间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用
阅读说明：本技术 间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用 (Preparation method of mesenchymal stem cell paracrine factor and application of paracrine factor ) 是由 占国强 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用,属于化妆品技术领域,其中一种间充质干细胞旁分泌因子的制备方法是由如下步骤制得,(1)将间充质干细胞接种于含有10%胎牛血清的α-MEM培养基中,调整细胞浓度1×10～(7)L～(-1)置于培养箱内培养,用0.2%胰酶消化传代,得到的间充质干细胞密度大于90%传代,得到所需数量的间充质干细胞；(2)向间充质干细胞内接种于诱导培养基内,并向诱导培养基内加入二甲双胍水溶液培养20～30h；(3)将步骤(2)采用无血清间质细胞培养基换液,进行饥饿处理；(4)收集步骤(3)中的细胞培养液进行浓缩,真空冻干成粉状。(The invention provides a preparation method of a mesenchymal stem cell paracrine factor and application of the paracrine factor, belonging to the technical field of cosmetics, wherein the preparation method of the mesenchymal stem cell paracrine factor comprises the following steps of (1) inoculating mesenchymal stem cells into an alpha-MEM culture medium containing 10% fetal calf serum, and adjusting the cell concentration to be 1 multiplied by 10 7 L ‑1 Culturing in incubator, digesting with 0.2% pancreatin, and passaging to obtain mesenchymal stemThe cell density is larger than 90% passage to obtain the mesenchymal stem cells with required quantity; (2) inoculating the mesenchymal stem cells into an induction culture medium, and adding a metformin aqueous solution into the induction culture medium to culture for 20-30 h; (3) replacing the serum-free interstitial cell culture medium in the step (2) for starvation treatment; (4) and (4) collecting the cell culture solution in the step (3), concentrating, and freeze-drying in vacuum to form powder.)
技术领域
本发明涉及化妆品
技术领域
，尤其涉及一种间充质干细胞旁分泌因子的制备方法、旁分泌因子应用。背景技术
随着生活水平的提高与科技的进步，以往的美白、保湿等基本功能已不能满足人们对化妆品的需求，抗衰老逐渐成为大家关心的方面。在皮肤老化的过程中，活性氧是皮肤老化的重要诱因，且内源性老化和外源性老化是同时作用的。内源性老化主要是随着年龄的增长，氧化及糖化的蛋白质逐渐累积，使得真皮中胶原蛋白和弹性蛋白损失，皮肤变薄，角质形成细胞变性。外源性老化则是因为紫外线损伤、环境损害、发炎等，导致表皮组织的恶化和损伤。
机体衰老最直观的表现为皮肤衰老，皮肤是人体最大的器官，皮肤老化与环境因素密切相关，紫外线光老化是引起皮肤衰老的一个重要因素，为防止光老化，人们可以避免紫外线与皮肤接触。然而，对生理性自然衰老的明确保护方法仍然未知。通常，皮肤衰老主要表现为干燥粗糙、松弛、皱纹加深甚至可能出现瘙痒、特应性皮炎等老年皮肤病，为提高生活质量，如何有效抗皮肤衰老是当前的研究重点。
间充质干细胞是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是造血微环境中的一种重要的细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。间充质干细胞（MSC）来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，具有多向分化潜能，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。2006年，国际细胞治疗协会规范了MSC的定义。间充质干细胞需要同时符合以下三个标准的细胞，才能称之为MSC：①贴壁生长；②细胞表面表达一些特异性抗原（标记物）；③具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的能力。MSC是目前在治疗方面最为安全有效和应用广泛的成体干细胞，主要来源于骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜等。与其他干细胞相比，MSC具有易获取、易体外培养、长期传代稳定性、低免疫原性、组织修复能力强等优势。此外，MSC来自于成年的细胞，甚至可以从患者自身体内获得，而非胚胎或胎儿干细胞，因而不涉及道德和伦理学的问题。MSC在经过连续传代和冷冻保存之后，仍具有多向分化和自我复制的潜能。研究表明人骨髓MSC可在体外传代40代以上仍保持干细胞特性。
但是，现阶段间充质干细胞的旁分泌因子分离提纯、培植、倍增、浓缩的效率低下，往往要处理多次才有效果；同时得到旁分泌因子的浓度低，未经提纯浓缩的旁分泌因子在单位体积的溶液中含量比较少。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，该方法不仅得到的分泌因子安全性高且成本低，且旁分泌因子得率高浓度高。
为解决上述技术问题，本发明提供一种间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，其由如下步骤制得：其由如下步骤制得：
（1）将间充质干细胞接种于含有10%胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度1×107L-1置于4.5～6%CO2、湿度为90％、温度36.5～37.5℃培养箱内培养，每2～3天清洗换液一次，用0.2%胰酶消化传代，得到的间充质干细胞密度大于90%传代，得到所需数量的间充质干细胞；
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入二甲双胍水溶液培养20～30h，待间充质干细胞制剂的终细胞浓度为106～108个/mL进行换液；
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的1/8～1/10进行饥饿处理20～28h；
（4）收集步骤（3）中的细胞培养液进行浓缩，真空冻干成粉状。
优选的，其由如下步骤制得：
（1）将间充质干细胞接种于含有10%胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度1×107L-1置于5%CO2、湿度为90％、温度37℃培养箱内培养，3天清洗换液一次，用0.2%胰酶消化传代，得到的间充质干细胞密度大于90%传代，得到所需数量的间充质干细胞；
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入二甲双胍水溶液培养24h；
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的十分之一进行饥饿处理24h；
（4）收集步骤（3）中的细胞培养液进行浓缩，真空冻干成粉状。
优选的，步骤（1）中，还包括间充质干细胞专用原代筛选，所述间充质干细胞专用原代筛选培养基是添加了2～8ng/mL干细胞因子、10～30IU/mLIL-10和1～4ng/mLLIF、1～4ng/mLβ转化生长因子、2～8ng/mL雷帕霉素、2～12ng/mL曲美替尼、10～20ng/mL乙酰氨基酚、1～3ng/mL5-HMF、10～20ng/mL磷酸氯喹的间充质干细胞无血清完全培养基。
优选的，步骤（1）中，间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
优选的，步骤（3）中，将得到的饥饿处理得到的细胞培养液更换含β淀粉样蛋白的无血清培养基，换液后利用紫外交联仪对培养瓶进行照射；所述β淀粉样蛋白的浓度为0.1μg/L；所述紫外交联仪照射的具体条件为以1mJ/cm2照射10min；洗出培养液用PBS清洗2～3次，然后加2～3mL细胞裂解液溶解细胞，然后收集到离心管中，离心取上清液，将此上清液浓缩后进行喷雾干燥。
优选的，步骤（2）中，二甲双胍的浓度为50～700ummol/L。
优选的，步骤（3）中，在进行饥饿处理同时进行低氧处理。
优选的，步骤（4）中还包括如下步骤：
S1：将步骤（4）中收集的细胞培养液，在无血清且去除旁分泌因子的培养液中在37℃培养箱孵育48h后，并以上清液经400g，第一次离心1～10分钟、3000g第二次离心10～20分钟，10000g第三次离心10～20分钟，得到固相物质，移除上层清液后得到间质干细胞总旁分泌因子；
S2：将步骤S1中取得的间质干细胞总旁分泌因子用60000g的SW28转子浓缩90～120分钟，总旁分泌因子沉淀在0.32M蔗糖中重悬，然后100000g离心1～3个小时，留做备用；
S3：用免疫磁珠法，取得重悬液留作备用；
S4：将步骤S3中取得的重悬液，加入第四离心管中，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在第四离心管中得到磁珠结合的旁分泌因子；
S5：向第四离心管中加入pH值为7～8的磷酸缓冲液，然后将第四离心管置于磁力架吸附3～8分钟，再移除管内液体，从而对磁珠结合的旁分泌因子进行清洗；
S6：利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，将步骤S5处理后的旁分泌因子样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化旁分泌因子；
S7：利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用洗脱液分别洗脱样品中的旁分泌因子，取得经洗涤后纯化柱；
S8：所述经洗涤后纯化柱用含50～200mMNaPO，0.1～10mMEDTA，pH为6.5～7.5的洗脱液孵育1～5min，4℃、2000～5000rpm离心1～5min，得到高纯度旁分泌因子。
一种间充质干细胞旁分泌因子的应用，所述的间充质干细胞旁分泌因子用于制备美容产品。
优选的，所述美容产品为面霜、润肤露、爽肤水、面膜原料以及美容针。
现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明先经过二甲双胍水溶液培养，再通过减少换液后培养基的添加量，可以大大提高得到的间充质干细胞数量及旁分泌因子的浓度及对皮肤的抗衰紧致的效果有明显的提升。并通过真空冻干，提高了旁分泌因子的含量。
2.本发明优选的脂肪干细胞主要取自抽脂术后遗弃的脂肪组织，其可大量获得，且提取简单方便。不同来源的间充质干细胞条件培养基对衰老皮肤成纤维细胞的作用，脂肪干细胞延缓皮肤成纤维细胞衰老的作用较好。因为脂肪干细胞可通过分泌一系列活性成分从而在抑制皮肤老化、创伤修复、辅助脂肪移植、促进毛发再生等方面有较显著的效果。
本发明得到的间充质干细胞所分泌的因子具有改善细胞生长微环境、 调节机体免疫、促进血管再生、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等功能，对受损皮肤、敏感皮肤 以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，能促进胶原蛋白合成，延缓衰老等。
二甲双胍源自于法国丁香的一种天然提取物，最初研究主要聚焦于线粒体传递链，如通过作用于腺苷单磷酸活化蛋白激酶来抑制糖异生进而起到治疗IⅡ型糖尿病的效果。同时有研究发现，二甲双胍在抑制肝纤维化及成骨分化等方面具有重要作用。
本发明优选了通过制取上清液，分离得到上层液体，将上层液体移入第二离心管中，三次连续离心，底部得到固相物质，移除上层清液后为人脐带间质干细胞总旁分泌因子，旁分泌因子在蔗糖中重悬，分离得到上清液离心、免疫磁珠法取得重悬液，羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化旁分泌因子，多次对旁分泌因子进行纯化，使得提纯效果好，减少了杂质。
附图说明
图1为本发明实施例1-7对细胞指数的影响；
图2为本发明实施例1-7对胶原蛋白含量的影响；
图3为本发明实施例1、5、6、8、9对胶原蛋白含量的影响；
图4为本发明实施例8、10-14对细胞指数的影响；
图5为本发明实施例8、10-14对胶原蛋白含量的影响；
图6为使用本发明的间充质干细胞对于患有红肿过敏患者的影响图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的工业原料（试剂、原料视情况选择）如无特别说明，均为市售常规工业原料；所涉及的加工制作方法（检测、测试、制备方法等视情况而选择），如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：一种间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，其由如下步骤制得：
（1）将脂肪间充质干细胞接种于含有10%胎牛血清的α-MEM培养基中，调整细胞浓度1×107L-1置于5%CO2、湿度为90％、温度37℃培养箱内培养，3天清洗换液一次，用0.2%胰酶消化传代，得到的间充质干细胞密度大于90%传代，得到所需数量的间充质干细胞；
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为400ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h；
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，此步骤培养基为友康NC0103培养基，按照换液后培养基为正常培养基的十分之一进行饥饿处理24h；
（4）收集步骤（3）中的细胞培养液进行浓缩，真空冻干成粉状。
本实施例中，步骤（1）中，还包括间充质干细胞专用原代筛选，所述间充质干细胞专用原代筛选培养基是添加了6ng/mL干细胞因子、15IU/mLIL-10和3ng/mLLIF、3ng/mLβ转化生长因子、5ng/mL雷帕霉素、10ng/mL曲美替尼、15ng/mL乙酰氨基酚、2ng/mL5-HMF、15ng/mL磷酸氯喹的间充质干细胞无血清完全培养基。
本实施例中，步骤（3）中，将得到的饥饿处理得到的细胞培养液更换含β淀粉样蛋白的无血清培养基，换液后利用紫外交联仪对培养瓶进行照射；所述β淀粉样蛋白的浓度为0.1μg/L；所述紫外交联仪照射的具体条件为以1mJ/cm2照射10min；洗出培养液用PBS清洗3次，然后加3mL细胞裂解液溶解细胞，采用冰浴超声破碎对细胞进行裂解，然后收集到离心管中，离心取上清液，将此上清液浓缩后进行喷雾干燥。
本实施例中，步骤（4）中还包括如下步骤：
S1：将步骤（4）中收集的1000mL细胞培养液，在无血清且去除旁分泌因子的培养液中在37℃培养箱孵育48h后，并以上清液经400g，第一次离心8分钟、3000g第二次离心15分钟，10000g第三次离心15分钟，得到固相物质，移除上层清液后得到间质干细胞总旁分泌因子；
S2：将步骤S1中取得的间质干细胞总旁分泌因子用60000g的SW28转子浓缩90分钟，总旁分泌因子沉淀在0.32M蔗糖中重悬，然后100000g离心20min，留做备用；
S3：用免疫磁珠法，取得重悬液留作备用；
S4：将步骤S3中取得的重悬液，加入离心管中，将所述离心管置于磁力架，吸附8分钟，移除管内液体，在离心管中得到磁珠结合的旁分泌因子；
S5：向步骤S4中的离心管中加入pH值为7.5的磷酸缓冲液，然后将离心管置于磁力架吸附6分钟，再移除管内液体，从而对磁珠结合的旁分泌因子进行清洗；
S6：利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，将步骤S5处理后的旁分泌因子样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化旁分泌因子；利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用洗脱液分别洗脱样品中的旁分泌因子，取得经洗涤后纯化柱；
S7：将步骤S6经洗涤后纯化柱用含100mMNaPO，1mMEDTA，pH为7的洗脱液孵育4min后，4℃、3000rpm离心3min，得到高纯度旁分泌因子，并将得到的高纯度旁分泌因子溶于10mL的无菌水中。
实施例2：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为50ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
实施例3：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为100ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
实施例4：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为200ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
实施例5：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为300ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
实施例6：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为500ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
实施例7：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为700ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
对比例1：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入无菌水培养24h。
按照实施1-6和对比例1的制备方法，脂肪间充质干细胞接种于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，利用细胞实时分析检测系统xCELLigence（瑞士Roche公司）进行细胞增殖检测，细胞增殖检测结果如图1所示。
由图1所示，实施例1、实施例5和实施例6，加入二甲双胍水溶液300～500ummol/L，其细胞指数显著性高于其他处理组。
收集各组细胞上清，加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。将标准胶原分别稀释为0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.5、1.00mg·mL1。各样本管中加入500μLsircol染料孵育30min，用1×Acid-SaltWashReagent清洗。向各管中加入250uL碱性金属试剂，涡旋混匀。转移200μL样本至96孔板中。用酶标仪检测，检测波长为555nm，用水调吸光值为零，测定空白试剂、标准胶原和检测样本空白试剂吸光度，读数重复试验误差士10%，重复3次，实施例1-7及对比例1的胶原蛋白的检测结果如图2所示。
由实施例1-7及对比例1可以看出，本发明实施例1、5、6胶原蛋白表达了均显著提高。
选用实施例1、实施例5和实施例6，加入二甲双胍水溶液300～500ummol/L，在此区间内设置实施例。
实施例8：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为350ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
实施例9：与实施例1的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为550ummol/L的二甲双胍水溶液培养24h。
收集实施1、实施例5、实施例6、实施例8、实施例9各组细胞上清，加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。将标准胶原分别稀释为0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.5、1.00mg·mL1。各样本管中加入500μLsircol染料孵育30min，用1×Acid-SaltWashReagent清洗。向各管中加入250uL碱性金属试剂，涡旋混匀。转移200μL样本至96孔板中。用酶标仪检测，检测波长为555nm，用水调吸光值为零，测定空白试剂、标准胶原和检测样本空白试剂吸光度，读数重复试验误差士10%，重复3次，检测胶原蛋白的含量结果如图3所示。
有图3所示，350ummol/L的二甲双胍水溶液培养胶原蛋白的含量最高。
实施例10，与实施例8的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为350ummol/L的二甲双胍水溶液培养18h。
实施例11，与实施例8的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为350ummol/L的二甲双胍水溶液培养30h。
实施例12，与实施例8的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为350ummol/L的二甲双胍水溶液培养36h。
实施例13，与实施例8的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为350ummol/L的二甲双胍水溶液培养42h。
实施例14，与实施例8的不同之处在于步骤（2）：
（2）向间充质干细胞内接种于诱导培养基内，并向诱导培养基内加入浓度为350ummol/L的二甲双胍水溶液培养48h。
收集实施例8、实施例10-14各组细胞上清，脂肪间充质干细胞接种于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，利用细胞实时分析检测系统xCELLigence（瑞士Roche公司）进行细胞增殖检测，实施例8、实施例10-14细胞增殖检测如图4所示。
加入100uL胶原分离与浓缩试剂，4℃过夜后离心弃上清。将标准胶原分别稀释为0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.5、1.00mg·mL-1。各样本管中加入500μLsircol染料孵育30min，用1×Acid-SaltWashReagent清洗。向各管中加入250uL碱性金属试剂，涡旋混匀。转移200μL样本至96孔板中。用酶标仪检测，检测波长为555nm，用水调吸光值为零，测定空白试剂、标准胶原和检测样本空白试剂吸光度，实施例8、实施例10-14胶原蛋白的检测结果如图5所示。
由图5所述示，实施例12中，胶原蛋白的含量最高，所以选用实施例12中处理时间，二甲双胍水溶液培养36h。
实施例15，与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的50%进行饥饿处理24h。
实施例16，与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的40%进行饥饿处理24h。
实施例17，与实施例12的不同之处在于：
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的30%进行饥饿处理24h。
实施例18，与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的20%进行饥饿处理24h。
实施例19，与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的5%进行饥饿处理24h，并对得到的上清液进行浓缩。
实施例20，与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）并对得到的上清液不进行浓缩。
收集实施12、实施例15-20组细胞上清，去除 细胞沉渣；收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。将浓缩原液收集至合适离心管内，浓缩为原来1/100，取样用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
表1 不同处理对VEGF、FGF、EGF浓度的影响
。
由表1可知，旁分泌因子经提纯浓缩后，其中VEGF、FGF 、EGF的含量大大增加。且本发明发现将10%的培养基进行饥饿处理产生的活性因子最高。再继续降低培养基的量，细胞会出现大量的死亡。
实施例21，与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）将步骤（2）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基的10%进行饥饿处理24h，控制氧气浓度5%，并对得到的上清液进行浓缩。
对比例2：与实施例12的不同之处在于步骤（3）：
（3）将步骤（3）采用无血清间质细胞培养基换液，按照换液后培养基为正常培养基，控制氧气浓度5%，并对得到的上清液进行浓缩。
对比例3：与实施例21的不同之处在于步骤（2）：
（3）不经过甲双胍水溶液培养，并对得到的上清液进行浓缩。
收集实施12、实施例21、对比例2、对比例3组细胞上清，去除 细胞沉渣；收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。将浓缩原液收集至合适离心管内，浓缩为原来1/100，取样用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
表2 不同处理对VEGF、FGF、EGF浓度的影响
。
表2 可以，在低氧、饥饿处理条件下，活性因子的得率高于单纯的采用低氧处理组。说明低氧和饥饿处理对旁分泌因子的产生具有协同的作用。
一种间充质干细胞旁分泌因子的应用，所述的间充质干细胞旁分泌因子用于制备美容产品。
优选的，所述美容产品为面霜、润肤露、爽肤水、面膜原料以及美容针。
皮肤干细胞活性素应用于霜剂化妆品中，所述的霜剂化妆品包括以下组分及其质量百分比：细胞旁分泌因子12.5％、羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.8％、SOD5％、肌肽3.5％、壳寡糖1.5％、L-苹果酸3％、蜂胶3.5％、余量为水。
对比例4：所述的霜剂化妆品包括以下组分及其质量百分比：羊毛醇3.5％、白蜂蜡7.8％、SOD5％、肌肽3.5％、壳寡糖1.5％、L-苹果酸3％、蜂胶3.5％、余量为水。
对比例5：受试者不使用任何护肤产品。
试验方法：筛选150例皮肤出现老化的女性受试志愿者，年龄30-50岁，平均年龄38岁，入选标准：皮肤干燥、弹性降低、出现皱纹、色素沉着、肤色灰暗等皮肤老化现象，在整个试验期间不使用其他抗衰老产品。
150名女性受试志愿者分为3组每组50例，分别为实施例21组和对比例4-5组，其中对照组5为受试者不使用任何护肤产品，实施例21组和对比例4-5组受试者分别使用本发明实施例21和对比例4制得的霜剂化妆品，早晚洁面后取适量的霜剂化妆品涂抹于面部，各组整个试验时间为60天，记录试验期间发生的不良反应，并对受试者进行效果评价。
皮肤老化评估：通过观察受试者的5个受试区的皱纹来评价(眉间纹、前额皱纹、鱼尾纹、鼻唇沟、唇周皱纹)，评判标准：没有皱纹；轻度(有2-3条皱纹，长度<1.5cm)；中度(有2-6条浅皱纹，长度<3cm)；重度(有数条主皱纹，长度达4cm，同时伴有浅皱纹)。
安全性评估：主要评价使用产品后受试者出现轻微不适、红斑、干燥、瘙痒和刺痛等不良反应的发生情况。
在第60天对受试者采用无创性仪器检测受试部位的含水量、油脂含量，进行统计分析；试验结果如表1-3所示。
表3不同化妆品对受试者脸部安全性评估
。
表4不同化妆品对受试部位的含水量、油脂含量
。
由表3和表4可知，本发明的肤产品提高角质层水含量和油脂含量。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
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