一种2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的制备方法
阅读说明：本技术 一种2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的制备方法 (Preparation method of 2-chloro-4-nitrobenzene-alpha-L-fucoside ) 是由 潘得成 徐文明 祝长斌 马迪 钟佩岑 于 2021-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的制备方法,属于体外诊断领域。本发明以L-岩藻糖为起始原料,通过乙酰化反应,制得1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖,再与2-氯-4-硝基苯酚发生糖苷化反应,制得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷,其中,所述催化剂选择三氟甲磺酸三甲基硅酯或三氟化硼乙醚；最后进行脱乙酰基反应,制得2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷。本发明方法反应路线较短,通过三步反应制得最终产品；且以L-岩藻糖为原料,起始原料价格相对便宜,2-氯-4-硝基苯酚用量明显减少；后处理过程简单且反应重现性好,可实现工业化生产。(The invention discloses a preparation method of 2-chloro-4-nitrobenzene-alpha-L-fucoside, belonging to the field of in vitro diagnosis. The method comprises the steps of taking L-fucose as an initial raw material, preparing 1,2,3, 4-tetraacetyl-alpha-L-fucose through acetylation, and then carrying out glycosylation reaction with 2-chloro-4-nitrophenol to prepare 2-chloro-4-nitrobenzene-2, 3, 4-triacetyl-alpha-L-fucoside, wherein the catalyst is selected from trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate or boron trifluoride diethyl etherate; finally, performing deacetylation reaction to prepare the 2-chloro-4-nitrobenzene-alpha-L-fucoside. The method has a short reaction route, and a final product is prepared through three steps of reactions; the L-fucose is used as a raw material, the price of the initial raw material is relatively cheap, and the dosage of the 2-chloro-4-nitrophenol is obviously reduced; the post-treatment process is simple, the reaction reproducibility is good, and the industrial production can be realized.)
技术领域
本发明涉及一种2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的制备方法，属于体外诊断领域。
背景技术
α-L-岩藻糖苷酶(AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体内的各个组织、细胞及体液中。以肝、肾等组织活性较高，基本功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖蛋白及糖苷的水解代谢，其本质是一种糖蛋白，在包括免疫反应、信号转导等多种方面发挥重要作用。研究发现，α-L-岩藻糖苷酶的测定在多种疾病的诊断及治疗中都有积极的作用。其中，速率法(连续监测法)血清中AFU催化2-氯-对硝基酚α-L-岩藻糖苷(CNP-AFU)水解生成2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，在405nm或410nm波长监测CNP的生成速率，计算出AFU活性。本法测定对胆红素250mg/L、血红蛋白230mg/L、抗坏血酸6g/L无明显干扰。该法操作简便，测定时间短，灵敏度和抗干扰性有一定程度的提高。
目前，2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的市场需求量较大，但是合成上有较大难度。该产品的合成方法包括：1)Koichi等在1994年发表了一篇日本专利(JP 06-179690)，首次公开了2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的合成方法；但该方法重现性较差，且需要用到大量的2-氯-4-硝基苯酚，反应后处理十分困难。2)杜宇国等在2004年报道了一种新的合成路线；但该方法的起始原料乙基-1-巯-β-L-岩藻糖苷和保护基原料叔丁基二甲基氯硅烷的价格昂贵，且反应收率较低，不适合工业化生产。3)2013年，北京利德曼生化股份有限公司也报道了一种新的合成路线；该方法得到的α构型产物比例高，但合成路线步骤较长，且需要用到乙硫醇，臭味大。因此，亟需寻找一种简便、实用的制备2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的方法。
发明内容
[技术问题]
现有的制备方法的重现性差、后处理困难，或者成本高、收率低或合成步骤繁琐、使用臭味大的乙硫醇等物质。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷制备方法。本发明方法反应路线较短，通过三步反应制得最终产品；且以L-岩藻糖为原料，起始原料价格相对便宜，2-氯-4-硝基苯酚用量明显减少；后处理过程简单且反应重现性好，可实现工业化生产。
具体的，本发明提供了一种2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的制备方法，所述方法的反应路线如下：
所述方法包括以下步骤：
(1)以L-岩藻糖为起始原料，通过乙酰化反应，制得1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖；
(2)1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖与2-氯-4-硝基苯酚发生糖苷化反应，制得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，其中，反应溶剂为二氯甲烷，三乙胺作为缚酸剂，所述催化剂选择三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)或三氟化硼乙醚(BF3·Et2O)中的一种；
(3)2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷进行脱乙酰基反应，制得2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述乙酰化反应以碱作为催化剂，其中碱选自吡啶、醋酸钠中的一种，优选醋酸钠；乙酰化试剂选自乙酸酐、乙酸和乙酰氯中的一种或几种，优选乙酸酐。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述催化剂的用量为1-1.2当量，所述乙酰化试剂的用量为4-5当量(每一步的用量，无特殊说明，默认为该步反应的起始原料)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述乙酰化反应的反应温度为25-120℃，优选60-100℃，反应时间为4-12h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，乙酰化反应结束后，加入二氯甲烷中，水洗多次后经饱和氯化钠溶液清洗，之后干燥、除去溶剂即可得到1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述催化剂优选三氟化硼乙醚；催化剂用量4-10当量，优选5-8当量。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述2-氯-4-硝基苯酚用量1-4当量，优选1.5-2.5当量。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述糖苷化反应的反应温度25-50℃，优选40-50℃，反应时间为48-72h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的反应在惰性气氛下进行，所述惰性气氛为氮气或氩气。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，反应后处理采用重结晶方法获得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种，避免了柱层析，大大降低了后处理难度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述脱乙酰基反应以碱作为催化剂，其中碱选自甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或几种，优选甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠；所述催化剂用量为2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷的0.5-5mol％，优选1-2mol％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述脱乙酰基反应的反应温度为0-50℃，优选20-25℃，反应时间为0.5-2h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述脱乙酰基反应所用的溶剂为甲醇。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，反应后处理采用重结晶处理，即可得到最终产品，重结晶所用溶剂选自乙醇、异丙醇中的一种或几种。
本发明还提供了上述方法在生物检测领域中的应用。
本发明相对于现有技术，具有以下的优点和效果：
与以往的合成方法相比，本发明选用的起始原料L-岩藻糖价格相对便宜，第二步糖苷化反应采用三氟化硼乙醚催化，相比原有技术，大大降低了2-氯-4-硝基苯酚使用量以及降低了反应温度，不仅节省了成本，也降低了后处理的难度；本发明反应步骤相对较短，且每步反应收率可观，后处理过程未用到柱层析，可实现工业化生；；终产品2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷品质较好；总的工艺路线成本降低；因此，该制备方法具有很好的工业化生产的前景。
附图说明
图1 2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷1H NMR。
图2 2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷HPLC。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
(1)1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖的合成
往反应器中，加入100g L-岩藻糖和1L吡啶，搅拌；25℃下分批加入乙酸酐746g，防止剧烈放热；加料完毕后，25℃反应12h。反应结束，旋除吡啶得到粘稠状液体；并将粘稠状液体倒入1L二氯甲烷中，水洗(5x 500mL)，再用500mL饱和氯化钠溶液洗，用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，得到1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖200g，收率为99％。
(2)2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷的合成
往反应器中，加入200g 1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖，溶于1L二氯甲烷，搅拌。加入232g2-氯-4-硝基苯酚和60g三乙胺，氮气保护，搅拌。25℃下，滴加426g BF3·Et2O，滴毕，继续反应48h，停止反应。反应结束，加入1L水淬灭反应，再加入1L二氯甲烷分液。有机相，用饱和氢氧化钠水溶液洗3×1L，过滤，分液。合并水相，用1L二氯甲烷反洗一遍。合并有机相，旋除溶剂，得到粗产物2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，乙醇重结晶，得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷110g，收率为41％。
(3)2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的合成
往反应器中，加入100g 2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，500mL甲醇，室温下搅拌。将125mg甲醇钠溶于5mL甲醇，滴加至反应体系中，搅拌。TLC监测原料反应完全，停止反应。反应结束，加入+H离子交换树脂30g，搅拌淬灭反应。过滤，旋除溶剂，得粗产物5。加入100mL乙醇，打浆，过滤得终产物60g，收率84％。
经过测定，终产品2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的品质(纯度)为99％。
本实施例通过多次重复实验，实验结果波动不大；而原有技术(日本专利(JP 06-179690)公开的合成方法)，多次重复试验发现，实验结果波动较大。
实施例2
1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖的合成
(1)往反应器中，依次加入3kg乙酸酐和600g无水醋酸钠，加热至80℃，搅拌。分批加入L-岩藻糖1kg，防止剧烈放热；反应放热，控制内温不超过120℃。加料完毕，将内温稳定在100-110℃，反应4h，停止反应。将反应体系降温，加入5L冰水，搅拌过夜。用二氯甲烷3×3L将产物萃出，水洗2×2L，再用2L饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥处理，旋除溶剂，得到1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖2kg，收率为99％；
(2)2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷的合成
往反应器中，加入2kg 1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖，溶于10L二氯甲烷，搅拌。加入1160g2-氯-4-硝基苯酚和600g三乙胺，氮气保护，搅拌。25℃下，滴加4.26kg BF3·Et2O，滴毕，继续反应48h，停止反应。反应结束，加入10L水淬灭反应，再加入10L二氯甲烷分液。有机相，用饱和氢氧化钠水溶液洗3×10L，过滤，分液。合并水相，用1L二氯甲烷反洗一遍。合并有机相，旋除溶剂，得到粗产物2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，乙醇重结晶，得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷1060g，收率为40％。
(3)2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的合成
往反应器中，加入1000g 2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，5000mL甲醇，室温下搅拌。将1250mg甲醇钠溶于50mL甲醇，滴加至反应体系中，搅拌。TLC监测原料反应完全，停止反应。反应结束，加入+H离子交换树脂300g，搅拌淬灭反应。过滤，旋除溶剂，得粗产物5。加入1000mL乙醇，打浆，过滤得终产物580g，收率81％。
经过测定，终产品2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的品质(纯度)为99％。
实施例3
(1)1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖的合成
往反应器中，加入100g L-岩藻糖和1L吡啶，搅拌；25℃下分批加入乙酸酐746g，防止剧烈放热；加料完毕后，60℃下反应4h。反应结束，降温，旋除吡啶得到粘稠状液体；并将粘稠状液体倒入1L二氯甲烷中，水洗(5x 500mL)，再用500mL饱和氯化钠溶液洗，用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，得到1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖；
(2)2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷的合成
往反应器中，加入200g 1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖，溶于1L二氯甲烷，搅拌，加入232g2-氯-4-硝基苯酚和60g三乙胺，氮气保护，搅拌。40℃下，滴加450gTMSOTf，滴毕，继续反应48h，停止反应。反应结束，加入1L水淬灭反应，再加入1L二氯甲烷分液。有机相，用饱和氢氧化钠水溶液洗3×1L，过滤，分液。合并水相，用1L二氯甲烷反洗一遍。合并有机相，旋除溶剂，得到粗产物2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，异丙醇重结晶，得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷；
(3)2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的合成
往反应器中，加入100g 2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷，500mL甲醇，室温下搅拌。将150mg叔丁醇钠溶于5mL甲醇，滴加至反应体系中，搅拌。TLC监测原料反应完全，停止反应。反应结束，加入+H离子交换树脂30g，搅拌淬灭反应。过滤，旋除溶剂，得粗产物5。加入100mL异丙醇，打浆，过滤得终产物。
经过测定，终产品2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷的品质(纯度)为99％。
对比例1
步骤(1)同实施例1；
步骤(2)：在200mL带有搅拌器三口烧瓶中，加入4.2g无水氯化锌(催化剂)，10g 1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖，52g2-氯-4-硝基苯酚，加料完毕后，搅拌升温至120℃，待反应液溶清，通过TLC监测反应进程。原料反应完全，停止反应，降温，加入250mL二氯甲烷将反应液溶解。用0.1mol/L氢氧化钠水溶液洗(3x 500mL)，再用饱和氯化钠溶液洗(3x 500mL)，用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂；通过柱层析(EA/PE＝1:5)得到粗产物，再用乙醇重结晶得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷3g，收率23％。
步骤(3)同实施例1；
对比例2
步骤(1)同实施例1；
步骤(2)：在2L带有搅拌器三口烧瓶中，加入83g无水氯化锌，200g 1,2,3,4-四乙酰基-α-L-岩藻糖，520g2-氯-4-硝基苯酚，加料完毕后，搅拌升温至120℃，待反应液溶清，通过TLC监测反应进程。原料反应完全，停止反应，降温，加入5L二氯甲烷将反应液溶解。用0.1mol/L氢氧化钠水溶液洗(3x 1L)，再用饱和氯化钠溶液洗(3x2L)，用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂；通过柱层析(EA/PE＝1:5)得到粗产物，再用乙醇重结晶得2-氯-4-硝基苯-2,3,4-三乙酰基-α-L-岩藻糖苷48g，收率18％。
步骤(3)同实施例1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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