一种聚合物固定化木聚糖酶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种聚合物固定化木聚糖酶及其制备方法和应用 (Polymer immobilized xylanase, preparation method and application thereof ) 是由 王俊 胡艳 石灿阳 黄博荣 游帅 盛晟 吴福安 于 2020-12-10 设计创作，主要内容包括：一种聚合物固定化木聚糖酶及其制备方法和应用,将水溶性引发剂加入木聚糖酶缓冲液中,低温条件下使引发剂的羧基与木聚糖酶表面的氨基酸残基共价反应获得木聚糖酶大分子引发剂,温敏性聚合物的单体在催化剂的作用下在木聚糖酶大分子引发剂主链上聚合,获得聚合物固定化木聚糖酶。将聚合物固定化酶与纤维素酶协同水解桑皮、玉米芯、甘蔗渣、麸皮等农业废弃物获得低聚木糖。本发明选用具有良好生物相容性的聚合物,确保固定化酶维持较高的活力,同时温敏性聚合物增加了固定化酶的重复利用率。本发明可以解决农业废弃物资源利用的问题,有望产生良好的经济效应。(A polymer immobilized xylanase and a preparation method and application thereof are disclosed, wherein a water-soluble initiator is added into a xylanase buffer solution, carboxyl of the initiator and amino acid residues on the surface of the xylanase are subjected to covalent reaction at low temperature to obtain a xylanase macro-initiator, and monomers of a temperature-sensitive polymer are polymerized on the main chain of the xylanase macro-initiator under the action of a catalyst to obtain the polymer immobilized xylanase. And (3) carrying out synergistic hydrolysis on the polymer immobilized enzyme and cellulase on agricultural wastes such as mulberry bark, corncob, bagasse, bran and the like to obtain the xylo-oligosaccharide. The invention selects the polymer with good biocompatibility, ensures that the immobilized enzyme maintains higher activity, and simultaneously increases the repeated utilization rate of the immobilized enzyme by the temperature-sensitive polymer. The invention can solve the problem of resource utilization of agricultural wastes and is expected to produce good economic effect.)
技术领域
本发明属于固定化酶领域，具体涉及一种聚合物固定化木聚糖酶及其制备方法和应用。
背景技术
低聚木糖，又称木寡糖，是木聚糖的降解产物，由2-7个木糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中重要一员。低聚木糖，特别是木二糖和木三糖，增殖双歧杆菌的功效是其他功能性糖类的20倍，可有效刺激肠道蠕动并促进钙的吸收(Green Chemistry,2019,21:3213-3231)。同时，低聚木糖对人类白血病细胞具有毒害作用，对Ⅱ型糖尿病有益处，且可用作抗氧化剂(Bioresource Technology,2018,249:395-401)。因此，低聚木糖被认为是一种新兴的益生元，在食品、饲料等领域具有广阔的应用前景。
目前，低聚木糖的制备主要通过降解木聚糖获得，常用的方法有：水热法提取、酸法提取、酶解法提取。由于酸法提取过程中需要耐酸、耐腐蚀的设备，且产生的副产物中可能含有致癌的有毒物质，因此，酸法提取低聚木糖投资成本高，技术要求高，不适合大规模的工业化生产。而水热法提取需要耐高温设备，且产生的低聚木糖颜色深，给后续处理增大难度，因此，在工业生产上应用较少。木聚糖酶的酶解技术在生产低聚木糖中得到了广泛的认可。木聚糖酶是一类降解木聚糖的酶系，通过水解木糖分子β-1,4-糖苷键将木聚糖水解为木寡糖，包括木二糖、木三糖等低聚木糖以及少量阿拉伯糖(Carbohydrate Polymers,2019,207:34–43)。但是游离木聚糖酶在实际应用中存在一些问题如稳定性差、重复利用率低等，导致使用成本高。因此，木聚糖酶的应用研究中，固定化酶的研究是生物技术领域新兴的技术。酶的固定化是用物理或化学手段，将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。与游离酶相比，固定化酶不但可保持高效催化特性，而且储存稳定性高、可多次重复使用。这一系列优点，使得固定化酶在生物工程、化学、医学等领域得到迅速发展且符合可持续发展的战略要求。
目前，如何改进木聚糖酶的稳定性，提高酶活回收率，找到更好的固定化方法及载体是木聚糖酶固定化研究的趋势及方向。发明CN 106434620 A将木聚糖酶固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷改性Fe3O4@SiO2纳米颗粒载体表面，提高了木聚糖酶的温度耐受范围。发明CN107012137 A制备了海藻酸钠-壳聚糖固定化木聚糖酶，有效提高了木聚糖酶的温度稳定性及pH稳定性。还有报道制备了在磁性壳聚糖上接枝木聚糖酶，与游离酶相比，热稳定性、pH稳定性均有增加，且可重复使用三次(Applied Biochemistry and Biotechnology,2(188):395-409)。在已有的木聚糖酶固定化技术中，有载体的固定化木聚糖酶的报道已有很多，而未见无载体固定化木聚糖酶制备的报道。
聚合物固定化酶是近十年来发展迅速的一个活跃的研究领域。聚合物的连接可以为特定应用制备蛋白质，并赋予它们自身无法提供的特性(Biomaterials,2016,107:115-123)。共价连接的聚合物链对酶的影响范围从提高溶解性、增强生物相容性和稳定性到可调节的酶活性。有报道选用N-异丙基丙烯酰胺制备了聚合物固定化脂肪酶，脂肪酶在有机溶剂中稳定6天后活性仅损失了10％(Physical Chemistry Chemical Physics,2012,27(14):9594-9600)。还有报道选用丙烯酰胺制备了聚合物固定化辣根过氧化物酶，使其在55℃下的稳定性提高了90％(Acta Biomaterialia,2011,5(7):2131-2138)。因此，具有良好生物相容性的聚合物已成为无载体固定化酶技术最重要的代表，成为了研究的重点。本研究选用具有温敏性的聚合物制备聚合物固定化木聚糖酶，并将其应用于降解农业废弃物，以期提高资源利用率。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种聚合物固定化木聚糖酶及其制备方法和应用，以解决游离木聚糖酶在实际应用中稳定性差、易失活、不易扩散、重复使用性能低等问题。
技术方案：一种聚合物固定化木聚糖酶的制备方法，具体步骤为：将引发剂溶于pH8.0～9.0的木聚糖酶缓冲液中，所述引发剂为N-2溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸N’-氧琥珀酰亚胺酯，其与木聚糖酶上氨基的摩尔比为(3～10):1，在0～8℃下搅拌反应得到木聚糖酶大分子引发剂；将含有木聚糖酶大分子引发剂、聚合物单体的溶液与溶解催化剂1，催化剂2的水溶液同时在冰浴下用氮气吹扫以脱氧，将含有木聚糖酶大分子引发剂、聚合物单体的溶液转移到溶解催化剂的水溶液中，所述木聚糖酶大分子引发剂：聚合物单体：催化剂1：催化剂2的摩尔比为1:(50～500):1.3:1.9，在0～8℃下聚合5～30h得到聚合物固定化木聚糖酶溶液，所述催化剂1为：CuBr、CuCl或CuBr2，催化剂2为：Me6TREN、HMTETA、TPMA或bpy，透析去除未反应的单体，再将溶液减压干燥得到固定化木聚糖酶固体粉末。
上述步骤(1)中引发剂与木聚糖酶蛋白上氨基的摩尔比4：1，缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为8.5，反应温度为4℃。
上述步骤(1)中聚合物单体为：N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)，丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEA)或3-二甲氨基丙胺(DMAPA)。
上述方法制得的聚合物固定化木聚糖酶。
具体应用步骤为：将农业废弃物用0.1wt.％～15wt.％碱性溶液浸没，在60～90℃下处理12～36h，再将pH调节至中性，烘干；将预处理后的农业废弃物与缓冲液按固液比1:(2～15)混合，单位g/mL，缓冲液的pH为3.0～9.0，加入固定化木聚糖酶或其与纤维素酶的组合物，协同水解以获得低聚木糖，所述固定化木聚糖酶与纤维素酶的酶活力单位的比例为：1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1；将水解后的溶液离心，取上清液，将温度提高到50～60℃使固定化酶疏水析出，收集固定化酶。
上述碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钙或氨水。
上述农业废弃物为桑皮、桑枝、玉米芯、玉米秸秆、甘蔗渣或麸皮。
上述缓冲液的pH为5.0，农业废弃物与缓冲液按固液比1:15混合，单位g/mL。
上述固定化酶在55℃下收集。
有益效果：本发明通过引发剂共价连接木聚糖酶以获得木聚糖酶大分子引发剂，再将聚合物单体从大分子引发剂主链生长，获得聚合物固定化木聚糖酶。该方法制备得到的固定化木聚糖酶，固定化效率高，热稳定性及重复使用次数大大增加。而且，可与纤维素酶协同使用，大大提高农业废弃物中低聚木糖的产量。
附图说明
图1是实施例1中木聚糖酶固定化酶的示意图；
图2是木聚糖酶游离酶和固定化酶的温度稳定性曲线；
图3使木聚糖酶游离酶和固定化酶的pH稳定性曲线；
图4是聚合物固定化木聚糖酶的重复利用性能图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步解释说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本实施例中聚合物固定化木聚糖酶得率的计算方法为：
其中：m——聚合物固定化酶的质量(g)；
mXYL——木聚糖酶的质量(g)；
minitiator——引发剂的质量(g)。
实施例1
本实施例说明聚合物固定化木聚糖酶的制备方法。
称取20mg木聚糖酶溶于5mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.1mol/L，pH8.0)中，加入100mg引发剂(N-2溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸N′-氧琥珀酰亚胺酯)，在4℃下搅拌反应5h制得木聚糖酶大分子引发剂。将含有大分子引发剂、NIPAAm的A瓶与含有CuBr、Me6TREN及去离子水的B瓶同时在冰浴下用氮气吹扫以脱氧。将A瓶中的混合物转移到B瓶中，各组分摩尔比为大分子引发剂：NIPAAm：CuBr：Me6TREN＝1:100:1.3:1.9。在4℃下聚合12h得到固定化酶溶液。用10mmol缓冲液透析2天以去除未反应的单体，将溶液减压干燥得到固定化木聚糖酶固体粉末，聚合物固定化酶的得率为90％，聚合物固定化木聚糖酶的示意图如图1所示。
实施例2
本实施例说明聚合物固定化木聚糖酶的制备方法。
称取20mg木聚糖酶溶于5mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.1mol/L，pH8.5)中，加入100mg引发剂(N-2溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸N′-氧琥珀酰亚胺酯)，在4℃下搅拌反应3h制得木聚糖酶大分子引发剂。将含有大分子引发剂、NIPAAm的A瓶与含有CuBr、Me6TREN及去离子水的B瓶同时在冰浴下用氮气吹扫以脱氧。将A瓶中的混合物转移到B瓶中，各组分摩尔比为大分子引发剂：NIPAAm：CuBr：bpy＝1:200:1.3:1.9。在4℃下聚合15h得到固定化酶溶液。用10mmol缓冲液透析2天以去除未反应的单体，将溶液减压干燥得到固定化木聚糖酶固体粉末，聚合物固定化酶的得率为93％。
实施例3
本实施例说明聚合物固定化木聚糖酶的酶活力、热稳定性及重复利用性能的测定。
1、聚合物固定化木聚糖酶的酶活力测定方法：采用DNS测定木聚糖酶活力。取实施例1中制备的聚合物固定化酶经适当稀释后的酶液50μL加入到450μL底物榉木木聚糖中，50℃反应10min。加入750μL终止剂DNS，沸水中煮5min，在540nm波长下测定吸光值。
2、对聚合物固定化木聚糖酶的热稳定性进行研究：取游离木聚糖酶和实施例1制得聚合物固定化木聚糖酶，在不同温度(80、90℃)下分别处理2、5、10、20、30、60min，并迅速置于冰上，并在50℃，pH 4.5的条件下测定剩余酶活性，用来衡量聚合物固定前后木聚糖酶的热稳定性情况。做聚合物固定化木聚糖酶与游离酶的温度稳定性曲线，如图2所示。聚合物固定化木聚糖酶在90℃下的热稳定性提高了20％。
3、对聚合物固定化木聚糖酶的pH稳定性进行研究：取游离木聚糖酶和实施例1制得的聚合物固定化木聚糖酶，在37℃和不同pH值的缓冲液中孵育1h，在pH 4.5和50℃下测定剩余酶活性。做聚合物固定化木聚糖酶与游离酶的pH稳定性曲线，如图3所示。聚合物固定化木聚糖酶提高了木聚糖酶的pH耐受范围(pH2.0-8.0)。
4、对聚合物固定化木聚糖酶的重复利用性能进行研究：取木聚糖酶游离酶和实施例1制得的聚合物固定化木聚糖酶，测定酶活力，加入底物榉木木聚糖溶液中，反应10min，加入丙酮，离心分离后获得固定化酶与游离酶，第2次测定酶活力，如此重复操作，测定8次酶活力，以第1次测得的酶活力值为100％，做木聚糖酶的重复使用性能如图4所示。重复使用5次后，聚合物固定化木聚糖酶的活性仍可保持在60％以上。
实施例4
本实施例说明聚合物固定化木聚糖酶与纤维素酶协同处理桑皮生产低聚木糖。
用15wt.％的氢氧化钠溶液将桑皮浸没，在90℃下处理10h；再将pH调节至中性，70℃下烘干。取预处理后的桑皮2g，与30mL，pH 5.0的缓冲液混合，加入实施例1中制备的聚合物固定化木聚糖酶与纤维素酶，木聚糖酶：纤维素酶(U)＝50:50，0:100。20h后，纤维素酶单独处理的桑皮水解物中还原糖含量为4.83mg/mL，协同处理的桑皮水解物中还原糖的含量达9.13mg/mL，提高了1.9倍。
实施例5
本实施例说明聚合物固定化木聚糖酶与纤维素酶协同处理玉米芯生产低聚木糖。
用10wt.％的氢氧化钠溶液将桑皮浸没，在80℃下处理12h；再将pH调节至中性，70℃下烘干。取预处理后的桑皮2g，与30mL，pH 4.5的缓冲液混合，加入实施例1中制备的聚合物固定化木聚糖酶与纤维素酶，木聚糖酶：纤维素酶(U)＝60:40，0:100。20h后，纤维素酶单独处理的玉米芯水解物中还原糖含量为6.32mg/mL，协同处理的玉米芯水解物中还原糖的含量达15.74mg/mL，提高了2.5倍。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种负载有微生物的碳源缓释蜡及其制备方法和应用