一种分离卡前列素15位异构体的方法
阅读说明：本技术 一种分离卡前列素15位异构体的方法 (Method for separating carboprost 15-position isomer ) 是由 王方道 王东 王猛 吴伟锋 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种卡前列腺素15位异构体杂质分离技术方法,属于药物化学分离技术领域。将带有15位羟基叔醇化合物B,通过PG保护得到15位S型卡前列素D和15位R型卡前列素E(组成15位羟基叔醇化合物C),分离后得到15位卡前列素D或15位卡前列素E纯品。在此基础上,本发明还提供了一种适合工业化放大的制备卡前列素系列产品的方法。本发明方法通过合适的保护基衍生后,采用普通硅胶柱层析即可分离异构体,操作简单,得到产物的质量满足要求,大大降低生产成本,提高产品的综合效益。(The invention discloses a separation technical method of 15-bit isomer impurities of caprostaglandin, belonging to the technical field of medicinal chemistry separation. And (3) performing PG protection on the compound B with 15-site hydroxyl tertiary alcohol to obtain 15-site S-type carboprost D and 15-site R-type carboprost E (forming a 15-site hydroxyl tertiary alcohol compound C), and separating to obtain a pure product of the 15-site carboprost D or the 15-site carboprost E. On the basis, the invention also provides a method for preparing carboprost series products suitable for industrial scale-up. The method can separate isomers by adopting common silica gel column chromatography after being derived by a proper protecting group, has simple operation, meets the requirement on the quality of the obtained product, greatly reduces the production cost and improves the comprehensive benefit of the product.)
技术领域
本发明涉及药物化学分离技术领域，具体涉及一种卡前列腺素15位叔醇R异构体杂质分离技术新方法。
背景技术
前列腺素(prostaglandins，简称PGs)是一类具有广泛生理活性的重要内源性产物。PGs存在于几乎所有哺乳动物的组织中，在生殖系统、消化系统、呼吸系统和心血管系统中发挥着重要作用，参与体温调节、炎症反应、青光眼、妊娠、高血压、溃疡及哮喘等生理病理过程。
PGs结构特征为：具有一个五元脂环及两个侧链，上侧链通常有7个碳、下侧链有8个碳组成20碳不饱和脂肪酸及其类似物。PGs最早由美国学者Von Eluer在1930年发现并命名，1962年Bergstorm提取出两种PG纯品(PGFl和PGF2)并确定其化学结构。1969年Willis首次提出PGs是体内的一种炎症介质。随后PGs各种生理活性、药理活性受到深入研究。
前列腺素存在天然来源少，提取困难，体内代谢迅速，稳定性差等缺点，因此科学家相继全合成了系列前列腺素物质或类似物，以满足临床需求。
目前临床已成功地将其应用于引产、催生和人工流产，上市的药物有：卡前列素(1)和卡前列甲酯(2)以及卡前列素胺丁三醇(3)等，其结构表示如下：
卡前列素的合成策略是利用关键中间体Corey内酯，分别在α和ω位接入上下侧链，典型的合成反应路线如下：
1974年，Ernest W.Yankee(J.Am.Chem.Soc.,1974,96,5865-5876)首次合成卡前列素甲酯；Pranav Patel(J.Org.Chem.2008,73,7213-7218)以及WO2008081191中也报道了类似的合成方法：卡前列腺素甲酯15R异构体分离，均是在倒数第二步进行高效制备色谱过柱，大大限制了产能，影响生产效率；而在WO2017093770 A1中报道了才采用粒径为40-70μmChromatorexMB型硅胶通过柱层析分离去除15R异构体，收率仅为57％。此方法手性填料价格昂贵，大大增加的生产成本，限制了其工业化大规模应用。专利CN1136938 C公开了采用模拟移动床色谱(简称SMBC)分离卡前列腺素甲酯，该方法对设备投入较高，不合适工业化生产，且分离纯度仅为90％，无法满足药典对异构体的要求。
2019年专利CN110746333A报道了采用右旋樟脑磺酰氯为手性拆分剂进行分离，反应方程式如下：
其中，半缩醛羟基和15位叔羟基的选择性有待验证，同时该分子中存在联苯甲酰基，同时又引入手性樟脑磺酰基，使得整个分子更为复杂，导致三步收率只有17％左右，给后续工业化大生产带来困难和不确定性。
随着卡前列腺素药效作用的拓展，受到越来越厂家的青睐，市场潜力巨大。因而优化现有合成工艺，提高产率，降低成本，具有很大的现实意义和经济价值；同时，设计出更简便易行的大规模生产工艺，取得市场先机，也是研究这类前列腺素合成工艺的着眼点之一，在填补工艺空白、创造经济价值有着极为重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：将现有工艺产生的15位羟基异构体，通过引入合适的保护基后，即可采用简单的纯化方法(例如柱层析)去除，以达到收率和操作难易程度的显著提高，产品质量也得到提升，从而增强公司产品的竞争力。在此基础上，本发明还提供了一种适合工业化放大的制备卡前列素系列产品的方法。
本发明所述一种分离卡前列素15位异构体的方法，其核心技术特征在于：将带有15位羟基叔醇化合物B，通过PG保护得到15位S型卡前列素D和15位R型卡前列素E(组成15位羟基叔醇化合物C)，分离后得到15位S型卡前列素D纯品和15位R型卡前列素E纯品。
其中，R＝THP、TES、TBS、Bz、Bn。
进一步地，在上述技术方案中，所述PG保护选自苯甲酰基，三苯甲基，三乙基硅、乙酰基、对甲苯磺酰基、苄基等。在最优化条件下，采用乙酰基分离效果最为理想。
进一步地，在上述技术方案中，所述分离时Rf差值在0.05以上，采用柱层析、薄层色板、HPLC制备柱等进行分离。优选采用柱层析方法分离。
在上述分离方案地基础上，本发明还提供了一种卡前列素的制备方法，包括如下步骤：化合物A与甲基格氏试剂低温下加成反应得到化合物B；化合物B经过乙酰基保护得到化合物C1；化合物C1经过柱层析分离得到15S卡前列素D1；15S卡前列素D1还原得到化合物F；化合物F经过Witiig反应得到卡前列素1。采用反应方程式表示如下：
进一步地，在上述技术方案中，第一步甲基格氏试剂选自甲基氯化镁、甲基溴化镁或甲基碘化镁。
进一步地，在上述技术方案中，第一步反应溶剂为THF、2-MeTHF或甲苯中一种或多种；反应温度为0℃以下，优选采用-50℃以下。
进一步地，在上述技术方案中，第二步乙酰基保护采用乙酰氯或乙酸酐在三乙胺、吡啶或二异丙基乙基胺条件下进行。
进一步地，在上述技术方案中，第三步采用DIBAL-H还原，乙酰基也同时去除，无需另外进行水解。
进一步地，在上述技术方案中，第三步反应溶剂为2-MeTHF或THF；反应温度为0℃以下，优选采用-50℃以下。
在实际实验过程中，从结构式可知，从化合物A中羰基进行加成得到中间体B叔醇，叔醇存在R和S两种构型，加上分子中原有的手性结构，这样该分子属于差向异构体(非对映异构体)，从理论上是可以分开的。实验过程中，通过TLC检测时，尝试采用不同的展开剂，始终看不到分开迹象；采用HPLC分离，似乎有分开迹象，但是始终难以基线分离，因而此中间体采用制备色谱分离，分离效率通常非常很低。
接着尝试通过对新产生叔醇进行衍生化，例如采用苯甲酰基，三苯甲基，三乙基硅、乙酰基、对甲苯磺酰基、苄基等进行衍生保护，经过筛选后，发现采用乙酰基保护时，与该叔醇完全反应，TLC检测生成二个极性变小的点(Rf差值在0.05以上)，通过普通硅胶柱层析法，即可有效地分离出R异构体，高收率得到目标S构型中间体D1。
进一步地，在上述技术方案中，典型地合成过程如下：在反应器中加入按照专利CN108602769A第0166-0178段的记载合成出化合物A。接着采用甲苯溶解，冷却到-50℃以下，滴加甲基氯化镁格式试剂得到差向异构体叔醇B，在三乙胺存在下滴加乙酸酐，室温搅拌，完成转化为乙酰基保护的叔醇酯C1，TLC检测为二个小极性的点(展开剂PE/EA＝2/1，Rf＝0.6和0.7)。通过普通的硅胶层析柱纯化，得到小极性的目标分子D1以及稍大极性异构体E1。接着DIBAL-H还原内酯，同时乙酰基也脱掉，一步得到关键中间体F，通过维蒂希反应，得到卡前列素1。
进一步地，在上述技术方案中，卡前列素1按照现有文献或专利转化成卡前列腺素甲酯2及卡前列素胺丁三醇3。
本发明积极效果
本发明成功地开发了去除卡前列素15R羟基异构体的方法，在手性异构体引入时及时去除，既规避了做到最后卡前列腺素甲酯进行15R异构体通过高效液相分离，也避免了用右旋樟脑磺酰氯作为拆分剂带来的工业化放大生产时二个羟基选择性潜在风险和低收率，通过普通硅胶柱层析进行分离，操作简单，得到产物的质量满足要求，大大降低生产成本，提高产品的综合效益。
本发明卡前列腺素{包括目前市售的卡前列素(1)和卡前列甲酯(2)以及卡前列素胺丁三醇(3)}工业化制备方法操作简单，收率高，避免了在高活性阶段进行分离而引起的高活性物质对操作人员潜在的毒害风险，提高了产品质量，大大降低对生产设备的要求，提高了产品竞争力。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。以下实施例子按照R＝TBS、TES和Bz为例进行的。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1以保护剂R＝TBS进行实例
第一步：按照专利CN108602769A第0166-0178段的记载合成60g出化合物A，白色固体，收率95％。
第二步：在2L三口瓶中，加入化合物A(55.0g,145mmol)，接着加入甲苯800mL，氮气保护下，冷却至-50℃以下，开始滴加3M MeMgCl四氢呋喃溶液(120mL)，TLC检测原料完全消失，停止反应。将反应液升温到0℃，向其中缓慢滴加500mL饱和氯化铵水溶液，再滴加3M盐酸水溶液，直至pH＝3-4为止。分出有机层，水层用200mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤减压蒸馏得到粗品，硅胶柱快速柱层析得到55.1g浅黄色粘稠液体B，收率96％。
第三步，氮气保护下，将上述中间体B(55g,139mmol)溶解于300mL二氯甲烷，加入三乙胺(21.0g,200mmol)。开启搅拌，滴加乙酸酐(18.0g，176mmol)，滴加完毕，室温搅拌反应24小时。TLC检测，原料完全消失，生成二个小极性的点。减压浓缩，半饱和食盐水洗，干燥。过滤得到的粗品硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚作为流动相，进行快速分离，得到小极性的产物点，为浅黄色油状液体D1，36.5g，收率60％。
第四步：向500mL反应瓶中，加入化合物D1(36.5g,83.2mmol)和100mL四氢呋喃，氮气保护下，冷却至-50℃以下，开始滴加1.6M DIBAL-H甲苯溶液(260mL,416mmol)，滴加过程中，保持反应温度不超过-50℃。加毕继续在该温度下搅拌反应10分钟，TLC检测原料完全消失，生成一个极性稍大产物(EA/PE＝1/1，Rf＝0.5)。将反应液倒入快速搅拌的1M冷盐酸水溶液中，边倒边补加酸，使其始终保持在酸性环境。加毕调pH＝3-4，转移至分液漏斗，乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩至干，得到浅黄色油状液体36.5g，为中间体F。不经进一步纯化，直接进行下步反应。
第五步：氮气保护下，在带有机械搅拌3L反应瓶中，加入4-羧丁基三苯基溴化磷(100g,225mmol)和300mL四氢呋喃，降温到-10℃，加入叔丁醇钾(73.0g,0.65mol)，然后控温-5℃，搅拌10分钟。控温-5℃至-10℃下，向反应液中滴加中间体F(36.5g,0.128mol)/四氢呋喃300mL溶液。滴毕保温反应12小时，停止反应。向反应体系中加入500mL水。乙酸乙酯300mL萃取，水相加入柠檬酸调节pH＝4-5，乙酸乙酯300mL萃取，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩，柱层析纯化，得到浅黄色粘稠油状液体24.5g，为卡前列腺素1，HPLC纯度98.1％，两步收率为66.7％。
第六步：将卡前列素(24.5g,66.8mmol)溶于经过过滤135mL异丙醇中，加入氨丁三醇(8.5g,70.2mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。过滤，浓缩，然后加入异丙醇和丙酮，20℃下搅拌析晶，过滤，得到湿品30.0g。再将上述湿品，溶于异丙醇中，过滤，去除机械杂质，浓缩大部分溶剂，然后加入丙酮，析晶，过滤40℃干燥得到25.2g白色固体。HPLC纯度98.7％，无15R异构体。收率77.0％。
实施例2以保护剂R＝TES进行实例
第一步：按照专利CN108602769A第0166-0178段的记载合成出6.0g化合物A，白色固体，收率95％。
第二步：在2L三口瓶中，加入化合物A(5.5g,14.5mmol)，接着加入甲苯80mL，氮气保护下，冷却至-50℃以下，开始滴加3M MeMgCl四氢呋喃溶液(12mL)，TLC检测原料完全消失，停止反应。将反应液升温到0℃，向其中缓慢滴加50mL饱和氯化铵水溶液，再滴加3M盐酸水溶液，直至pH＝3-4为止。分出有机层，水层用20mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤减压蒸馏得到粗品，硅胶柱快速柱层析得到5.5g浅黄色粘稠液体B，收率96％。
第三步，氮气保护下，将上述中间体B(5.5g,13.9mmol)溶解于30mL二氯甲烷，加入三乙胺(2.1g,20mmol)。开启搅拌，滴加乙酸酐(1.8g，17.6mmol)，滴加完毕，室温搅拌反应24小时。TLC检测，原料完全消失，生成二个小极性的点。减压浓缩，半饱和食盐水洗，干燥。过滤得到的粗品硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚作为流动相，进行快速分离，得到小极性的产物点，为浅黄色油状液体D1，3.60g，收率59％。
第四步：向100mL反应瓶中，加入化合物D1(3.6g,8.2mmol)和10mL四氢呋喃，氮气保护下，冷却至-50℃以下，开始滴加1.6M DIBAL-H甲苯溶液(25.6mL,41.0mmol)，滴加过程中，保持反应温度不超过-50℃。加毕继续在该温度下搅拌反应10分钟，TLC检测原料完全消失，生成一个极性稍大产物。将反应液倒入快速搅拌的1M冷盐酸水溶液中，边倒边补加酸，使其始终保持在酸性环境。加毕调pH＝3-4，转移至分液漏斗，乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩至干，得到浅黄色油状液体3.70g，为中间体F。不经进一步纯化，直接进行下步反应。
第五步：氮气保护下，在带有机械搅拌300mL反应瓶中，加入4-羧丁基三苯基溴化磷(10g,22.5mmol)和30mL四氢呋喃，降温到-10℃，加入叔丁醇钾(7.30g,65mmol)，然后控温-5℃，搅拌10分钟。控温-5℃至-10℃下，向反应液中滴加中间体F(3.70g,13.0mmol)/四氢呋喃30mL溶液。滴毕保温反应12小时，停止反应。向反应体系中加入50mL水。乙酸乙酯30mL萃取，水相加入柠檬酸调节pH＝4-5，乙酸乙酯30mL萃取，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩，柱层析纯化，得到浅黄色粘稠油状液体2.45g，为卡前列腺素1，HPLC纯度98.3％，两步收率为66.8％。
第六步：将卡前列素(2.45g,6.65mmol)溶于经过过滤13.5mL异丙醇中，加入0.85g氨丁三醇(7.02mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。过滤，浓缩，然后加入异丙醇和丙酮，20℃下搅拌析晶，过滤，得到湿品3.0g。再将上述湿品，溶于异丙醇中，过滤，去除机械杂质，浓缩大部分溶剂，然后加入丙酮，析晶，过滤40℃干燥得到2.5g白色固体。HPLC纯度98.8％，无15R异构体。收率77.0％。
实施例3以保护剂R＝Bz进行实例
第一步：按照专利CN108602769A第0166-0178段的记载合成30g出化合物A，油状液体，收率80％。
第二步：在1L三口瓶中，加入化合物A(25.0g)，接着加入甲苯400mL，氮气保护下，冷却至-50℃以下，开始滴加3M MeMgCl四氢呋喃溶液(60mL)，TLC检测原料完全消失，停止反应。将反应液升温到0℃，向其中缓慢滴加250mL饱和氯化铵水溶液，再滴加3M盐酸水溶液，直至pH＝3-4为止。分出有机层，水层用100mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤减压蒸馏得到粗品，硅胶柱快速柱层析得到27.5g浅黄色粘稠液体B，收率96％。
第三步，氮气保护下，将上述中间体B(27.5g)溶解于150mL二氯甲烷，加入三乙胺(10.5g)。开启搅拌，滴加乙酸酐(9.0g)，滴加完毕，室温搅拌反应24小时。TLC检测，原料完全消失，生成二个小极性的点。减压浓缩，半饱和食盐水洗，干燥。过滤得到的粗品硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚作为流动相，进行快速分离，得到小极性的产物点，为浅黄色油状液体D1，18.2g，收率59％。
第四步：向250mL反应瓶中，加入化合物D1(18.2g,42.5mmol)和50mL四氢呋喃，氮气保护下，冷却至-50℃以下，开始滴加1.6M DIBAL-H甲苯溶液(187.5mL,300.0mmol)，滴加过程中，保持反应温度不超过-50℃。加毕继续在该温度下搅拌反应10分钟，TLC检测原料完全消失，生成一个极性稍大产物。将反应液倒入快速搅拌的1M冷盐酸水溶液中，边倒边补加酸，使其始终保持在酸性环境。加毕调pH＝3-4，转移至分液漏斗，乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩至干，得到浅黄色油状液体18.0g，为中间体F。不经进一步纯化，直接进行下步反应。
第五步：氮气保护下，在带有机械搅拌3L反应瓶中，加入4-羧丁基三苯基溴化磷(50g)和150mL四氢呋喃，降温到-10℃，加入叔丁醇钾(36.5g)，然后控温-5℃，搅拌10分钟。控温-5℃至-10℃下，向反应液中滴加中间体F(18.0g,63.4mmol)/四氢呋喃150mL溶液。滴毕保温反应12小时，停止反应。向反应体系中加入150mL水。乙酸乙酯150mL萃取，水相加入柠檬酸调节pH＝4-5，乙酸乙酯150mL萃取，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩，柱层析纯化，得到浅黄色粘稠油状液体12.2g，为卡前列腺素1，HPLC纯度98.0％，两步收率为66.5％。
第六步：将卡前列素(12.2g,33.1mmol)溶于经过过滤70mL异丙醇中，加入氨丁三醇(4.2g,34.7mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。过滤，浓缩，然后加入异丙醇和丙酮，20℃下搅拌析晶，过滤，得到湿品15.0g。再将上述湿品，溶于异丙醇中，过滤，去除机械杂质，浓缩大部分溶剂，然后加入丙酮，析晶，过滤40℃干燥得到12.5g白色固体。HPLC纯度98.5％，无15R异构体。收率76.5％。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
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