一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 (Sericin hydrogel and preparation method and application thereof ) 是由 张业顺 沈聪昳 张国政 吴堂凤 钱平 朱大林 方瑷 曹喜涛 冉素晴 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种丝胶蛋白水凝胶。该丝胶蛋白水凝胶由丝胶蛋白水溶液和交联剂水溶液反应制得,制备方法是：将不含丝素的蚕茧洗净、干燥、粉碎得到蚕茧粉,加水置于100～180℃反应0.5～10小时,离心并去除不溶物质,收集澄清溶液,获得浓度为2～18％的丝胶蛋白水溶液；配制交联剂水溶液,滤膜过滤除菌,加入丝胶蛋白水溶液中混合均匀,摇床震荡20～120分钟,即可。该丝胶蛋白水凝胶具有优良的力学性能、多孔微观结构、形变记忆性且无菌,可作为药物或生长因子的载体,冻干得到的丝胶蛋白生物支架,可应用于组织损伤的修复和疾病的治疗。本发明的制备方法简单,成胶过程可控且成胶时间可通过调节丝胶蛋白的浓度而调控。(The invention discloses a sericin hydrogel. The sericin hydrogel is prepared by the reaction of a sericin aqueous solution and a cross-linking agent aqueous solution, and the preparation method comprises the following steps: cleaning, drying and crushing silk cocoons without fibroin to obtain silk cocoon powder, adding water, reacting at 100-180 ℃ for 0.5-10 hours, centrifuging, removing insoluble substances, and collecting a clear solution to obtain a sericin aqueous solution with the concentration of 2-18%; and (3) preparing a cross-linking agent aqueous solution, filtering and sterilizing by using a filter membrane, adding the cross-linking agent aqueous solution into a sericin aqueous solution, uniformly mixing, and shaking for 20-120 minutes by using a shaking table. The sericin hydrogel has excellent mechanical property, porous microstructure, deformation memory and asepsis, can be used as a carrier of a medicament or a growth factor, is a sericin biological scaffold obtained by freeze-drying, and can be applied to the repair of tissue injury and the treatment of diseases. The preparation method is simple, the gelling process is controllable, and the gelling time can be regulated and controlled by regulating the concentration of the sericin.)
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
丝胶蛋白是家蚕分泌的一种天然粘性蛋白，其由分子量为24～400kDa的多肽组成，含 有18种氨基酸。近年来人们研究发现，丝胶蛋白不仅没有免疫原性，而且拥有很多优良特性， 如可降解、抗菌、抗癌、抗氧化、抗紫外、抗凝血、抑制酪氨酶活性、亲水、保湿、以及促 进细胞粘附和增殖等；此外、丝胶蛋白拥有大量便于人们修饰或交联的活性基团，如氨基、 羟基、羧基等。目前，丝胶蛋白已成为一种倍受人们青睐的新型生物医用材料。
当前，丝胶蛋白已用于制备多种形式的组织工程材料，包括，丝胶微球、丝胶蛋白膜、 丝胶支架、丝胶蛋白水凝胶等，其中丝胶蛋白水凝胶尤其广受关注。目前，人们已采用多种 制备工艺并制备了具有不同特性的丝胶蛋白水凝胶，同时丝胶蛋白水凝胶已用于皮肤损伤， 神经损伤，肌肉损伤，骨损伤等多种组织损伤的修复与治疗研究，并显示出丝胶蛋白水凝胶 在组织工程再生医学领域具有巨大的潜在价值。
前期，针对丝胶蛋白水凝胶存在机械强度低、透明度差、荧光特性较弱、交联剂毒性以 及需要除菌且除菌过程会导致水凝胶结构和性能受到严重破坏等问题，采用超声诱导、自组 装和从蚕体中获取丝胶蛋白制备了多种丝胶蛋白水凝胶，在透明性、机械强度等方面在一定 程度上解决了上述问题。然而，在无菌丝胶蛋白水凝胶方面，虽然可以通过自组装可直接制 备出无菌丝胶蛋白水凝胶，但其力学性能很差，缺乏弹性且易碎。另一方面，长期以来研究 认为通过高温高压获得的丝胶蛋白水溶性高，难以通过直接交联制备纯丝胶蛋白水凝胶。另 一方面，目前基于从蚕茧中提取丝胶蛋白制备的纯丝胶蛋白水凝胶机械强度低，而虽然从蚕 体中提取的丝胶蛋白制备的水凝胶具有较强的机械强度，然而从蚕体中获取丝胶蛋白，费时 费力，操作也十分困难，难以进行规模化生产；同时蚕体中的丝胶蛋白和从蚕茧中分离出的 丝胶蛋白在结构和性能上也存在很大的差异，因此，即使基于蚕体中获得的丝胶蛋白和基于 蚕茧中分离的丝胶蛋白制备出具有同样机械强度的水凝胶，二者所制备的水凝胶在其他理化 性能和生物活性方面仍将存在很大差异。此外、家蚕饲养条件和吐丝境是否对蚕茧中丝胶蛋 白性能以及提取效率研究也鲜见报道。目前，基于从蚕茧中分离丝胶蛋白制备高机械强度纯 丝胶蛋白水凝胶仍面临着技术难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种丝胶蛋白水凝胶。具体技术方案如下：
一种丝胶蛋白水凝胶，所述丝胶蛋白水凝胶由丝胶蛋白水溶液和交联剂水溶液反应制得， 所述交联剂水溶液为京尼平、戊二醛、丙二醛、丁二醛、二羟甲基脲、氧化型谷光甘肽、双 (3,5-二溴水杨酸)富马酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二醇二缩水甘油醚、 转谷氨酰胺酶或H2O2水溶液中的任一种或其中的H2O2水溶液与另一种的混合；所述丝胶蛋 白水溶液的浓度为2～18wt％；所述戊二醛或丙二醛或丁二醛水溶液的浓度为0.1～50wt％， 用量为每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1～500μL；所述京尼平或二羟甲基脲、氧化型谷光甘肽、 双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二醇二缩水甘油 醚、转谷氨酰胺酶水溶液的浓度为0.1～4wt％，用量为每毫升丝胶蛋白水溶液中加入5～ 5000μL；所述H2O2水溶液的浓度为0.03～30wt％，用量为每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1～ 1000μL。用于制备丝胶蛋白水溶液的蚕茧是选用不含丝素的家蚕品种的蚕茧，在采用桑叶饲 养且吐丝环境温度为温度控制在20～30℃,湿度控制在30～70％。用于制备丝胶蛋白水凝胶 的蚕茧在温度20～30℃，湿度为30～70％环境下保存。
本发明的目的之二是提供所述丝胶蛋白水凝胶的制备方法。具体技术方案如下：
所述丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备不含丝素的家蚕蚕茧
选取不含丝素的家蚕品种，待蚕卵孵化后，全龄均采用新鲜的桑叶饲喂，待家蚕上簇开 始严格控制家蚕吐丝期间的环境参数：温度控制在20～30℃,湿度控制在30～70％；待吐丝 结束至制备丝胶蛋白水溶液前蚕茧均保持在温度20～30℃，湿度保持在30～70％；
(2)制备丝胶蛋白水溶液
将不含丝素的蚕茧洗净、干燥、粉碎得到蚕茧粉，将蚕茧粉加水置于100～180℃反应0.5～ 10小时，然后离心并去除不溶物质，收集澄清溶液，获得浓度为2～18wt％的丝胶蛋白水溶 液；
(3)制备丝胶蛋白水凝胶
配制交联剂水溶液，将其用滤膜过滤除菌，然后将其加入丝胶蛋白水溶液中混合均匀， 摇床震荡20～120分钟，即可制得所述丝胶蛋白水凝胶；
所述交联剂水溶液为京尼平、戊二醛、丙二醛、丁二醛、二羟甲基脲、氧化型谷光甘肽、 双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二醇二缩水甘油 醚、转谷氨酰胺酶或H2O2水溶液中的任一种或其中的H2O2水溶液与另一种的混合物；所述 戊二醛或丙二醛或丁二醛水溶液的浓度为0.1～50wt％，用量为每毫升丝胶蛋白水溶液中加入 1～500μL；所述京尼平或二羟甲基脲、氧化型谷光甘肽、双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯、1- 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二醇二缩水甘油醚、转谷氨酰胺酶水溶液的浓度 为0.1～4wt％，用量为每毫升丝胶蛋白水溶液中加入5～5000μL；所述H2O2水溶液的浓度为 0.03～30wt％，用量为每毫升丝胶蛋白水溶液中加入1～1000μL。
优选地，步骤(1)中，蚕茧粉碎后，每克蚕茧粉加水5～45mL。
优选地，步骤(1)中所述蚕茧粉的粒度≥50目。
优选地，步骤(1)中所述离心的转速为3000～10000rpm，离心的时间为5～30min。
优选地，步骤(2)所述滤膜的孔径≤0.22μm。
本发明的目的之三是提供所述丝胶蛋白水凝胶的应用。具体技术方案如下：
所述的丝胶蛋白水凝胶用于制备生物医用材料。
优选地，所述的丝胶蛋白水凝胶用于制备药物和生长因子载体。
优选地，所述的丝胶蛋白水凝胶用于制备细胞载体。
本发明的有益效果：
(1)本发明选取不含丝素的家蚕品种，全龄采用新鲜的桑叶饲喂，并严格控制家蚕吐丝 期间的环境参数(温度控制在20～30℃,湿度控制在30～70％)和蚕茧保存环境(温度20～ 30℃，湿度保持在30～70％)。为获得高提取效率和高溶解率的丝胶蛋白奠定了基础；
(1)本发明首次采用高温高压获得丝胶蛋白与交联剂作用(通过共价交联)，制备了具 有优良力学性能、多孔微观结构、形变记忆性的丝胶蛋白水凝胶，打破了长期以来人们认为 采用高温高压法提取的丝胶蛋白难以直接交联形成具有良好力学性能的水凝胶；
(2)由本发明所述方法制得的丝胶蛋白水凝胶制备方法简单，可直接实现无菌；成胶时 间可通过调节丝胶蛋白的浓度而调控；
(3)本发明采用不含丝素型蚕茧经磨粉后采用高温高压技术获得了提取效率高达96％ 的丝胶蛋白，同时直接获得了浓度高达18％(w/v)的丝胶蛋白溶液；本发明制备的纯丝胶水 凝胶的弹性模量可高达2560Kpa，远高于前期已报道的纯丝胶水凝胶的硬度。
(4)本发明的丝胶蛋白水凝胶可作为药物或生长因子的载体且具有良好的药物控释作 用；该丝胶蛋白水凝胶及其经过冻干得到的三维多孔丝胶蛋白生物支架，可作为细胞外基质 支持细胞生长和促进营养物质交换，可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
附图说明
图1是本发明所述的丝胶蛋白水凝胶制备流程图；
图2是实施例1中制得丝胶蛋白水凝胶的微观结构图；其中图2A为水凝胶在-20℃条件 下处理后冻干的样品照片，图2B为水凝胶在-80℃条件下处理后冻干的样品照片；图2C为 水凝胶在-196℃条件下处理后冻干的样品照片；
图3是实施例1中提取的丝胶蛋白的SDS-Page图；
图4是实施例1中不同浓度的丝胶蛋白在交联剂作用下的成胶时间曲线图；
图5是实施例1中丝胶蛋白水凝胶在不同pH条件下的吸水膨胀率(37℃)曲线图；
图6是实施例1中丝胶蛋白水凝胶在不同pH条件下的降解曲线图；
图7中图7A、图7B、图7C为实施例1丝胶蛋白成胶前后的红外光谱图；图D为实施 例1丝胶蛋白成胶前后的X衍射谱图；
图8是实施例1中丝胶蛋白水凝胶负载模式药物的控释曲线图；
图9是实施例1中丝胶蛋白水凝胶的力学性能图，其中图9A为拉伸前的力学性能图， 图9B为拉伸后的力学性能图，图9C为压缩前后的力学性能图,图9D为压缩前后的力学性 能图
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包含以下步骤：
一、蚕茧的获取
选用不含丝素的家蚕品种(由中国农业科学院蚕业研究所保存并向外商业化提供)选取 待蚕卵孵化后，全龄均采用新鲜的桑叶饲喂，待家蚕上簇前严格控制家蚕吐丝环境参数：温 度控制在20～30℃,湿度控制在30～70％。待吐丝结束至制备丝胶蛋白水溶液前蚕茧均保持 在温度20～30℃，湿度保持在30～70％环境中。蚕茧主要的化学成分为：家蚕丝胶蛋白。
二、丝胶的提取与水凝胶的制备
(1)取不含丝素的蚕茧用超纯水清洗后，然后置于洁净的托盘中，室温干燥，粉碎并过 100目筛获得蚕茧粉；
(2)称取步骤(1)中得到的蚕茧粉转移到蓝盖瓶中并加入适量的超纯水，使蚕茧粉的 质量与水的质量比为15：100。经充粉搅拌混匀后，将该蓝盖瓶置于120℃高压锅中高压0.5小 时，溶解丝胶蛋白；
(3)将步骤(2)得到的溶液转入离心管内6000rpm离心10分钟，去除不溶性物质，得到丝胶蛋白溶液；
(4)配制质量百分浓度为2％的京尼平水溶液，并经0.22μm的滤膜过滤除菌。
(5)将步骤(3)中获得的丝胶蛋白水溶液用超纯水将其质量百分浓度调整到14％时， 然后取适量该浓度的丝胶蛋白液与步骤(4)中的京尼平水溶液在室温下充分混匀；
(6)将步骤(5)中混匀的样品置入摇床上震荡，室温数十分钟即可成胶而获得丝胶蛋 白水凝胶。
三、检测
蛋白浓度检测采用丝胶蛋白水溶液干燥法；取1mL的丝胶蛋白水溶液转入洁净的器皿中 烘干。接下来用摄子将烘干的丝胶蛋白样品取下称重。根据质量体积比即可知丝胶蛋白溶液 的浓度。
蛋白质分子量检测采用SDS-PAGE方法。取20μL用于分子量检测，其余置于4℃冰箱保存备用。
四、结果分析
1、丝胶蛋白水凝胶的颜色
该丝胶蛋白水凝胶由丝胶蛋白与京尼平交联获得，如图1所示水凝胶的颜色呈深蓝色。
2、丝胶蛋白的分子量分布
将提取的丝胶蛋白利用SDS-Page凝胶电泳检测其分子量分布，结果如图2所示。获得的 丝胶蛋白分子量分布范围很广，从15kD至180kD以上均有分布,其中主要分布于40kD以 上。
3、丝胶水凝胶呈多孔结构
将丝胶蛋白水凝胶在-20℃，-80℃和-196℃下冷冻后再低温真空冻干，然后在扫描电子显 微镜下观察。如图2所示：冻干的丝胶蛋白水凝胶为三维多孔的支架。水凝胶在不同温度下 处理，获得的支架孔径大小有明显的差异，处理温度越低获得的水凝胶支架孔径越小。
4、丝胶蛋白水凝胶的孔隙率检测
将水凝胶在-80℃下冻干，将水凝胶样品放到体积为V1的超纯水中，此时样品与水的总 体积记为V2，然后将水凝胶样品取出，则剩余水的体积记为V3。则丝胶蛋白样品的孔隙率即 为(V2-V1)/(V3-V1)×100％。由浓度为10％(w/v)的丝胶蛋白制备的水凝胶的孔隙率为60％。
5、丝胶蛋白浓度对水凝胶成胶时间的影响
通过调控丝胶蛋白溶液的浓度，进而检测不同浓度丝胶蛋白的成胶时间，结果如图4所 示，丝胶蛋白的浓度越高其成胶时间越快。当丝胶蛋白浓度为2％(w/v)时，成胶时间为66 min，而当丝胶蛋白浓度为10％(w/v)时，丝胶蛋白水凝胶的成胶时间缩短到23min，结果 表明，通过调控丝胶蛋白的浓度可以调控成胶时间。
6、pH值对丝胶蛋白水凝胶的膨胀率的影响
将丝胶蛋白水凝胶冻干、称重、浸泡于三种不同pH值(pH 3.0、pH 7.4、pH 11.0)的PBS溶液中，在不同时间点，取出按以下公式测定其吸水膨胀率。(其中Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干重)
如图5所示：丝胶蛋白水凝胶在前18小时内，膨胀率迅速上升，在220小时后基本稳定。 在pH 3.0、pH 7.4和pH 11.0的环境下，最大的膨胀率分别为4、7和8倍。从图中可以看出 丝胶蛋白水凝胶的膨胀特性具有pH响应性。
7、丝胶蛋白水凝胶在不同pH环境下的降解速率
对于测试pH环境对降解的影响，将丝胶蛋白水凝胶浸泡于不同pH值(pH 3.0、pH7.4、 pH 11.0)的PBS溶液中，每日更换一次PBS溶液，在预设的时间点，取出、干燥、称重，结果见图6。
如图6所示：水凝胶降解具有pH响应性，其中在pH 11.0的碱性条件下降解速率最快， 3周累积降解率为45％，中性环境下(pH 7.4)次之，3周累积降解率为34％，在酸性条件下 (pH 3.0)降解速率最慢，3周降解率为24％。
8、丝胶蛋白水凝胶和丝胶蛋白的红外光谱和X衍射分析
利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus,Thermal Nicolet,USA)测定丝胶蛋白水凝胶在 4000–400cm-1的特征峰。
如图7A、7B、7C所示：丝胶蛋白交联前后其二级结构无明显变化；由图7D显示，交联前后丝胶蛋白的结晶度改变不大。
9、丝胶蛋白水凝胶用作药物或生长因子载体
选取辣根过氧化物酶(HRP)作为模式药物。首先配制2mg/ml辣根过氧化物酶溶液和 京尼平(1％，w/v)并过滤除菌，然后将丝胶蛋白溶液(12％，w/v)、京尼平(1.5％，w/v)和辣根过氧化物酶溶液(2mg/ml)以125：20：5进行充分混匀，在成胶前将混合溶液转移 到EP管中，每管的量为300μL，待成胶后加入1mL新鲜的PBS(pH7.4)，然后将样品37℃ 环境下。在预设的时间点检测从水凝胶中释放出来的HRP量。结果如图8所示，HRP在初 始阶段释放速度较快，随着时间的延长，药物释放速率越来越慢。其中在初始6小时、12小 时和24小时内药物释放量分别为23.38％、36.74％和47.45％，此后释放速率显著放缓，在192 小时内累积释放为58.65％的药物。结果表明，丝胶蛋白水凝胶能够维持药物释放的功能，可 以作为药物控释的载体。
10、丝胶蛋白水凝胶力学性能检测
在模具中制备厚为3mm，宽为10mm的长条状用于拉伸测试；制备直径为12mm的圆柱体用于压缩测试，测试在万能材料测试机上进行。结果如图9A-图9D所示，本发明采用高温高压制备的丝胶蛋白在交联剂的作用下制备的水凝胶具有优异的弹性，当丝胶蛋白浓度为 10％时，丝胶蛋白水凝胶拉伸率为17％时，仍不会破裂，弹性模量高达121KPa；当丝胶蛋白 深度为18％时，丝胶蛋白水凝胶的弹性模量达2560Kpa,远高于已报道的纯丝胶蛋白水凝胶 的相关参数，表明采用本发明的方法可以制备出高硬度的丝胶蛋白水凝胶。此外，从压缩结 果也可看出，该水凝胶压缩率超过50％时仍保持完好而无破损。结果表明丝胶蛋白水凝胶具 有优异的弹性和良好的机械性能。打破了长期以来人们认为由高温高压获得的丝胶蛋白难以 直接交联形成纯丝胶蛋白水凝胶的观点。此外，更令人惊奇的是所制备的丝胶蛋白水凝胶具 有优良的力学性能。
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