一种从丹凤牡丹籽粕中提取白藜芦醇的制备方法
阅读说明：本技术 一种从丹凤牡丹籽粕中提取白藜芦醇的制备方法 (Preparation method for extracting resveratrol from paeonia ostii seed meal ) 是由 王冰 韩刚启 王娟 刘建丽 李华敏 刘小倩 王子涵 李眉欣 李家文 张澳元 于 2020-11-24 设计创作，主要内容包括：一种从丹凤牡丹籽粕中提取白藜芦醇的制备方法,属于天然产物技术领域,其特征在于：以丹凤牡丹籽粕为原料、经过酶法提取、超声提取、萃取、利用高压制备液相色谱分离纯化,进而实现其产品回收率高、纯度好的基本工艺流程。通过本发明的技术条件制备牡丹籽壳白藜芦醇,工艺操作简单,易实施,具有制备过程简单、产率高、纯度高和原料价廉的特点,可以广泛应用于保健品、食品和护肤品领域,具有很好的商业前景。(A preparation method for extracting resveratrol from peony seed meal belongs to the technical field of natural products, and is characterized in that: the method takes the peony seed meal as a raw material, and realizes the basic process flow of high product recovery rate and good purity by enzymatic extraction, ultrasonic extraction, extraction and high-pressure preparative liquid chromatography separation and purification. The peony seed shell resveratrol prepared by the technical conditions has the characteristics of simple process operation, easy implementation, simple preparation process, high yield, high purity and low cost of raw materials, can be widely applied to the fields of health-care products, foods and skin care products, and has good commercial prospect.)
技术领域
本发明涉及一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，属于天然产物技术领域。
背景技术
牡丹(Paeonia sulfrulicosa Andr.)属于芍药科(Paeoniaeeae)、芍药属(Paeonia)多年生木本植物。牡丹根皮有很好的药用价值，在两千年以前，就记载于《本草经》。直到隋唐时期，牡丹则成为了名贵的观赏植物。牡丹籽为牡丹花结的种子，色黑、皮硬、味苦，不规则圆型，比黄豆稍大。牡丹籽在民间可以治疗腰腿疼痛，兴有消炎、抗氧化的作用。经中药化学和药理研究发现牡丹籽具有抗菌、消炎、镇静、降血糖、抗过敏及免疫调节等作用。牡丹籽粕为牡丹籽榨油后的固体渣粕，研究发现，牡丹籽粕中还含有大量的多酚类活性物质。其中包括白藜芦醇及其衍生物。白藜芦醇(Resveratrol)的化学名称为3，5，4′-三羟基芪(3，5，4′-trihydroxystilbene)，是一种非黄酮类多酚化合物，已知其天然植物来源包括葡萄、虎杖、牡丹、桑果和花生等。白藜芦醇通常与葡萄糖结合以糖苷的形式存在，少量以游离态的形式存在植物中。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，具有降低血脂、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。近年来，市场上出现了以白藜芦醇为活性成分的保健品。目前常用于白藜芦醇提取的方法有有机溶剂提取法、超声波提取法、微波辅助提取、超临界CO2萃取技术、酶解法等。研究表明，有机溶剂提取法操作简便易行、生产成本低，但溶剂消耗量较大、受热时间较长且提取效率不高。微波辅助提取法具有选择性高、操作时间短等优点，但微波辅助提取法具有明显的热效应且微波泄漏对工作者的身体危害较大。超临界CO2萃取法具有高效、耗能少、绿色环保等优势，但技术含量要求较高，设备运行成本大，故很难投入大工业化生产。目前已有将超声波用于牡丹籽粕中白黎芦醇的提取中，但其收率及产量的工业化程度仍不尽人意。同时酶法作为酚类物质提取的一种方法，具有产物回收率高、溶剂用量少、酶解法条件温和、不易造成有限资源浪费和污染的特点等优点。若将二者结合使用，超声波能更好地促进物料破碎，增大固相和液相之间的表面接触面积，同时酶可破坏细胞壁，减少传质阻力，从而有利于目标物的提取。近年来，随着牡丹籽油产业的兴起，产生了大量的油牡丹籽粕。油牡丹籽粕部分用作肥料，但是更多的是被丢弃，利用率极低，因而牡丹籽粕成为了主要的副产品。目前，大多数研究学者都在研究如何从葡萄和其他植物中提取白藜芦醇，但有关从凤丹牡丹籽中提取白藜芦醇的报道的少之又少，深度开发丰富并且廉价的油牡丹籽粕资源，获得高纯度的具有生物活性的白黎芦醇，不仅能够变废为宝，也具有很好的社会和经济效益。因此如何以丹凤牡丹籽粕为原料，提升其中白藜芦醇产品的回收率、增加白藜芦醇产品的纯度成为急需解决的一大难题，所以利用酶法提取、超声提取、萃取、利用高压制备液相色谱分离纯化，进而实现其产品回收率高、纯度好的基本工艺流程，发明一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法是必要的。
发明内容
为克服如何以丹凤牡丹籽粕为原料，提升其中白藜芦醇产品的回收率、增加白藜芦醇产品的纯度的难题，本发明提供了一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，该一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法提供了一种通过以丹凤牡丹籽粕为原料、经过酶法提取、超声提取、萃取、利用高压制备液相色谱分离纯化，进而实现其产品回收率高、纯度好的基本工艺流程。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法，其特征在于由以下步骤组成：
1.原料预处理：将丹凤牡丹籽粕干燥至水分10％以内粉碎，用20～60目的筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽粕细粉。
2.酶法提取：在牡丹籽粕细粉中，加入质量体积2～10倍的水，调pH至4.0～6.0，再添加0.1％～1％的纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶的一种或者多种酶，在40～60℃下低速搅拌1～5h；酶解。
3.超声提取：酶解完成后，向以上料液加入体积分数60％～90％的乙醇水溶液，两者的体积比为1∶5～1∶20(g∶mL)，然后用超声波处理，功率80～150W，1～2h，提取温度30～60℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收有机溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇苷的粗提物。
4.萃取：将白藜芦醇粗提物按质量体积比1∶10～1∶20(g∶mL)加入蒸馏水，50～60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1∶1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，用碱调其PH值为8.0～10.0，静置、过滤、减压浓缩至萃取液体积1/15～1/20，结晶出白藜芦醇苷粗提物。
5.水解富集：将所得白藜芦醇苷粗提物，按其体积配比加2％～10％的稀酸2～10倍量水解4～8h，水解富集后，冷却、静置24h，经过滤、洗酸，获白藜芦醇粗品。
6.分离纯化：将所得白藜芦醇粗品溶于乙酸乙酯中，利用高压制备液相色谱分离纯化，高压制备液相色谱分离条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(10μm，21.2mm×250mm)；流速：25mL/min；进样体积：6mL；流动相A：含0.5％(v/v)乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；等度洗脱：40％；紫外检测波长：308nm。收集白藜芦醇段洗脱液，再进行减压浓缩至小体积结晶、获得较高纯度的白藜芦醇粗品。
7.产品：将所获纯度较高的白藜芦醇粗品，用乙醇反复重结晶、获纯度大于99％的白色结晶状固态白藜芦醇产品。
本发明所提供的一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法的有益效果为：①所获纯度较高的白藜芦醇粗品用乙醇反复重结晶可获纯度大于99％的白色结晶状固态白藜芦醇产品；②本发明采用加酶提取法，可以有效破坏细胞壁，减少传质阻力，大大地提高提取得率；③本发明采用超声波提取、高压制备液相色谱分离纯化，可以有效地提高白藜芦醇的含量与纯度；④本发明工艺操作简单，易实施，纯度高。
附图说明
图1是一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法的丹凤牡丹籽壳白藜芦醇产品的液相色谱图。
图2是一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法的丹凤牡丹籽粕白藜芦醇产品的红外谱图。
图3是一种从丹凤牡丹籽壳中制备白藜芦醇的方法的丹凤牡丹籽粕白藜芦醇产品的热分析曲线。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1：
将丹凤牡丹籽粕粉碎，用20～60目筛子进行筛分，得到丹凤牡丹籽粕细粉；加入质量体积2～10倍的水，调pH至4.0～6.0，再添加0.1％～1％的纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶的一种或者多种酶，在40～60℃下低速搅拌1～5h；酶解。酶解完成后，向以上料液加入体积分数60％～90％的乙醇水溶液，两者的体积比为1∶5～1∶20(g∶mL)，然后用超声波处理，功率80～150W，1～2h，提取温度30～60℃，提取1～3次，过滤，合并滤液，滤液于40～60℃下减压蒸发，回收有机溶剂，浓缩物经真空干燥或冷冻干燥，得到白藜芦醇苷的粗提物；将白藜芦醇苷的粗提物按质量体积比1∶10～1∶20(g∶mL)加入蒸馏水，50～60℃搅拌溶解，过滤，滤液加入体积比1∶1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下减压浓缩得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯等体积萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，用碱调其PH值为8.0～10.0，静置、过滤、减压浓缩至萃取液体积1/15～1/20，结晶出白藜芦醇苷粗提物；按其体积配比加2％～10％的稀酸2～10倍量水解4～8h，水解富集后，冷却、静置24h，经过滤、洗酸获白藜芦醇粗品；将白藜芦醇粗品溶于乙酸乙酯中，利用高压制备液相色谱分离纯化，高压制备液相色谱分离条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(10μm，21.2mm×250mm)；流速：25mL/min；进样体积：6mL；流动相A：含0.5％(v/v)乙酸的水溶液；流动相B：甲醇；等度洗脱：40％；紫外检测波长：308nm。收集白藜芦醇段洗脱液，再进行减压浓缩至小体积结晶、获得较高纯度的白藜芦醇粗品；最后用乙醇反复重结晶、获纯度大于99％的白色结晶状固态白藜芦醇产品。
实施例2：
白藜芦醇色谱条件：色谱柱：Sinochrom C18 ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶水＝50∶50；检测波长：308nm；流速：0.8mL/min；进样体积：20μL；柱温：27℃。丹凤牡丹籽粕白藜芦醇产品的HPLC色谱图中只有一个能识别的色谱峰，其保留时间为7.893min，见附图1。在波长范围200～800nm内扫描，其中在最大吸收波长仅为219和308nm。经结构鉴定该化合物为白藜芦醇。其波谱特征如下：红外光谱：3250cm-1处有酚羟基吸收峰，965cm-1处有反式-C＝C-的特征吸收，均为白藜芦醇化学结构的特征吸收峰，并且具有1620cm-1，1540cm-1，1500cm-1等苯环的特征吸收峰。并与相关文献对照，符合白藜芦醇的红外色谱图。丹凤牡丹籽粕白藜芦醇产品的红外谱图见附图2。
实施例3：
对白色结晶状固态白藜芦醇产品的热稳定性进行研究，结果表明白藜芦醇在240℃以下具有良好的热稳定性，白藜芦醇在254.39℃附近有一明显的吸热峰，对应于药物的熔点。丹凤牡丹籽粕白藜芦醇产品的热分析曲线见附图3.
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。