具体实施方式

本发明涉及了一种可长期示踪的新型聚合物基近红外荧光探针，可以对肿瘤部位微酸环境响应从而实现特异性荧光激活和长期的荧光示踪。其中，设计并合成了基于苯氧羰基和羟基连接基元的自降解聚合物(SIPs)，聚合物的末端羟基与聚乙二醇酰基叠氮高效偶联得到两亲性嵌段共聚物。在其侧基通过高效的“巯基-马来酰亚胺”迈克尔加成反应修饰上近红外荧光团。这种两亲性嵌段自降解聚合物与近红外荧光团化学键结合后，在水溶液中会自组装形成纳米粒子，近红外荧光团被聚集在疏水内核从而导致荧光猝灭。在生理刺激(如pH小于7)条件下，聚合物自发串联解聚并释放荧光分子，从而产生荧光发射；降解产生的带有醌亚甲基的近红外荧光团会和周围蛋白表面的亲核基团高效偶联从而实现长期的荧光示踪。此外，近红外荧光团的光热-光动力学性能对肿瘤的协同治疗也具有重要的应用价值。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

作为本发明的一个方面，提供一种触发式自降解聚合物基近红外荧光探针，结构式如下：

其中，表示触发基元；表示近红外荧光团；聚合度n为5～10。

在本发明的实施例中，触发式自降解聚合物基近红外荧光探针为由亲水性聚乙二醇链段和侧链悬挂有近红外荧光团的疏水性酸响应型自降解聚合物链段构成的化学键合近红外荧光团的两亲性嵌段自降解聚合物，使用席夫碱(T_nbs)作为末端触发基元。可以对肿瘤部位微酸环境特异性响应实现荧光激活，且该探针在降解过程中产生的带有醌亚甲基的近红外荧光团可以高效捕获蛋白质表面亲核基团从而实现长期示踪效果。此外，近红外荧光团的光热-光动力学性能对肿瘤的协同治疗也具有重要的应用价值。

在本发明的实施例中，触发式自降解聚合物基近红外荧光探针中，其聚合度n太小，修饰的荧光团数量少，不能达到足够高的荧光强度；聚合度n太大，在水溶液中组装得到的纳米粒子太大，不容易进入肿瘤组织及被肿瘤细胞摄取，因此，适宜聚合度n为5～10。更为具体的，在本发明的实施例中，聚合度n可以为5、6、7、8、9或者10。

在本发明的实施例中，触发基元包括酸性响应触发基元；

在本发明的实施例中，酸性响应触发基元包括：

在本发明的实施例中，近红外荧光团包括吲哚箐绿或新吲哚箐绿(IR820)。

在本发明的实施例中，触发式自降解聚合物基近红外荧光探针包括由含有苯氧羰基和羟基的单体聚合得到的聚合物；含有苯氧羰基和羟基的单体的结构式如下：

在本发明的实施例中，含有苯氧羰基和羟基的单体，在进行聚合反应中，形成链末端包括异氰酸酯基和羟基的聚合物；利用具有末端羟基的触发基元与聚合物的异氰酸酯基键合，生成触发式自降解聚合物。该触发式自降解聚合物，能够在触发解离特定位点的保护基元后自发进行类似多米诺骨牌的串联解聚，同时释放小分子构筑基元。本发明设计的包含有触发式自降解聚合物的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针，降解产生带有醌亚甲基的近红外荧光团，能够和周围蛋白表面的亲核基团高效偶联从而实现长期的荧光示踪。

在本发明的实施例中，以近红外荧光团IR820为例的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的降解过程及带有醌亚甲基的近红外荧光团的具体结构说明如下反应式：

作为本发明的另一个方面，还提供一种如上的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将含有苯氧羰基和羟基的单体进行聚合反应，形成链末端包括异氰酸酯基和羟基的聚合物；

步骤2：将具有末端羟基的触发基元与聚合物反应，生成触发式自降解聚合物；

步骤3：将触发式自降解聚合物与聚乙二醇酰基叠氮偶联，得到两亲性嵌段自降解聚合物；

步骤4：将两亲性嵌段自降解聚合物与近红外荧光团进行反应，得到触发式自降解聚合物基近红外荧光探针。

在本发明的实施例中，步骤1中，聚合反应包括：

将含有苯氧羰基和羟基的单体溶于有机溶剂中，无氧气氛下，加入催化剂催化，70℃～90℃，反应2小时～5小时。

在本发明的实施例中，步骤1中的无氧气氛可以但不局限于为氮气气氛或者惰性气氛。

在本发明的实施例中，步骤1中的催化剂可以采用二月桂酸二丁基锡。

在本发明的实施例中，步骤1中的有机溶剂可以但并不局限于无水二甲基亚砜。

在本发明的实施例中，步骤1中的反应温度可以但不局限于70℃、75℃、80℃、85℃、90℃；步骤1中的反应时间可以但不局限于2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时。

在本发明的实施例中，步骤2具体包括：

将具有末端羟基的触发基元添加入步骤1得到的反应液中；

触发基元与含有苯氧羰基和羟基的单体按照等摩尔比例添加；

在70℃～90℃下，反应1小时～2小时；

反应结束后，甲醇沉降，N，N-二甲基甲酰胺溶解，重复沉降、溶解多次；将所得的固体干燥，得到固体的触发式自降解聚合物。

在本发明的实施例中，其步骤2中的反应温度可以与步骤1中的反应温度相同；其步骤2中的反应时间可以但不局限于1小时、1.5小时、2小时。

在本发明的实施例中，步骤3中，反应条件为：

将聚乙二醇酰基叠氮与触发式自降解聚合物以摩尔比2∶1～5∶1的比例关系添加；

在有机溶剂，无氧气氛下，加入催化剂催化，70℃～90℃，反应10小时～15小时；

反应结束后，甲醇沉降，N，N-二甲基甲酰胺溶解，重复沉降、溶解多次；将所得的固体干燥，得到固体的两亲性嵌段自降解聚合物。

在本发明的实施例中，步骤3中的聚乙二醇酰基叠氮与触发式自降解聚合物的摩尔比可以但不局限于2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。

在本发明的实施例中，步骤3中有机溶剂可以但并不局限于二甲基亚砜。

在本发明的实施例中，步骤3中无氧气氛可以为氮气气氛或者惰性气氛。

在本发明的实施例中，步骤3中催化剂可以但并不局限于二月桂酸二丁基锡。

在本发明的实施例中，步骤3中反应温度可以但不局限于70℃、75℃、80℃、85℃、90℃；其反应时间可以但不局限于10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时。

在本发明的实施例中，步骤4具体包括：

将两亲性嵌段自降解聚合物与近红外荧光团进行迈克尔加成反应；

进行自组装反应，得到纳米粒子的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针；

其中，迈克尔加成反应包括：

将近红外荧光团与两亲性嵌段自降解聚合物以摩尔比为1∶6～1∶10的比例关系添加；

在有机溶剂中，氮气氛围中，25℃～35℃，反应12～24小时；

反应结束后，甲醇沉降，N，N-二甲基甲酰胺溶解，重复沉降、溶解多次；将所得的固体干燥，得到固体的触发式自降解聚合物基近红外荧光聚合物；

在本发明的实施例中，步骤4中的有机溶剂可以但不局限于N，N-二甲基甲酰胺。

在本发明的实施例中，步骤4中的反应温度可以但不局限于25℃、30℃、35℃；其反应时间可以但不局限于12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时。

在本发明的实施例中，步骤4中的近红外荧光团与两亲性嵌段自降解聚合物的摩尔比可以但不局限于1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10。

其中，自组装反应包括：

将固体的触发式自降解聚合物基近红外荧光聚合物溶解在有机溶剂中，搅拌条件下加入水；

透析除去有机溶剂，得到纳米粒子的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针。

在本发明的实施例中，自组装反应的有机溶剂可以为但不局限于二甲基亚砜。

在本发明的实施例中，纳米粒子的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的浓度为0.1～1mg/mL。

更为具体的，该纳米粒子的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的浓度太高，得到的纳米粒子粒径分布不均一；浓度太低，其应用效果不明显。因此，适宜为0.1～1mg/mL；作为优选，浓度为0.2mg/mL。

作为本发明的再一个方面，还提供一种如上所述的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针在制备肿瘤细胞示踪剂中的应用。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但需要注意的是，下述的实施例仅用于说明本发明的技术方案，但本发明并不限于此。

实施例1

第一步，触发基元的引入可以通过在聚合过程中加入含醇羟基的触发基元来完成。为了更清楚地帮助理解，以下选用4-硝基亚苄基氨基苯甲醇保护触发式自降解聚合物(P1)为例说明。其反应通式如下所示：

所得聚合物的聚合度n在5～10之间。

制备方法：将含有苯氧羰基和羟基的单体(0.5g，0.94mmol)，二月桂酸二丁基锡(DBTL)(5.9mg，0.0094mmol)和无水二甲基亚砜(DMSO)(1mL)置于10ml反应瓶中，抽真空充氮气，使体系处于氮气氛围，然后85℃反应3h。加入4-硝基亚苄基氨基苯甲醇(0.24g，0.94mmol)，在85℃条件下继续反应1h。反应结束后，反应混合物在甲醇中沉降，在N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再沉降，再溶解，重复3次，所得的固体在真空干燥箱中干燥过夜，最终得到聚合度n为6的产物(0.38g，产率84％)，为淡黄色固体。

第二步，合成两亲性嵌段自降解聚合物，其反应通式如下式所示：

制备方法：将PEG-CON₃(0.35g，0.16mmol)，P1(0.2g，0.04mmol)，DBTL(0.5mg，0.0004mmol)和1mL的无水DMSO置于10mL的反应瓶中，抽真空充氮气，使体系处于氮气氛围，然后85℃反应15h。反应结束后，反应混合物在甲醇中沉降，N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再沉降，再溶解，重复3次，所得的固体在真空干燥箱中干燥过夜，最终得到产物(0.25g，产率82％)，为淡黄色固体。

第三步：通过巯基-双键迈克尔加成反应修饰近红外荧光分子，反应通式如下式所示：

制备方法：将聚合物P2(30mg，1eq)，IR820-SH(20mg，20eq)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置于10mL反应瓶中，抽真空充氮气，使反应体系处于氮气氛围，然后室温反应12h。反应结束后，将反应混合物在甲醇沉降，N，N-二甲基甲酰胺溶解，重复沉降、溶解3次；所得的固体在真空干燥箱中干燥过夜，最终得到产物(32mg，产率89％)，为墨绿色固体。

第四步：制备纳米粒子SIP-NPs

将聚合物P3(2mg)溶解在1mL DMSO中，然后在磁力搅拌条件下(500rpm)缓慢加水8mL，加水速度1mL/h。加水完毕后，使用截留分子量1，4000Da的透析袋在去离子水中透析除去体系中的有机溶剂，每隔6h换一次水，总共换3次，透析完毕后，将体系溶液(水)补充至10mL，最终所得组装体浓度为0.2mg/mL。

对本实施例1得到的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针以及各个步骤中的原料或中间体进行表征，得到如下结果。

(1)图1为第一步中参与反应的原料单体的核磁氢谱。如图1所示，单体中包含有的苯氧羰基、羟基以及需要与后续进行迈克尔加成反应的碳碳双键的官能团对应的氢的化学位移在核磁氢谱上都可以一一对应，由此可以证明单体结构的正确性。

(2)图2为两亲性嵌段自降解聚合物P2以及侧基后修饰近红外荧光团的两亲性嵌段自降解聚合物P3的核磁氢谱。如图2所示，通过P2与P3的核磁氢谱的对比看出，侧基后修饰的两亲性嵌段自降解聚合物P3新增的氢，由IR820近红外荧光分子贡献。由此证明两亲性嵌段自降解聚合物P2成功修饰上了IR820近红外荧光分子。

(3)图3为近红外荧光小分子IR820和侧基后修饰的两亲性嵌段自降解聚合物P3溶解在DMSO溶剂中以及P3在水溶液中组装为纳米粒子的紫外吸收光谱。如图3所示，IR820修饰到聚合物上之后的吸收峰和小分子IR820基本吻合，由此证明了IR820结构的完整性。此外，纳米粒子的吸收光谱出现了新的吸收峰，说明在纳米粒子状态，IR820近红外荧光团被包裹在疏水内核从而发生了聚集。

(4)图4和图5分别是本实施例1所制得的组装体的透射电子显微镜(TEM)表征图和光散射(ALV)表征图。

图4是实施例1中聚合度为6的样品TEM测试结果，可以看出所得到的纳米粒子是很均一的球形结构，直径约为70nm；图5是实施例1中聚合度为6的样品ALV测试结果，测得的纳米粒子的粒径为78nm(因为ALV的测试样品是溶液体系，而TEM的测试样品是干态，所以TEM测得的粒径通常会比ALV小一些)，与TEM结果相吻合。因此实施例1中的聚合度为6的样品得到了均一球形纳米粒子。

实施例2

本实施例2采用如实施例1的制备方法，其不同之处在于：

第一步的反应条件包括：将含有苯氧羰基和羟基的单体溶于有机溶剂中，惰性气体气氛下，加入二月桂酸二丁基锡催化，70℃，反应2.5小时。触发基元按照与苯氧羰基和羟基的单体等摩尔比例添加；90℃，反应1小时。

最终得到的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的聚合度为5。

该实施例2中最终得到触发式自降解聚合物基近红外荧光探针为粒径均一的球形纳米粒子。

实施例3

本实施例3采用如实施例1的制备方法，其不同之处在于：

第一步的反应条件包括：将含有苯氧羰基的单体溶于有机溶剂中，惰性气体气氛下，加入二月桂酸二丁基锡催化，90℃，反应4小时。触发基元按照与苯氧羰基和羟基的单体等摩尔比例添加；90℃，反应2小时。

最终得到的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的聚合度为10。

该实施例3中最终得到触发式自降解聚合物基近红外荧光探针为粒径均一的球形纳米粒子。

对比例1

本对比例1采用如实施例1的制备方法，其不同之处在于：

第一步的反应条件包括：将含有苯氧羰基的单体溶于有机溶剂中，惰性气体气氛下，加入二月桂酸二丁基锡催化，100℃，反应4小时。触发基元按照与苯氧羰基和羟基的单体等摩尔比例添加；100℃，反应2小时。

最终得到的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的聚合度为13。

图6是对比例1中聚合度为13的样品TEM测试结果，如图6所示，可以看出对比例1所得到的纳米粒子无稳定形貌，且粒径非常不均一。

以下应用实例1至应用实例5均以实施例1得到的触发式自降解聚合物基近红外探针纳米粒子为例进行应用说明。

应用实例1酸性pH触发纳米粒子降解并实现荧光激活

肿瘤组织处于微酸环境(pH为6.0～6.5)，而且在肿瘤细胞的溶酶体内部pH可达5.0。基于此，取1mL浓度为0.2mg/mL的实施例1的组装体于10mL样品瓶中，加入1mL磷酸缓冲溶液(pH＝6.0，200mM)，再加0.2mL浓度为100mM的谷胱甘肽(GSH)水溶液，然后将混合体系放在37℃条件下孵育，每隔固定时间点取样监测，通过紫外吸收光谱、凝胶渗透色谱测试触发后分子链水平的解聚，通过静态光散射(ALV)、纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight)、透射电子显微镜观察聚合物纳米粒子在触发解聚之后物性的变化以及荧光光谱跟踪聚合物降解及荧光发射情况。

如图7至图12所示，实验结果表明，触发式自降解聚合物基近红外荧光探针，在酸性pH条件下可以被触发并发生串联解聚，根据凝胶渗透色谱可以明显看到聚合物分子量在逐级递减(图7)；紫外吸收光谱也看到聚合物的最大吸收峰随着降解时间的延长在逐渐红移(图8)，由此验证了聚合物发生了分子链水平的解聚。随着聚合物降解成小分子碎片，体系中的牛血清白蛋白(BSA)捕捉降解产生的醌亚甲基而形成水溶性的小分子碎片，使得纳米粒子逐渐塌缩分解，ALV跟踪发现纳米粒子溶液的散射光强在逐渐降低，Nanosight的测试结果也进一步证明了纳米粒子的解聚(图9和图10)。透射电子显微镜跟踪发现降解体系中纳米粒子的数目在逐渐减少，直至最终几乎看不到有大的聚集体(图11a和图11b)。荧光光谱测试发现，纳米粒子状态没有荧光发射，而在微酸性环境触发聚合物降解的过程中，荧光发射强度逐渐增强(图12)。

综上所述，这些结果都充分的说明了本发明所涉及的触发式自降解聚合物基近红外荧光探针的可行性，可以特异性的对微酸环境响应，并实现近红外荧光发射激活。

应用实例2聚合物荧光探针纳米粒子在808nm激光辐照下的光热性能

配置IR820染料浓度为25μM的实施例1得到的组装体的纳米粒子水溶液，使用808nm激光器在不同功率下对样品辐照5min，使用数字温度监测器对体系温度进行实时的监测记录。实验结果表明，激光功率为3W/cm²时虽然体系温度可以升到最高，但是功率太强，染料漂白严重。1W/cm²的辐照功率既可以使体系温度升到60℃以上，而且不会导致染料漂白，因此后续选择1W/cm²的功率进行实验(图13)。确定辐照功率为1W/cm²之后，测试IR820染料浓度分别为5μM、10μM、25μM的实施例1得到的组装体的纳米粒子溶液的光热效果，发现随着浓度的增加，光热效果逐渐增强(图14)。由于温度达到60℃以上才会对肿瘤细胞具有很好的杀伤效果，因此IR820浓度为25μM为适宜的杀伤肿瘤细胞的浓度。

应用实例3聚合物荧光探针纳米粒子在降解前后的光动力学性能

染料分子在分散状态的光动力学性能优于聚集状态，因此降解前后的光动力学性能差异也能反映体系的降解程度。基于此，使用二氯二氢荧光素(DCFH)做为活性氧检测试剂，未降解体系pH始终保持为7.4，IR820浓度为15μM，DCFH浓度为10μM。降解体系pH调整为6.0，并加入BSA 30μM用于捕捉醌亚甲基，IR820浓度为15μM，DCFH浓度为10μM，该体系在25℃孵育24h后进行测试，使用808nm激光辐照，辐照功率为1W/cm²。测试结果发现，在降解体系DCFH的荧光强度相对未降解体系的荧光强度更强(图15)。同时也验证了该探针的优异光动力学性能可用于癌细胞的消除，因为非常有望联合光热效应用于肿瘤的治疗。

应用实例4聚合物荧光探针的细胞毒性及细胞水平上的光动力学性能

肿瘤细胞具有微酸的环境，因此该实施例1得到的探针在与肿瘤细胞共孵育之后会被触发解聚，再附加使用808nm激光辐照产生的单线态氧和光热效应即可很好的实现杀死癌细胞的效果。基于此，将4T1，3T3，LO2，HepG2和HeLa细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中，加入100mL完全细胞培养基(DMEM)，在37℃孵育24h，将培养基替换为新鲜的DMEM培养基，加入不同浓度的实施例1的组装体(按IR820的浓度计算分别为：40μM，20μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.3μM)，在37℃继续孵育24h，然后每孔加入溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)试剂(20μL，5mg/ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液)，继续孵育4h，移除培养基，再加入100μL的DMSO，轻摇15min，使用酶标仪记录每个孔在490nm的吸光度，实验结果如图16a和图16b，其中，图16a为五种不同细胞与不同浓度的组装体孵育，不使用808nm激光辐照的细胞存活率结果；图16b为五种不同细胞与不同浓度的组装体孵育并使用808nm激光辐照的细胞存活率结果。实验结果表明，该探针在808nm激光辐照前后对正常细胞几乎没有毒性，而对癌细胞表现出了突出的毒性，且光照后细胞毒性大大加强。

为了进一步验证光动力学性能在细胞毒性中的贡献，选用HeLa细胞作为模型，以每孔2X10⁵种在玻璃四孔板上，37℃孵育24h，去除培养基，其中两个孔加入含实施例1的组装体的培养基(IR820浓度为20μM)200μL，剩余两个孔加入完全DMEM培养基200μL，在37℃孵育4h，除去含组装体的培养基，将细胞用PBS洗涤3遍，加入200μL含2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)(5μM)的培养基，在37℃下继续孵育30min。移去培养基，用PBS洗2遍，再每孔加入100μL的PBS，用808nm激光器辐照5min(1W/cm²)，立即用共聚焦拍摄。其中，图17a为不加组装体但使用808nm激光辐照的共聚焦拍摄图，图17b为加组装体但不使用808nm激光辐照的共聚焦拍摄图，图17c为加组装体并且使用808nm激光辐照的共聚焦拍摄图。结果表明，在光照组细胞(SIP-NPs+light)显示出强烈的DCFH-DA荧光(图17c)，由此证明该探针在细胞水平上也具有优异的光动力学性能，可见光动力学效应在杀死肿瘤细胞过程中起到了重要的作用。

应用实例5荷瘤小鼠肿瘤部位特异性成像及长期示踪

活体实验是验证材料性能的决定性因素，基于此，取浓度为0.5mg/mL的实施例1的组装体200μL，尾静脉注射长有肿瘤的Balb/c(6-7周)裸鼠，采用小动物活体成像系统每隔固定时间点拍摄小鼠全身的荧光分布情况。如图18所示，结果显示，在尾静脉注射48h之后，几乎只能在肿瘤部位看到荧光，可以清晰的看到肿瘤的边界，因此非常有希望用于精准手术导航肿瘤切除。此外，最值得注意的是，肿瘤部位的荧光强度在第8天仍能保持在40％。这一结果验证了该聚合物探针降解产生的醌亚甲基确实在肿瘤组织内可以有效捕获周围蛋白表面亲核基团。

应用对比例1

取浓度为0.5mg/ml的小分子荧光团IR820 200μL，尾静脉注射长有肿瘤的Balb/c(6-7周)裸鼠，采用小动物活体成像系统每隔固定时间点拍摄小鼠全身的荧光分布情况。如图19所示，结果显示，小分子荧光团IR820在尾静脉注射后4h就完全被代谢干净，且在肿瘤部位几乎看不到荧光发射。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。