是一个或多个室。

本文在谈到可测值，例如参数、数量、时距等时使用的“大约”、“基本上”或“近似”指的是包括规定值+/-20％或以下的变化，优选+/-10％或以下，更优选+/-5％或以下，甚至更优选+/-1％或以下，及更优选+/-0.1％或以下，这些范围内的所述变化适合在本发明中执行。但是，应该理解的是，修饰语“大约”所指示的数值本身也是特别公开的。

本文所述“包括”、“包含”、“组成”是同义词，是包含式或开放式词语，规定存在该词语后紧跟的要素(例如，组分)，且并不排除或排斥本领域熟悉的或公开的其它的、未提出的组分、特征、元素、元件、步骤。

虽然本文示出和描述了本发明的优选实施例，但是，对本领域技术人员来说，显而易见地是，这些实施例仅仅是作为示例。本领域技术人员目前可以想到的众多变形、改变以及替代均不超出本发明。例如，虽然生物反应器以垂直方向示出，但是，它可以采用任何方向。此外，虽然示出的生物反应器独立于任何隔离器或柜，但是，应该了解的是，生物反应器可以与所述结构组合使用，从而维持无菌环境。应当了解的是，在本发明的实践中可采用此处所述本发明实施例的各种替换形式。所附根据权利要求旨在限定适用法律下本发明的保护范围，且藉此应涵盖这些根据权利要求及其等同变换的范围内的方法和结构。