氨基酸衍生物及其制备方法
阅读说明：本技术 氨基酸衍生物及其制备方法 (Amino acid derivatives and process for preparing the same ) 是由 谭忠平 裴湘尧 李耀豪 冯高超 蒋明兴 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氨基酸衍生物及其制备方法。其中该氨基酸衍生物由氨基酸和糖链通过连接基团连接得到,其中所述氨基酸包含-SH和/或-OH基团,所述糖链包含一个甘露糖或由两个以上甘露糖串联构成,所述连接基团含有S或O。本发明的方法可一步合成所需要的多糖化合物,不仅可以节约大量的人力和时间,使目的化合物的大量制备能够顺利、简洁、快速和高效地进行,而且提高了产物的合成产率,节省大量的合成原料,使生产成本大大降低,同时也有利于环保,进而突破氨基酸糖基化的研究和应用壁垒。(The invention discloses an amino acid derivative and a preparation method thereof. Wherein the amino acid derivative is obtained by linking an amino acid containing an-SH and/or-OH group to a sugar chain containing one mannose or consisting of two or more mannose in tandem via a linking group containing S or O. The method can synthesize the required polysaccharide compound in one step, not only can save a large amount of manpower and time, but also can smoothly, concisely, quickly and efficiently prepare a large amount of target compounds, improve the synthesis yield of products, save a large amount of synthesis raw materials, greatly reduce the production cost, and simultaneously is beneficial to environmental protection, thereby breaking through the research and application barriers of amino acid glycosylation.)
技术领域
本发明涉及糖基化蛋白质有机合成
技术领域
，具体涉及氨基酸衍生物及其制备方法，尤其涉及甘露糖糖基化氨基酸及其对映体、半对映体和含硫代糖苷键类似物的制备方法。背景技术
蛋白质侧链的氨基酸，主要是丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸上通过共价键连接上糖分子以后，就会形成糖基化的蛋白质，简称糖蛋白。糖基化是一种非常重要的蛋白翻译后修饰。糖基化修饰不但可以使蛋白质上带上不同的标记，还可以限制蛋白质局部构象的改变，增加蛋白质的稳定性、对底物结合的专一性以及功能的多样性。蛋白质上连接的糖还常常可以作为外源性受体的特异性配体，为各种病毒、细菌及寄生物所利用；蛋白质上连接的糖也可作为内源性受体的特异性配体，参与介导清除、周转及胞内穿行作用；另外，蛋白质上连接的糖在受精过程中也起着重要的作用等。
要想更好地了解蛋白质上的糖的具体作用，从而更好地利用糖蛋白或糖的类似物进行疾病治疗和诊断，需要通过有机合成的方法，制备具有高纯度的、在组成上均一的糖蛋白。这些合成的糖蛋白，可以含有天然的糖和氨基酸结构，也可以含有它们的对映结构或部分对映结构，或者改变很大的其它非天然结构。这些非天然的结构在糖基化蛋白质的研究和应用中具有重要的价值。然而，由于难于大量获得制备这些分子所必需的糖基化氨基酸，这些研究和应用一直推进的非常缓慢。
根据糖所连接的氨基酸的不同，糖基化氨基酸主要分为两种，第一种是通过丝氨酸和苏氨酸侧链羟基上的O原子与糖连接形成的O-连接的糖基化氨基酸。另一种是通过天冬氨酸侧链酰胺基上的N原子与糖连接形成的N-连接的糖基化氨基酸。
例如，在Sariya Talat等人通过上述O-糖基化，采用特定化合物与氨基酸相连后脱苄基的合成方法制备了具有真核蛋白多糖中的糖部分的O-糖基化苏氨酸(残基)(S.Talat,et al.Glycocony J.2011,28,537-555.)。再例如，在文献D.Varon,et al.AustJChem,2002,55,161-165.中，其通过连接甘露糖二糖和甘露糖单糖的方法获取甘露糖三糖后再进行一系列操作得到甘露糖三糖糖基化氨基酸。上述发表的文献在此通过引用整体并入本文。
至今，世界上对糖基化氨基酸合成优化，尤其是涉及对映体、半对映体和含硫代糖苷键类似物的研究报道还很少。在已有的少数报道里合成步骤也相对较多，且相对繁琐，产率偏低。同时，合成的产物也主要以结构相对简单的含有甘露糖单糖和二糖的糖基化丝氨酸、苏氨酸为主，另外也没有对映体、半对映体和含硫代糖苷键类似物的合成。因此，目前仍需要开发一种简单、快速、高效以及低成本的制备方法，以突破蛋白质糖基化的研究和应用壁垒。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种氨基酸衍生物及其制备方法。本发明人通过大量的研究发现，通过特定化合物的一步合成，能够得到制备所需的多糖化合物，并在氨基酸侧链和羧基不保护的情况下，一步连接得到目的产物。另外，本发明的制备方法得到的化合物产率和纯度较高，且基本不含杂质。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种氨基酸衍生物，其由氨基酸和糖链通过连接基团连接得到，其中所述氨基酸包含-SH和/或-OH基团，所述糖链包含一个甘露糖或由两个以上甘露糖串联构成，所述连接基团含有S或O。
根据本发明的氨基酸衍生物，优选地，所述氨基酸具有下式(I)所示的结构：
其中A为S或O，R为H或C1-C3烷基。
根据本发明的氨基酸衍生物，优选地，所述糖链由2-10个甘露糖串联构成。
根据本发明的氨基酸衍生物，优选地，所述氨基酸衍生物具有左旋和/或右旋异构体结构。
本发明的第二方面，提供一种氨基酸衍生物的制备方法，其至少包括以下步骤：
(1)使羟基保护且其中一个羟基被溴取代的甘露糖化合物II溶解于氯仿，与2,6-二甲基吡啶反应，得到含1,2-原酸酯的化合物III；
(2)加入引发剂使化合物III之间反应，得到由多个甘露糖构成的衍生物；
(3)用乙酰基替换步骤(2)产物中的甲基，得到乙酰化衍生物；
(4)使步骤(3)的产物与氨基酸反应，得到第一氨基酸衍生物，其中所述氨基酸包含-SH和/或-OH基团且氨基受保护。
根据本发明的第二方面所述的氨基酸衍生物的制备方法，优选地，进一步包括(5)使羟基保护的甘露糖化合物I与氨基酸反应，得到第二氨基酸衍生物的步骤，其中所述氨基酸包含-SH和/或-OH基团且氨基受保护。
根据本发明的第二方面所述的氨基酸衍生物的制备方法，优选地，在步骤(5)中，使羟基保护的化合物I在三氟化硼乙醚溶液中与Fmoc保护的氨基酸反应，一步得到化合物VI，反应溶剂为无水乙腈，反应温度为室温。
根据本发明的第二方面所述的氨基酸衍生物的制备方法，优选地，所述第一氨基酸衍生物中糖链包含两个以上甘露糖，所述第二氨基酸衍生物包含一个甘露糖。
根据本发明的第二方面所述的氨基酸衍生物的制备方法，优选地，步骤(2)中，化合物III在三氟甲磺酸三甲基硅酯促发反应下，一次性获得化合物IV、化合物VII、化合物X，反应溶剂为二氯甲烷，反应温度为-30℃至0℃，其中，化合物IV为两个甘露糖串联化合物，化合物VII为三个甘露糖串联化合物，化合物X为四个甘露糖串联化合物。
根据本发明的第二方面所述的氨基酸衍生物的制备方法，优选地，在步骤(4)中，使步骤(3)的产物在三氟化硼乙醚溶液中与Fmoc保护的氨基酸反应，一步得到第一氨基酸衍生物，反应溶剂为无水乙腈，反应温度为室温。
本发明的第三方面，提供根据本发明第一方面所述的氨基酸衍生物或根据第二方面提供的制备方法得到的氨基酸衍生物在糖基化蛋白质或糖肽中的应用。
本发明的第四方面，提供根据本发明第一方面所述的氨基酸衍生物或根据第二方面提供的制备方法得到的氨基酸衍生物在含糖基化蛋白质或糖肽药物中的应用。
本发明的合成路线和方法，不仅可以节约大量的人力和时间，使甘露糖糖基化氨基酸及其对映体、半对映体和含硫代糖苷键类似物的大量制备能顺利、简洁、快速和高效地进行，而且能够提高产物的合成产率，节省大量的合成原料，使生产成本降低，是目的化合物产物具有更高的产品性价比，同时也有利于环保。高的产品性价比更有利于科研工作者以它们为起始原料进行科学研究，进而突破蛋白质糖基化的研究和应用壁垒。
附图说明
图1为本发明目的化合物的合成路线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本领域技术人员可通过已知手段对本发明合成过程中得到的任何中间产物及目的化合物产物进行测定，测定方法包括但不限于高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)或气相色谱-质谱联用(GC-MS)法。并进一步通过例如1H、13C及多种二维核磁共振(NMR)技术进行制备过程中任意化合物的分子结构表征。
术语“氨基酸”指的是包括天然产生的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物。天然产生的氨基酸是指由遗传密码编码的那些氨基酸，以及经修饰得到的氨基酸，例如，修饰得到的氨基酸包括但不限于羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。合成的氨基酸指的是通过人工合成得到的具有基础氨基酸化学结构的氨基酸，即，结合氢的α碳、羧基、氨基和R基团的氨基酸。氨基酸类似物指的是具有与天然产生氨基酸相同基础化学结构的化合物，例如，高丝氨酸等。这样的类似物具有修饰的R基团或修饰的肽主链，但是保持与天然产生氨基酸相同的基础化学结构。本文所用的“氨基酸”指的是氨基酸的D-和/或L-异构体。
术语“对映体”，有时也称为对映异构体，是指互为实物与镜像而不可重叠的立体异构体，其具有旋光性，其中一个是左旋的，一个是右旋的，因此，本文中的对映异构体也称为旋光异构体。其中，用符号(+)表示右旋，(-)表示左旋。
术语“半对映体”指的是只有糖的部分是天然结构的对映体或只有氨基酸的部分是天然结构的对映体的分子。
术语“含硫代糖苷键类似物”指的是糖与氨基酸连接的氧原子被硫原子替代的分子。
术语“基团”是指化合物的任何部分。
除非另有说明，本文中所示的结构式中的构型、元素符号、短线、楔形实线和楔形虚线等具有本领域通常的定义。
[氨基酸衍生物]
本发明的“氨基酸衍生物”(本文有时也称为“糖基化氨基酸”)其由氨基酸和糖链通过连接基团连接得到，其中所述氨基酸包含-SH和/或-OH基团，所述糖链包含一个甘露糖或由两个以上甘露糖串联构成，所述连接基团含有S或O。
本文中，为了说明方法，将氨基酸衍生物分为第一氨基酸衍生物和第二氨基酸衍生物，其中第一氨基酸衍生物是指含有一个甘露糖残基的化合物，而第二氨基酸衍生物是指含有两个以上甘露糖残基的衍生物。其中两个以上甘露糖残基之间的连接方式不特别限定。在某些实施方案中，两个以上的甘露糖以串联方式连接，从而形成直链结构，并通过含S或O的连接基团与氨基酸连接。在某些实施方案中，两个以上甘露糖残基形成支链结构，并通过含一个S或O的连接基团与氨基酸连接。
优选地，所述氨基酸具有下式(I)所示的结构：
其中A为S或O，R为H或C1-C3烷基。还优选地，R为CH3。
本发明的糖链优选由2-10个甘露糖串联构成。进一步优选为由2-9个甘露糖串联构成。例如，由2、3、4、5、6、7、8或9个甘露糖串联构成。
[制备方法]
本发明的氨基酸衍生物的制备方法包括至少包括以下步骤。下述方法中，所用甘露糖原料包括但不限于D-(+)-甘露糖，L-(-)-甘露糖，所用氨基酸原料包括但不限于Fmoc-L-(-)-丝氨酸，Fmoc-D-(+)-丝氨酸，Fmoc-L-(-)-苏氨酸，Fmoc-D-(+)-苏氨酸。
在步骤(1)中，使羟基保护且其中一个羟基被溴取代的甘露糖化合物II溶解于氯仿，与2,6-二甲基吡啶反应，得到含1,2-原酸酯的化合物III。
其中，甘露糖化合物II可以通过甘露糖在适于反应的条件下与醋酸酐，并在碳酸氢钠参与下得到全乙酰基保护的化合物I甘露糖化合物I，然后与例如氢溴酸乙酸溶液室温反应，进而得到含溴甘露糖化合物II。这里适于反应的条件是指无水乙酸钠为催化剂，反应条件为100-120℃油浴。优选为101-119℃温度下油浴。还优选为105-112℃温度下油浴。氢溴酸乙酸的浓度为20-40％。优选22-38％，还优选为25-36％。
与2,6-二甲基吡啶进行室温反应时，优选是与2,6-二甲基吡啶的有机溶液反应，有机溶液包括但不限于甲醇、乙醇、乙醚等。
在步骤(2)中，加入引发剂使化合物III之间反应，得到由多个甘露糖构成的衍生物。示例性地，化合物III在三氟甲磺酸三甲基硅酯促发反应下，一次性获得可分离的化合物IV、化合物VII和/或化合物X。这里的反应溶剂为二氯甲烷，反应温度为-30℃至0℃。进一步优选地，反应温度为-20℃至-5℃。还优选地，反应温度为-15℃至-5℃。“可分离的”是指上述化合物的分离方法对于本领域技术人员是已知的。
在某些实施方案中，羟基保护的单个甘露糖可与氨基酸直接反应，得到第二氨基酸衍生物。此处的氨基酸包含-SH和/或-OH基团且氨基受保护。优选地，化合物I在三氟化硼乙醚溶液中与Fmoc保护的氨基酸反应，经一步得到甘露糖基化氨基酸，例如化合物VI，反应溶剂为无水乙腈，反应温度为室温。
在步骤(3)中，在适于反应的条件下用乙酰基替换步骤(2)产物中的甲基，得到乙酰化衍生物。这里的适于反应的条件是指在-5℃至5℃下与乙酸酐的酸溶液进行反应。这里的酸包括但不限于盐酸、硫酸等。优选为硫酸。进一步优选为98％的硫酸。这里的温度优选为-2℃至5℃，还优选为-2℃至1℃。
在步骤(4)中，使步骤(3)的产物与氨基酸反应，得到第一氨基酸衍生物，其中此处的氨基酸包含-SH和/或-OH基团且氨基受保护。优选地，使步骤(3)的产物在三氟化硼乙醚溶液中与Fmoc保护的氨基酸反应，一步得到第一氨基酸衍生物，反应溶剂为无水乙腈，反应温度为室温。
需要说明的是，虽然本文单独对第一氨基酸衍生物和第二氨基酸衍生物的产生分别进行了说明，但是本领域技术人员容易理解，用于产生第一氨基酸衍生物的步骤和用于产生第二氨基酸衍生物的步骤两者可以在同一反应体系中同时进行或顺序进行，也可以在不同反应体系中同时进行或顺序进行。
本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在本发明制备方法步骤(1)-(4)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如纯化或水洗涤以提高产率的步骤，以及进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
实施例1
本实施例为示例性氨基酸衍生物的制备例，其合成工艺如图1所示，包括以下步骤：
1.化合物I的合成
以D-(+)-甘露糖(40g,222mmol)为原料，将其溶于醋酸酐(400mL)，然后加入无水乙酸钠(24g)作催化剂。反应在110℃油浴中搅拌，使用TLC板监测反应进行的程度。2小时后，加入冰的饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，然后通过萃取，干燥和浓缩有机相，得到化合物I，产率为98％。
2.化合物II的合成
向化合物I(86g,222mmol)中加入33％氢溴酸乙酸溶液(520mL)，室温搅拌，使用TLC板监测反应进行的程度。30分钟后，反应液用二氯甲烷稀释(5L)，萃取。合并的有机相用冰水洗涤(每次约200mL)，直至中性；有机相干燥、浓缩后得到化合物II的粗品，无需纯化。
3.化合物III的合成
化合物II(88g,214mmol)的粗品用氯仿(600mL)溶解，向溶液中缓慢加入2,6-Lutidine的甲醇溶液(v/v＝1/10,660mL)，反应在室温搅拌过夜。使用TLC板监测反应，在确认反应完成后，先加入二氯甲烷对反应进行稀释，再用冰的3％碳酸氢钠溶液洗涤一次，有机相经干燥、浓缩后，向浓缩物中加入石油醚，将析出的白色晶状物质过滤，洗涤，二氯甲烷溶解后使用柱色谱纯化，得到化合物III，产率约为64％。
4.化合物IV，化合物VII，化合物X的合成
在氮气保护下，将化合物III(30g,82.845mmol)溶于无水二氯甲烷(1050mL)中，溶液冷却至-30℃后，向溶液中逐滴加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(45mL,248.536mmol)触发反应，滴加完毕后继续在-30℃反应15min，使用TLC板监测反应完后，反应液用二氯甲烷(500mL)稀释，用冰的饱和碳酸氢钠溶液(500mL)淬灭，在萃取，干燥和浓缩后，将粗产物用柱色谱纯化，得到化合物IV，产率约为36％，化合物VII，产率约为16％，化合物X，产率约为8％。
5.化合物VI的合成
在氮气保护下，将化合物I(15g，38.428mmol)和Fmoc-Ser-OH(15.1g,46.114mmol)或Fmoc-Thr-OH(15.6g,46.114mmol)溶解于无水乙腈(460mL)，然后向溶液中缓慢滴加三氟化硼乙醚(14mL,115.284mmol)，室温搅拌17h，使用TLC板监测反应完成后，旋转蒸发除去乙腈，然后加入乙酸乙酯(500mL)，用水对有机相进行多次萃取，得到的有机相经干燥，浓缩后，将粗产物用柱色谱纯化，得到化合物VI。当R＝H时，产率约为29％；R＝CH3时，产率为27％。
6.化合物IX的合成
化合物IV(10g,15.371mmol)溶于乙酸酐(150mL)中，然后将溶液冷却至0℃，向其中缓慢滴加溶于乙酸酐(10mL)的98％硫酸(0.5mL)的混合物,0℃搅拌1小时，使用TLC板监测反应完全后，先加入二氯甲烷稀释，然后加入冰的饱和碳酸氢钠溶液不停搅拌至中性，萃取，干燥，浓缩后，用柱色谱进行纯化，得到化合物V(9.1g,88％)。
在氮气保护及室温环境下，将化合物V(12g,17.684mmol)和Fmoc-Ser-OH(8.683g,26.526mmol)或Fmoc-Thr-OH(9.05g,26.526mmol)溶于无水乙腈(400mL)，向溶液中缓慢滴加三氟化硼乙醚(6.547mL,53.051mmol)，使用TLC板监测反应。反应完成后，用乙酸乙酯(400mL)对反应体系进行稀释，然后用水洗涤，有机相经干燥，浓缩获得粗产物。粗产物经柱色谱纯化后，得到化合物IX，当R＝H时，产率约为39％；R＝CH3时，产率为44％。
7.化合物XII的合成
化合物VII(5g,5.33mmol)溶于乙酸酐(60mL)，溶液冷却至0℃后，向溶液中缓慢滴加溶于乙酸酐(10mL)的98％硫酸(0.2mL)形成的混合物。0℃搅拌1小时，使用TLC板监测反应完全后，用二氯甲烷(300mL)对反应体系进行稀释，然后用少量的加冰的碳酸氢钠饱和溶液对稀释后的反应体系进行多次的处理，在萃取完成后，有机相经干燥，浓缩和柱色谱纯化，得到VIII(5.1g,99％)。
在氮气保护及室温环境下，将化合物VIII(5g,5.171mmol)和Fmoc-Ser-OH(2.539g,7.757mmol)或Fmoc-Thr-OH(2.65g,7.757mmol)溶于无水乙腈(150mL)中，向形成的溶液中缓慢滴加三氟化硼乙醚(2.2g,15.514mmol)，使用TLC板监测反应。在反应结束后，加入乙酸乙酯(1000mL)，然后用水洗涤，有机相经干燥，浓缩后，粗产物用柱色谱纯化，得到化合物XII，当R＝H时，产率约为38％；R＝CH3时，产率为48％。
8.化合物XIII的合成
化合物X溶于乙酸酐中，将形成的溶液冷却至0℃，向该溶液中缓慢滴加乙酸酐和98％的硫酸形成的混合物，使用TLC板监测反应。1小时后，反应体系用二氯甲烷稀释，然后使用少量加冰的饱和碳酸氢钠溶液多次洗涤有机相。有机相经干燥，浓缩后，粗产品用柱色谱进行纯化，得到XI。
在氮气保护下，将化合物XI和Fmoc-Ser-OH或Fmoc-Thr-OH溶于无水乙腈，向形成的溶液中缓慢滴加三氟化硼乙醚，使用TLC板监测反应。反应结束后，反应体系中加入乙酸乙酯对其进行稀释，稀释后的体系用水洗涤，有机相经干燥，浓缩后，得到粗产物。粗产物用柱色谱进行纯化，得到化合物XIII，当R＝H时，产率约为45％；R＝CH3时，产率为50％。
9.化合物XXVII的合成
在氮气保护下，将化合物I(682mg,1.75mmol)和Fmoc-Cys-OH(900mg,2.62mmol)溶于无水乙腈(35mL)，向形成的溶液中缓慢滴加三氟化硼乙醚(0.81ml,5.25mmol)，在氮气保护下搅拌28h，使用TLC板监测反应。反应结束后，反应体系中加入乙酸乙酯对其进行稀释，稀释后的体系用水洗涤，有机相经干燥，浓缩后，得到粗产物。粗产物用柱色谱进行纯化，得到化合物XXVII，产率为34％。
10.化合物XXVIII的合成
在氮气保护下，将化合物V(678mg,1.0mmol)和Fmoc-Cys-OH(514mg,1.5mmol)溶于无水乙腈(20mL)，向形成的溶液中缓慢滴加三氟化硼乙醚(0.46mL,3.0mmol)，在氮气保护下搅拌19h，使用TLC板监测反应。反应结束后，反应体系中加入乙酸乙酯对其进行稀释，稀释后的体系用水洗涤，有机相经干燥，浓缩后，得到粗产物。粗产物用柱色谱进行纯化，得到化合物XXVIII，产率为43％。
实施例2
本实施例为实施例1制备的分子结构表征，实验结果采用核磁共振氢谱测定，具体如下：
化合物I:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.08(d,J＝2.0Hz,1H),5.36–5.32(m,2H),5.26(t,J＝2.3Hz,1H),4.29(td,J＝12.7,5.1Hz,1H),4.19–4.00(m,2H),2.22(s,3H,OAc),2.17(d,J＝4.0Hz,3H,OAc),2.09(s,3H,OAc),2.05(s,3H,OAc),2.00(s,3H,OAc).ESI-MS:Calc.for C16H22O11:390.1162.Found:429.08[M+K]+,413.11[M+Na]+.化合物II:1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.29(d,J＝1.6Hz,1H),5.72(dd,J＝10.2,3.4Hz,1H),5.45(dd,J＝3.4,1.7Hz,1H),5.37(t,J＝10.2Hz,1H),4.33(dd,J＝12.5,5.0Hz,1H),4.22(ddd,J＝10.3,5.1,2.2Hz,1H),4.14(dd,J＝12.5,2.3Hz,1H),2.17(s,3H,OAc),2.10(s,3H,OAc),2.07(s,3H,OAc),2.01(s,3H,OAc).
化合物III:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.49(d,J＝2.6Hz,1H),5.29(t,J＝9.7Hz,1H),5.14(dd,J＝9.9,4.0Hz,1H),4.61(dd,J＝4.1,2.6Hz,1H),4.23(dd,J＝12.2,5.0Hz,1H),4.14(dd,J＝12.1,2.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝9.5,4.9,2.7Hz,1H),3.27(s,3H,OMe),2.12(s,3H,OAc),2.07(s,3H,OAc),2.05(s,3H,OAc),1.74(s,3H,OMe).ESI-MS:Calc.for C15H22O10:362.1213.Found:385.11[M+Na]+.
化合物IV:1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.37(dd,J3c,4c＝10.1,J2c,3c＝3.2Hz,1H,H-3c),5.33–5.21(m,6H,H-2c,H-3a,H-3b,H-4a,H-4b,H-4c),5.09(d,J1b,2b＝2.0Hz,1H,H-1b),4.93(d,J1c,2c＝1.8Hz,1H,H-1c),4.85(d,J1a,2a＝2.0Hz,1H,H-1a),4.22–4.06(9H,m,H-2b,H-5b,H-5c,H-6a,H-6'a,H-6b,H-6'b,H-6c,H-6'c),4.04-3.94(dd,1H,H-2a),3.93-3.86(ddd,J4a,5a＝9.6Hz,J5a,6a＝4.5Hz,J5a,6'a＝2.4Hz,1H,H-5a),3.40(s,3H,OMe).ESI-MS:Calc.for C27H38O18:650.2058.Found:689.17[M+K]+,673.20[M+Na]+,651.21[M+H]+.
化合物VII:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.38(dd,J＝10.0,3.4Hz,1H),5.35–5.23(m,6H),5.10(d,J＝2.1Hz,1H),4.94(d,J＝1.9Hz,1H),4.85(d,J＝2.1Hz,1H),4.27–4.07(m,7H),4.02(d,J＝2.4Hz,1H),3.90(ddd,J＝7.3,4.5,2.3Hz,1H),3.41(s,2H),2.15(s,3H,OAc),2.13(s,3H,OAc),2.12(s,3H,OAc),2.08(s,3H,OAc),2.06(s,3H,OAc),2.05(s,3H,OAc),2.03(d,J＝1.1Hz,6H,OAc*2),2.02(s,3H,OAc),2.00(s,3H,OAc),1.64(s,3H,OMe).ESI-MS:Calc.for C39H54O26:938.2903.Found:977.25[M+K]+,961.28[M+Na]+,939.30[M+H]+.
化合物V:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.23(d,J＝2.2Hz,1H),5.46–5.37(m,2H),5.31–5.22(m,3H),4.94(d,J＝1.9Hz,1H),4.27–4.09(m,5H),4.06–3.97(m,2H),2.14(s,6H,OAc*2),2.13(s,3H,OAc),2.09(s,3H,OAc),2.08(s,3H,OAc),2.03(s,6H,OAc*2),2.00(s,3H,OAc).ESI-MS:Calc.for C28H38O19:678.2007.Found:717.16[M+K]+,701.19[M+Na]+.
化合物VIII:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.23(d,J＝2.4Hz,1H),5.37(d,J＝9.9Hz,1H),5.34–5.28(m,3H),5.28–5.24(m,2H),5.12(d,J＝2.2Hz,1H),4.93(d,J＝1.9Hz,1H),4.27–4.16(m,3H),4.12(dtd,J＝9.6,5.3,4.7,2.7Hz,5H),4.06(t,J＝2.8Hz,1H),4.01(ddd,J＝9.8,4.1,2.4Hz,1H),2.14(d,J＝1.5Hz,6H),2.12(s,3H),2.11(s,3H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.04(s,3H),2.04–2.02(m,9H),1.99(s,3H),1.72(s,2H).ESI-MS:Calc.for C40H54O27:966.2853.Found:1005.25[M+K]+,989.27[M+Na]+,967.29[M+H]+.
化合物X:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.44–5.22(m,10H),5.13(d,J＝2.2Hz,1H),5.07(d,J＝2.4Hz,1H),4.96(d,J＝1.9Hz,1H),4.86(d,J＝2.2Hz,1H),4.27–4.01(m,13H),3.90(ddd,J＝9.7,4.5,2.4Hz,1H),2.15(s,3H),2.12(s,3H),2.11(s,3H),2.11(s,3H),2.08(d,J＝0.9Hz,6H),2.06(s,6H),2.03(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.68(s,3H).ESI-MS:Calc.for C51H70O34:1226.3749.Found:1265.34[M+K]+,1249.36[M+Na]+,1227.38[M+H]+.
化合物VI-Ser:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.75(d,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),7.61(t,J＝8.2Hz,2H,H-Fmoc),7.38(t,J＝7.3Hz,2H,H-Fmoc),7.29(t,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),6.55(d,J＝8.3Hz,1H,NH),5.45(dd,J＝9.9,3.5Hz,1H,H-3),5.31–5.20(m,2H,H-2,H-4),4.86(d,J＝1.6Hz,1H,H-1),4.70(m,1H,H-α),4.37(m,2H,CH2-Fmoc),4.23(m,2H,CH-Fmoc,H-6),4.16–4.00(m,4H,H-5,H-6,CH2-β),2.15,2.05,2.01,1.96(4s,each 3H,OAc).ESI-MS:Calc.for C32H35NO14:657.2058.Found:696.17[M+K]+,680.19[M+Na]+,658.21[M+H]+.
化合物IX-Ser:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.75(d,J＝7.6Hz,2H,H-Fmoc),7.67-7.57(d,2H,H-Fmoc),7.38(t,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),7.30(t,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),6.19(d,J＝8.2Hz,1H,H-NH),5.38(dd,J＝10.0,3.4Hz,1H,H-3'),5.34-5.21(m,4H,H-3,H-4,H-4',H-2'),4.97(d,J＝2.5Hz,1H,H-1),4.92(d,J＝2.0Hz,1H,H-1'),4.60(d,J＝8.2Hz,1H,H-α),4.46-3.95(m,12H，CH2-Fmoc,H-6,H-6,CH-Fmoc,H-6',H-6',H-5',CH2-β,H-2,H-5)2.13(s,3H,OAc),2.10(s,3H,OAc),2.10(s,3H,OAc),2.08(s,3H,OAc),2.04(s,3H,OAc),2.01(s,3H,OAc),1.98(s,3H,OAc).ESI-MS:Calc.for C44H51NO22:954.2903.Found:984.25[M+K]+,968.28[M+Na]+,946.30[M+H]+.
化合物XII-Ser:1H NMR(500MHz,Acetone-d6)δ7.86(d,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),7.73(d,J＝7.4Hz,2H,H-Fmoc),7.47-7.39(t,J＝7.4Hz,2H,H-Fmoc),7.34(m,2H,H-Fmoc),7.11(d,J＝8.4Hz,1H,NH),5.41-5.23(m,8H,H-1,H-2”,H-3,H-3',H-3”,H-4,H-4',H-4”),5.18(d,J＝2.0Hz,1H,H-1'),5.15(d,J＝1.9Hz,1H,H-1”),4.59(m,1H,H-α),4.36(m,2H,CH2-Fmoc),4.29-4.10(m,13H,H-2',H-5,H-5',H-5”,H-6,H-6',H-6”,CH2-β,CH-Fmoc),4.08-4.03(m,1H,H-2),2.11,2.09,2.07,2.03,2.03,2.02,2.01,1.97,1.96(9s,30H,CH3-Ac).ESI-MS:Calc.for C56H67NO30:1233.3748.
Found:1272.34[M+K]+,1256.36[M+Na]+,1234.38[M+H]+.
化合物VI-Thr:1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.90(d,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),7.76(d,J＝6.9Hz,2H,H-Fmoc),7.40-7.46(m,2H,H-Fmoc),7.31-7.37(m,2H,H-Fmoc),5.29(dd,J＝9.9,3.6Hz,1H,H-3),5.05(dd,J＝3.9,1.8Hz,1H,H-2),5.04(t,J＝9.9,1H,H-4),4.97(d,J＝1.5Hz,1H,H-1),4.22-4.32(m,4H,CH-β,CH-Fmoc,CH2-Fmoc)4.02-4.20(m,4H,H-5,H-6,H-6,H-α),2.08(s,3H,OAc),2.03(s,3H,OAc),2.01(s,3H,OAc),1.92(s,3H,OAc),1.24(d,J＝6.3Hz,3H,CH3-γ).ESI-MS:Calc.for C33H37NO14:671.2214.Found:710.18[M+K]+,694.21[M+Na]+,672.23[M+H]+.
化合物IX-Thr:1H NMR(500MHz,Acetone-d6)δ7.88(d,J＝7.6Hz,2H,H-Fmoc),7.74(t,2H,H-Fmoc),7.43(t,2H,H-Fmoc),7.35(m,2H,H-Fmoc),7.07(d,J＝9.5Hz,1H,NH),5.38(dd,J＝10.2,3.3Hz,1H,H-3),5.34–5.27(m,4H,H-2',H-3',H-4,H-4'),5.24(d,J＝1.6Hz,1H,H-1),5.02(d,J＝1.6Hz,1H,H-1'),4.53(m,1H,CH-β),4.47-4.33(m,3H,H-α,CH2-Fmoc),4.27(t,J＝7.0Hz,1H,CH-Fmoc),4.24-4.06(m,7H,H-2,H-5,H-5',H-6,H-6'),2.12-1.97(21H,OAc),1.44(d,J＝6.4Hz,3H,CH3).ESI-MS:Calc.for C33H37NO14:959.3059.Found:998.27[M+K]+,982.30[M+Na]+,960.31[M+H]+.
化合物XII-Thr:1H NMR(500MHz,Acetone-d6)δ7.88(d,J＝7.6Hz,2H,H-Fmoc),7.73(t,J＝6.5Hz,2H,H-Fmoc),7.43(t,J＝7.6Hz,2H,H-Fmoc),7.36(t,J＝7.5Hz,2H,H-Fmoc),5.47–5.24(m,9H,H-1,H-1',H-2”,H-3,H-3',H-3”,H-4,H-4',H-4”),5.22(s,1H,NH),5.19(d,J＝1.2Hz,1H,H-1”),4.58–4.50(m,1H,H-β),4.46–4.07(m,15H,H-2,H-2',H-5,H-5',H-5”,H-6,H-6',H-6”,H-α,CH-Fmoc,CH2-Fmoc),2.14–1.97(m,30H,OAc),1.43(d,J＝6.2Hz,3H,CH3).ESI-MS:Calc.for C57H69NO22:1247.39.Found:1270.63[M+Na]+.
化合物XXVII:1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ2.00,2.05,2.06,and2.15(4s,each 3H,4CH3-Ac),3.18(dd,1H,Jα,β1＝2.1Hz,Jβ1β2＝14.7Hz,H-β1),3.31(dd,1H,Jα,β2＝4.5Hz,H-β2),4.22(m,4H,Fmoc-CH,Fmoc-CHH,H-6a,and H-6b),4.32(m,1H,H-5),4.42(m,1H,Fmoc-CHH),4.79(m,1H,H-α),5.19(dd,1H,J2,3＝2.6Hz,J3,4＝9.8Hz,H-3),5.30(m,2H,H-4and H-1),5.35(bs,1H,H-2),6.10(d,1H,JNH,α＝8.1Hz,NH),7.54(m,8H,Fmoc-ArH).High-resolution MS data of C32H35NO13S(M,673.1829):[M+Na]+found 696.308；calcd696.173.
化合物XXVIII:1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝7.6Hz,2H,H-Fmoc),7.61(d,J＝7.2Hz,2H,H-Fmoc),7.40(t,J＝7.4Hz,2H,H-Fmoc),7.32(t,J＝7.4Hz,2H,H-Fmoc),6.05(d,J＝7.2Hz,1H,NH),5.48(s,1H,H-1),5.40(dd,3H,J＝10.0,2.7Hz,H-3’),5.31-5.36(m,2H,H-4,H-4’),5.17-5.23(m,2H,H-2’,H-3),4.92(d,J＝1.2Hz,1H,H-1’),4.64(s,1H,H-α),4.27-4.45(m,5H,H-5’,H-6,CH2-Fmoc),4.22(t,1H,J＝7.0Hz,CH-Fmoc),4.13-4.17(m,4H,H-2,H-5,H-6’),3.24(dd,2H,J＝66.0,13.6Hz,CH2-β),2.14(s,3H,CH3-Ac),2.13(s,3H,CH3-Ac),2.12(s,3H,CH3-Ac),2.08(s,3H,CH3-Ac),2.04(s,3H,CH3-Ac),2.02(s,3H,CH3-Ac),2.01(s,3H,CH3-Ac).HRMS(ESI)Calcd.for C44H51NNaO21S[M+Na]+requires 984.2567,Found:984.2556。
实施例3
本实施例为甘露糖糖基化氨基酸对映体(其中R为H或CH3)的制备例。合成路线与方法和实施例1相同，只需在合成中用Fmoc-D-Ser-OH/Fmoc-D-Thr-OH和L-(-)-Mannose替换Fmoc-Ser-OH/Fmoc-Thr-OH和D-(+)-Mannose即可。得到的化合物XIV、XV、XVI和XVII如下所示。
实施例4
本实施例为甘露糖糖基化氨基酸半对映体(其中R为H或CH3)的制备例。合成路线与方法和实施例1相同，只需在合成中用Fmoc-D-Ser-OH/Fmoc-D-Thr-OH或L-(-)-Mannose替换Fmoc-Ser-OH/Fmoc-Thr-OH或D-(+)-Mannose即可，得到的化合物XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIV、XXV和XXVI如下所示。
实施例5
本实施例为含硫代糖苷键类似物的甘露糖糖基化氨基酸如下所示。合成路线与方法和实施例1相同，只需在合成中用Fmoc-Cys-OH替换Fmoc-Ser-OH/Fmoc-Thr-OH即可，得到的XXVII、XXVIII、XXIX和XXX如下所示：
在本发明上述示例性实施例的说明中，分别以D-(+)-甘露糖、L-(-)-甘露糖、Fmoc-L-(-)-丝氨酸、Fmoc-D-(+)-丝氨酸、Fmoc-L-(-)-苏氨酸、Fmoc-D-(+)-苏氨酸等为起始原料，得到化合物IV，产率约为36％；化合物VII，产率约为17％；化合物X，产率约为8％；化合物VI，R＝H时，产率约为29％，R＝CH3时，产率为27％；化合物IX，R＝H时，产率约为39％，R＝CH3时，产率为44％；化合物XII，R＝H时，产率约为38％，R＝CH3时，产率为48％；化合物XIII，R＝H时，产率约为45％，R＝CH3时，产率为50％；甘露糖糖基化氨基酸对映体和半对映体XIV-XVII，XVIII-XXI和XXIII-XXVI的产率与相应的甘露糖糖基化氨基酸VI,IX,XII和XIII的产率类似。本发明优化的制备新方法，比现有技术的反应条件温和，步骤简便，对原料利用效率高。
尽管已经参考示例性实施方案对本发明进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对示例性实施方案做多种调整或变化。本发明的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。