体外合成不同紧密程度的糖原状α-葡聚糖的方法
阅读说明：本技术 体外合成不同紧密程度的糖原状α-葡聚糖的方法 (Method for in vitro synthesis of glycogenic alpha-glucans of different compaction degrees ) 是由 金征宇 柏玉香 刘佳林 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了体外合成不同紧密程度的糖原状α-葡聚糖的方法,属于食品、药品和淀粉糖生产领域。本发明可通过SP-GP-BE三酶法以蔗糖为底物合成分子量一定的糖原状α-葡聚糖(GnG),通过调整GP与BE的比例可控制GnG的外侧链的疏松程度,从而得到粒径在44nm-54nm的范围内的不同GnG样品,GnG分子的疏松程度随着GP/BE比例的增加而提高。在控制GP/BE的基础上,对反应体系中麦芽三糖的浓度进行调节,随着麦芽三糖浓度的提升,GnG的分子量降低,同时使得GnG分子疏松程度增加。通过本发明的方法可以通过调节GP/BE比例,或调节麦芽三糖的浓度来调节GnG分子的疏松程度。(The invention discloses a method for synthesizing glycogenic alpha-glucan with different compactness degrees in vitro, belonging to the field of food, medicine and starch sugar production. The invention can synthesize glycogenic alpha-glucan (GnG) with certain molecular weight by using sucrose as a substrate through an SP-GP-BE three-enzyme method, and can control the loose degree of an outer side chain of GnG by adjusting the ratio of GP to BE so as to obtain different GnG samples with the particle size ranging from 44nm to 54nm, wherein the loose degree of GnG molecules is improved along with the increase of the ratio of GP to BE. On the basis of controlling GP/BE, the concentration of maltotriose in the reaction system is adjusted, and the molecular weight of GnG is reduced along with the increase of the concentration of maltotriose, and the molecular porosity degree of GnG is increased. The method of the invention can adjust the loosening degree of GnG molecules by adjusting the ratio of GP/BE or adjusting the concentration of maltotriose.)
技术领域
本发明体外合成不同紧密程度的糖原状α-葡聚糖的方法，属于食品、药品和淀粉糖生产领域。
背景技术
糖原作为动物和微生物体内的主要储存多糖，是一种复杂的高度分支的葡萄糖聚合物,其形态大小很大程度上受到提取方法的限制，复杂且昂贵的制备工艺限制了糖原作为功能性纳米材料的应用。因此通过体外酶促合成途径可以根据不同需求获得结构可控的葡聚糖。
三酶法(蔗糖磷酸化酶-α葡聚糖磷酸化酶-分支酶法，SP-GP-BE法)可以以蔗糖为底物合成糖原状α-葡聚糖，由于其无毒和生物可降解的性质，成为了生物医学合成纳米颗粒的理想替代品。然而在复杂的生物环境中，需要对糖原状α-葡聚糖纳米颗粒的结构参数进行更精细的控制。其颗粒尺寸和表面链的疏松程度将对其亲水性、降解性以及载药量等性质产生影响。因此可以通过对糖原状α-葡聚糖外部链的紧密程度的控制，获得分子量相同，但分子尺寸不同的糖原状α-葡聚糖，从而为获得具有不同程度功能特性的衍生物提供基础。
参考糖原的体内合成方法，1943年Cori在体外以葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)作为底物，通过肌肉磷酸化酶(GP)和分离自大鼠肝脏和兔子心脏的分支酶(BE)的协同作用合成了糖原状α-葡聚糖(Cori G T,Cori C F.Crystalline musclephosphorylase.IV.Formation of glycogen[J].Journal of Biological Chemistry,1943,151:57-63.)。此外，还可以以淀粉为底物生产糖原状α-葡聚糖。田耀旗等人以DP10-20直链糊精和A链聚合度DP10-20的糯米淀粉为底物，使用灌浆期糯米籽粒来源的BE在体外获得了类似糖原结构的高度支化淀粉。Kajiura等人使用异淀粉酶(IAM)从淀粉或糊精中制备短链直链淀粉，加热使异淀粉酶失活后，添加BE和麦芽糖转葡糖基酶(AM)以体外合成糖原状α-葡聚糖(Kajiura H.；Kakutani R.；Akiyama T.；Takata H.；Kuriki T.,A novelenzymatic process for glycogen production.Biocatalysis andBiotransformation2009,26,133-140.)。
Fujii et al.发明了一种以蔗糖为底物，以蔗糖磷酸化酶(SP)-葡聚糖磷酸化酶(GP)反应体系结合分支酶合成具有较高产率的超支化葡聚糖。在该方法中仅提出合成的可能，未对获得产物的精细结构进行调控(Fujii.；Bioengineering and Application ofNovel Glucose Polymers2003)。
发明内容
本发明在较高浓度的磷酸缓冲盐溶液中，通过对蔗糖磷酸化酶(SP)-α-葡聚糖磷酸化酶(GP)-分支酶(BE)三酶法(SP-GP-BE)合成超支化葡聚糖的方法中的GP添加量的调整，对GP与BE的比例做出了改进，提供了一种体外合成可控紧密程度的糖原状α-葡聚糖的方法，达到了对合成的糖原状α-葡聚糖颗粒进行精细调控的效果。
本发明提供了一种体外合成不同紧密程度的糖原状α-葡聚糖的方法，所述方法为：反应体系以磷酸盐溶液为缓冲液，以蔗糖为底物，以麦芽三糖为引物，并添加蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶；所述蔗糖和麦芽三糖的摩尔比例为(400～8000):1，α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的添加量比例为1:(50～400)；α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的添加量比例与糖原状α-葡聚糖的疏松程度成正相关。
在一种实施方式中，所述蔗糖和麦芽三糖的摩尔比例优选为600:1。
在一种实施方式中，所述缓冲液中磷酸盐浓度在160mM～240mM；蔗糖在反应体系中的浓度为200～300mM；所述麦芽三糖在反应体系中的浓度为0.03～0.6mM。
在一种实施方式中，所述蔗糖在反应体系中的浓度为240mM。
在一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的添加量为1～3U/mL，优选为2U/mL。
在一种实施方式中，所述α-葡聚糖磷酸化酶的添加量为5～40U/μmol麦芽三糖；所述分支酶的添加量为1800～2200U/μmol麦芽三糖。
在一种实施方式中，所述分支酶的添加量优选为2000U/μmol麦芽三糖；
在一种实施方式中，所述α-葡聚糖磷酸化酶的添加量优选为5U/μmol麦芽三糖，或40U/μmol麦芽三糖。
在一种实施方式中，反应体系中含有磷酸缓冲液以维持pH＝6.5～7.5，将蔗糖和麦芽三糖添加至反应体系中，在50～55℃下保温15～20min加入α-葡聚糖磷酸化酶，反应150～180rpm震荡反应20～30min后加入蔗糖磷酸化酶和分支酶，在50～55℃下震荡反应4～16h。
本发明提供了一种提升糖原状α-葡聚糖疏松程度的方法，所述方法为在以蔗糖为底物、麦芽三糖为引物的磷酸盐反应体系中添加蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶；所述蔗糖和麦芽三糖的摩尔比例为600:1；所述α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的加酶量比例为1:(50～400)；反应14～20h；糖原状α-葡聚糖的疏松程度与α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的添加量比例成正相关。
在一种实施方式中，所述蔗糖在反应体系中的浓度为240mM；所述麦芽三糖的添加量为0.4mM。
在一种实施方式中，所述分支酶的添加量为1800～2200U/μmol麦芽三糖，优选为2000U/μmol麦芽三糖。
在一种实施方式中，所述α-葡聚糖磷酸化酶的添加量为5～40U/μmol麦芽三糖。
在一种实施方式中，反应体系中含有160～240mM磷酸盐缓冲液以维持pH＝7.0，将蔗糖和麦芽三糖添加至反应体系中，在55℃下保温20min加入α-葡聚糖磷酸化酶，反应150rpm震荡反应30min后加入蔗糖磷酸化酶和分支酶，在55℃下震荡反应16h。
本发明提供了一种提升糖原状α-葡聚糖的半径的方法，所述方法为在以蔗糖为底物、麦芽三糖为引物的磷酸盐反应体系中添加蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶；所述蔗糖和麦芽三糖的摩尔比例为600:1；α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的加酶量比例为1:(50～400)；反应14～20h；糖原状α-葡聚糖的半径与α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的添加量比例成正相关。
在一种实施方式中，所述蔗糖在反应体系中的浓度为200～300mM，优选为240mM。
在一种实施方式中，所述麦芽三糖在反应体系中的浓度为0.03～0.6mM，优选为0.4mM。
在一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的添加量为1～3U/mL，优选为2U/mL。
在一种实施方式中，反应体系中含有160～240mM磷酸盐缓冲液以维持pH＝7.0，将蔗糖和麦芽三糖添加至反应体系中，在55℃下保温20min加入α-葡聚糖磷酸化酶，反应150rpm震荡反应30min后加入蔗糖磷酸化酶和分支酶，在55℃下震荡反应16h。
本发明提供了一种同时调节糖原状α-葡聚糖分子链疏松度和分子量大小的方法，所述方法为在以蔗糖为底物、麦芽三糖为引物的磷酸盐反应体系中添加蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶；α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的加酶量比例为1:(50～400)；α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的加酶量比例为1:50，蔗糖浓度为240mM；麦芽三糖浓度与分子链疏松度呈正相关；麦芽三糖的浓度与糖原状α-葡聚糖分子量的对数值呈负相关：
Y＝-1.0428x+7.5152，其中y为以10为底的糖原状α-葡聚糖的分子量的对数，x为麦芽三糖的浓度(mM)。
在一种实施方式中，调节麦芽三糖的浓度为0.03mM～0.6mM。
本发明的有益效果：本发明可通过SP-GP-BE三酶法以蔗糖为底物合成不同疏松程度的糖原状α-葡聚糖(GnG)，通过调整GP与BE的比例可控制GnG的外侧链的疏松程度，从而得到粒径在44nm-54nm的范围内的不同GnG样品，GnG分子的疏松程度随着GP/BE比例的增加而提高。在控制GP/BE的基础上，对反应体系中麦芽三糖的浓度进行调节，随着麦芽三糖浓度的提升，GnG的分子量降低，同时使得GnG分子疏松程度增加。通过本发明的方法可以通过调节GP/BE比例，或调节麦芽三糖的浓度来调节GnG分子的疏松程度。
附图说明
图1为GnG样品的透射电镜图像；
图2为GnG样品的粒径分布；
图3为GnG-1和GnG-5合成过程中不同反应时间的样品溶液；
图4为GnG-1和GnG-5合成过程中不同反应时间的产物分子量分布；
图5为GnG样品的合成过程模型；
图6为GnG样品通过α-淀粉酶联合淀粉葡萄糖苷酶水解后的α-淀粉酶水解率；
图7为GnG样品通过β-淀粉酶水解后的β-淀粉酶水解率；
图8为β-淀粉酶水解前后GnG-1和GnG-5的链长分布；
图9为GP/BE比例为1:400和1:50获得的GnG样品分子结构模型；
图10为麦芽三糖的浓度与GnG的分子量的对数函数的关系；
图11为GP/BE比例为1:400、3:400和1:50时，不同麦芽三糖添加量的GnG样品的分子量分布；
图12为GP/BE比例为1:400且麦芽三糖添加量为0.048mM时的GnG成过程中不同反应时间的产物分子量分布。
具体实施方式
下述实施例中使用的SP克隆自包含8个突变氨基酸(T47S,S62P,Y77H,V128L,K140M,Q144R,N155S,D249G)的Streptococcus mutans的glgA氨基酸序列(GenBank：AAN58596.1)，并在大肠杆菌中进行表达(Fujii K,Iiboshi M,Yanase M,et al.Enhancingthe thermal stability of sucrose phosphorylase from Streptococcus mutans byrandom mutagenesis[J].Journal of Applied Glycoscience,2006,Vol.53(NO.2):91-97.)。SP酶活根据李恬(李恬.蔗糖为底物双酶法合成直链糊精的研究[D].江南大学,2013.)所述的方法进行检测，酶活定义为每分钟从蔗糖中形成1μmol G-1-P所需酶量为1个酶活单位(U)。
GP克隆自Aquifex aeolicus中的glgP氨基酸序列(GenBank：AE000704)，并在大肠杆菌中进行表达(Bhuiyan S H,Rus’d A A,Kitaoka M,et al.Characterization of ahyperthermostable glycogen phosphorylase from Aquifex aeolicus expressed inEscherichia coli[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2003,22(3-4):173-180.)。GP酶活根据Kadokawa(Kadokawa J-i.Enzymatic synthesis of functionalamylosic materials and amylose analog polysaccharides[J].Methods Enzymol,2019,627:189-213.)所述的方法进行检测，酶活定义为每分钟催化G-1-P释放1μmol磷酸盐所需的酶量为1个酶活单位(U)。
BE由诺维信公司提供。BE酶活根据Takata等人(Takata H,Ohdan K,Takaha T,etal.Properties of branching enzyme from hyperthermophilic bacterium,Aquifexaeolicus,and its potential[J].Journal of Applied Glycoscience,2003,50:15-20.)所述的方法进行检测，酶活定义为在660nm波长下，每分钟使直链淀粉-碘配合物的吸光度降低1％所需的酶量为1个酶活单位(U)。
实施例1
在高浓度磷酸盐缓冲液(160mM KH2PO4和240mM Na2HPO4，pH＝7.0)加入240mM蔗糖和0.4mM麦芽三糖(蔗糖与麦芽三糖的摩尔比例为600:1)，55℃下保温20min后首先分别加入5、15、22.5、30和40U/μmol麦芽三糖的GP，在55℃下150rpm震荡反应30min后加入2U/mLSP和2000U/μmol麦芽三糖的BE，在55℃下震荡反应16h。反应结束后，使用2M HCl调节反应混合物的pH至4.5并在100℃加热30min以终止反应。冷却至室温后8000g离心20min，取上清在1kDa透析袋中室温下透析48h后冻干，得到糖原状α-葡聚糖(GnG)样品。
表1
a底物蔗糖与引物麦芽三糖的摩尔比例；
b重均分子量；
c数均分子量。
(1)GnG的分子量
将制备得到的GnG样品溶于超纯水中得到浓度为3mg/mL的样品溶液，并使用0.22μm的滤膜过滤。滤过液使用高效凝胶排阻色谱联用示差检测器和多角度激光检测器(HPSEC-RI-MALLS)进行分析，其中色谱柱为Shodex OHpak SB-805HQ，并以0.1M NaNO3(0.02％NaN3)为流动相在40℃下以0.5mL/min的流速测定其分子量，结果如表1所示：
蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1(麦芽三糖添加量为0.4mM)时，且BE添加量一定的情况下(2000U/μmol麦芽三糖)，通过分别加入5、15、22.5、30和40U/μmol麦芽三糖的GP来改变三酶体系中的GP/BE比例(1:400～1:50)，从而获得GnG-1、GnG-2、GnG-3、GnG-4和GnG-5样品。所有样品的分子量在1.21×107-1.30×107g/mol的范围内，说明GP/BE比例的改变不会改变样品的分子量。且所有样品的Mw/Mn值近于1，都在1.10～1.17范围内，说明产物分子量分布均匀。该结果表明在蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1(麦芽三糖添加量为0.4mM)的前提下，当GP/BE比例在1:400-1:50范围内的改变不影响产物GnG的分子量分布。
(2)GnG的形态
将GnG样品溶于超纯水中制得浓度为0.1mg/mL的样品溶液，将GnG溶液液滴置于300目碳膜上，用定性滤纸将过量的液体吸干，然后使用2％(w/v)的磷钨酸负染染色液染色1min后吸取多余染剂。待碳膜干燥后使用透射电子显微镜观察，结果如图1所示：
由图可见GP/BE比例的在1:400-1:50范围内的改变，样品的形态未发生变化，负染后的透射电镜图像显示GnG样品呈均匀球状。该结果表明在蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1(麦芽三糖添加量为0.4mM)的前提下，当GP/BE比例在1:400-1:50范围内的改变不影响产物GnG分子的微观形态。
(3)GnG的平均链长和粒径
将4mg GnG样品溶于2mL 50mM醋酸钠缓冲液中(pH 4.5)，加入1U异淀粉酶和1.8U普鲁兰酶在42℃下脱支24h。沸水浴加热10min灭酶后在5000g离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤。脱支产物在0.5mL/min流速下使用高效阴离子交换色谱联用脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)进行聚合度分析。并将GnG样品溶于超纯水中形成浓度为10mg/mL的样品溶液，使用广角动静态激光光散射仪对其粒径进行分析，结果如图2和表2所示：
随着GP/BE比例的增加，GnG样品的平均链长由7.40提高到9.02。此外流体动力学半径从22.03nm增加到27.06nm。且随着粒径的增加，粒径分布变宽。结果表明，在蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600：1(麦芽三糖添加量为0.4mM)的前提下，随着GP/BE的比例在1:400-1:50范围内的增加，GnG的分子平均链长增加，且粒径增加。
表2
a平均链长；
b流体动力学半径±半径的分布宽度。
实施例2：反应时间对GnG合成的影响
(1)不同反应时间GnG样品的制备
在高浓度磷酸盐缓冲液(160mM KH2PO4和240mM Na2HPO4，pH＝7.0)加入240mM蔗糖和0.4mM麦芽三糖(蔗糖与麦芽三糖的摩尔比例为600:1)，55℃下保温20min后首先分别加入5U/μmol麦芽三糖和40U/μmol麦芽三糖的GP，在55℃下150rpm震荡反应30min后加入2U/mL的SP和2000U/μmol麦芽三糖的BE，在55℃下震荡反应。在此过程中每隔2h取10mL的反应混合物，使用2M HCl调节反应混合物的pH至4.5并在100℃加热30min以终止反应。冷却至室温后8000g离心20min，取上清在1kDa透析袋中室温下透析48h，结果如图3所示：
随着反应时间的增加，GnG样品的溶解度增加。在4h内，GnG-5比GnG-1产生更多的不溶性物质。反应4h后，溶液呈均匀乳白色，且随着反应时间的延长，GnG-1样品乳白色加深，而GnG-5的乳白色变浅。而GnG的分子越大，其水溶液乳白色就越深。说明在合成过程中GnG-1的样品具有分子量增加的趋势，而GnG-5样品出现了分子量先增加后降低的趋势。GnG水溶液颜色变化的差异表明，在GnG-1和GnG-5合成过程中存在具有不同精细结构的中间产物。
(2)不同反应时间GnG样品的分子量
将透析后的GnG合成过程中间产物冻干后溶于超纯水中得到浓度为3mg/mL的样品溶液，并使用0.22μm的滤膜过滤。滤过液使用HPSEC-RI-MALLS进行分析，其中色谱柱为Shodex OHpak SB-805HQ，并以0.1M NaNO3(0.02％NaN3)为流动相在40℃下以0.5mL/min的流速进行分子量分布分析，结果图4所示：
反应4h内，GnG-1和GnG-5的合成过程中间产物均呈多峰分布。与GnG-1相比，GnG-5合成过程中间产物具有更大的分子量。随着反应的继续样品的分布均变为单峰分布。然而在反应4h后，GnG-1和GnG-5样品的分子量变化呈现不同的趋势。由图4A所示，GnG-1样品的分子量从6.147×106到1.214×107g/mol。而图4B中可以看到，GnG-5的分子量由1.615×107下降到1.205×107g/mol。该结果说明，在蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1(麦芽三糖添加量为0.4mM)的前提下，当GP/BE比例为1:400时其合成过程中产物分子量由小到大变化，而GP/BE比例为1:50时的产物分子量出现了由大到小的变化。
(3)不同反应时间GnG样品的链长分布
将4mg冻干后的GnG合成过程中间产物溶于2mL 50mM醋酸钠缓冲液中(pH 4.5)，加入1U异淀粉酶和1.8U普鲁兰酶在42℃下脱支24h。沸水浴加热10min灭酶后在5000g离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤。脱支产物在0.5mL/min流速下使用HPAEC-PAD进行链长分布分析，结果如表3所示：
随着反应时间的增加，GnG-1样品中DP<15的链比例从60.61％显著增加至92.20％。而在反应2h时的GnG-5脱支产物中DP<15的短链高达到91.88％，说明在GnG-5的合成过程中首先产生了短支链葡聚糖作为后续反应的核心。此外，由于GP/BE比例的不同导致的合成过程的差异，GnG-5终产物中DP 15-30链的比例(10.40％)高于GnG-1中的比例(7.25％)，说明蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1(麦芽三糖添加量为0.4mM)的前提下，GP/BE比例为1:400时可以获得的GnG具有更高比例的短链。
表3
(4)不同反应时间GnG样品的分支度
将GnG样品溶于D2O中，在60℃下采用1H NMR测定了GnG的分支度，结果如表4所示：
由表可知，GnG-1和GnG-5的分支度随反应时间显著增加。GnG-1反应8h后，随着产物分子量的增加，其分支度没有继续增加，这与GnG-5分支度持续增加的趋势不同。表明在GnG-1合成后期(8h后)其链延长速度与分支速度相同，且没有继续对原有分支进行进一步修饰；与其相比，GnG-5的样品在酶促过程中首先形成了分子量较高但分支度较低的支链淀粉状葡聚糖，然后通过对其不断的水解和分支修饰从而形成终产物GnG-5。
表4
(5)GnG合成模型构建
根据以上数据构建了GP/BE比例为1:400时(GnG-1)和1:50(GnG-5)的合成过程模型，结果如图5所示：
首先，通过GP作用将引物延长为长(α1→4)链，利用BE将其转化为短支链葡聚糖作为GnG的核心。其次，随着GP与BE比例的变化，GnG的合成可分为：(A)小到大和(B)大到小两种趋势。在由GP/BE比例为1:400形成的“小→大”合成路径中，BE催化具有少量分支的长链裂解，并通过(α1→6)键的形式将裂解产物连接到核心短支链葡聚糖上，以扩大其尺寸。最终，随着短支链葡聚糖分子量的不断增长，生成GnG-1。在另一种合成路径中(GP/BE比例为1:50)，最初形成的短支链葡聚糖上的部分分支首先被延长形成支链淀粉状葡聚糖。随后，随着BE不断在不同分子量的支链淀粉状葡聚糖之间引入分支点，使得产物分子量降低，形成GnG-5。
实施例3：GnG的精细结构分析
(1)α-淀粉酶水解率分析
使用150U/mLα-淀粉酶和80U/mL淀粉葡萄糖苷酶在37℃下酶解GnG样品(10mg/mL，溶于0.2M柠檬酸钠缓冲液，pH 5.2，1mM CaCl2)。分别在0、5、10、20、30、40、50、60、90和120min收集反应产物，加入9体积无水乙醇终止反应并在10000g离心5min。其反应过程中的葡萄糖释放量由GOPOD试剂盒测定。α-淀粉酶水解率由以下公式计算所得，其中Gt为t min时的葡萄糖释放量，G0为0min时的初始葡萄糖含量，S为GnG样品质量，结果如图6所示：
在前20min内，随着GP/BE比例的增加，样品初始α-淀粉酶水解速率增加。20min后，GnG-1和GnG-2具有稳定的葡萄糖释放速度。在20～40min内，随着GP/BE的增加，GnG-4和GnG-5的α-淀粉酶水解速率略有下降。其中GnG-5的最终水解率超过66.16％，而GnG-1的最终水解率仅为54.20％。由体外消化结果可以看出，随着GP/BE比值的增加，GnG相邻分支之间的距离增加，GnG的侧链分布更为松散。
(2)β-淀粉酶水解率分析
将冻干后的GnG终产物溶于20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)配制成4mg/mL的溶液。取一部分溶液以0.25U/mg GnG的比例添加β-淀粉酶在30℃下消化。分别在0、10、30、60、90、120、240、480和1440min收集反应产物并加入2倍体积的无水乙醇灭活酶，10,000g离心5分钟后取上清液使用DNS法测还原糖释放量。取2mL相同GnG溶液加入相同比例的β-淀粉酶和1.8U普鲁兰酶在30℃下水解1440min，加入3倍体积无水乙醇灭活酶，10,000g离心5分钟后取上清液使用DNS法测总还原糖释放量。β-淀粉酶水解率由以下公式计算所得，其中Mt为tmin时的麦芽糖释放量，M0为0min时的初始还原糖量，TM为总还原糖释放量，结果如图7和图9所示。
GnG样品的β-淀粉酶水解率在16.75％-29.53％范围内。当GP/BE比值为1:400时获得的GnG-1具有最高的β-淀粉酶水解率(29.53％)。此外GnG-1水解的麦芽糖在120min内释放最快，说明降低GP/BE比值获得的GnG颗粒具有更多的可被β-淀粉酶修剪的A链。
(3)β-淀粉酶水解产物的链长分布
将β-淀粉酶水解产物在室温下使用截留量为1kDa的透析袋透析48h后冻干，获得β-淀粉酶水解产物(β-GnG)。将4mgβ-GnG溶于2mL 50mM醋酸钠缓冲液中(pH 4.5)，加入1U异淀粉酶和1.8U普鲁兰酶在42℃下脱支24h。沸水浴加热10min灭酶后在5000g离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤。脱支产物在0.5mL/min流速下使用HPAEC-PAD进行链长分布分析，如图8和图9所示：
经β-淀粉酶降解后，样品分子中DP>10的链的比例均下降，但与β-GnG-1相比，β-GnG-5中DP 5-7的链比例明显增加，其链长分布与GnG-5相比发生了更加显著的变化，这意味着GnG-5分支点之间的间距更宽，其具有更多可以被部分修剪的B链，说明GnG-1的结构比GnG-5具有更加致密的精细结构。
(4)GnG分子的结构模型
根据上述结果，我们建立了不同GP/BE比值获得的GnG结构模型，如图9所示：
GnG分子在核心位置具有最密集的分支。SP和GP会优先促进外部链的成长，而留下许多未完成的内部链，因此，较低的延长速率(降低GP/BE)有利于最终产物的均匀性。此外，可以通过固定BE量(活性)和调节GP的量(活性)来控制GnG外链的分布密度。在相对分子质量相同的情况下，高GP/BE比例(GP/BE＝1:50)的产物外部结构更松散，外链更长，导致颗粒直径增大；也可以增加其α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶的消化率，从而获得不同消化性的产物。
实施例4：麦芽三糖的添加量对GnG分子的疏松程度的影响
在高浓度磷酸盐缓冲液(160mM KH2PO4和240mM Na2HPO4，pH＝7.0)加入240mM蔗糖和0.6，0.4，0.24，0.048和0.03mM麦芽三糖，55℃下保温20min后首先分别加入40U/μmol麦芽三糖GP，在55℃下150rpm震荡反应30min后加入2U/mL SP和2000U/μmol麦芽三糖BE(GP/BE比例为1:50)，在55℃下震荡反应16h。反应结束后，使用2M HCl调节反应混合物的pH至4.5并在100℃加热30min以终止反应。冷却至室温后8000g离心20min，取上清在1kDa截留分子量的透析袋中室温下透析48h后冻干，得到不同分子量的糖原状α-葡聚糖(GnG)样品。将透析后的GnG合成过程中间产物冻干后溶于超纯水中得到浓度为3mg/mL的样品溶液，并使用0.22μm的滤膜过滤。滤过液使用HPSEC-RI-MALLS进行分析，其中色谱柱为Shodex OHpakSB-805HQ，并以0.1M NaNO3(0.02％NaN3)为流动相在40℃下以0.5mL/min的流速进行分子量分布分析，结果图10所示：
当蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1(麦芽三糖添加量为0.4mM)且GP/BE比例为1:50时，可以获得具有疏松结构的GnG分子，因此在该GP/BE比例基础上，恒定蔗糖摩尔浓度为240mM，可以通过改变麦芽三糖的摩尔浓度(0.03mM～0.6mM)获得具有单分散性的不同分子量的GnG(7.8×106～3.2×107g/mol)。其分子量的对数函数值(lgMw)与麦芽三糖的摩尔浓度呈线性负相关，疏松的链分布有利于GnG分子量的增加。蔗糖浓度一定时(240mM)，当麦芽三糖的摩尔浓度继续下降时样品分子量不再增加，密集的分支产生的空间位阻使得分支酶无法作用，说明蔗糖浓度一定(240mM)的情况下，麦芽三糖添加量的降低也会降低GnG分子的链疏松程度。
综上所述，在蔗糖与麦芽三糖摩尔比例为600:1时，改变GP的添加量可以通过SP、GP和BE三酶的协同作用获得一系列分子量相近但粒径不同的糖原状α-葡聚糖。观察到将GP/BE比例从1:400增加至1:50使得糖原状α-葡聚糖的合成过程中出现两种合成趋势：“由小到大”和“由大到小”。在GP/BE比例为1:400时，其合成途径为“由小到大”，该过程制备的糖原状α-葡聚糖具有均匀致密的结构。与其相比，GP/BE比例为1:50时形成的“由大到小”的合成途径，产生的糖原状α-葡聚糖具有更长的侧链和松散外部结构，在此基础上改变麦芽三糖的添加量以改变蔗糖与麦芽三糖摩尔比例可以获得不同分子量的GnG。因此发现通过梯度改变GP/BE比例，可以获得具有不同外部疏松程度的糖原状α-葡聚糖，为进一步定制功能化衍生物提供了可能。
对比例1
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将GP的添加量分别修改为5U/μmol麦芽三糖(GP与BE的比例为1:400)和15U/μmol麦芽三糖(GP与BE的比例为3:400)，结果如图11所示：
与GP/BE比例为1:50时的合成产物相比，在GP/BE比例为1:400和3:400时，麦芽三糖的添加量≤0.048mM时，GnG样品不再呈现单峰分布。此外当麦芽三糖的添加量≥0.24mM时，在相同麦芽三糖添加量下，使用GP/BE比例为1:50制得的样品由于具有较为松散的外链可以获得具有更高分子量的GnG样品。而当GP/BE比例为1:400和3:400时，麦芽三糖的摩尔浓度为0.24mM时，在分子紧密的外链的阻碍下，产物GnG分子量分别为1.37×107g/mol和1.49×107g/mol低于GP/BE比例为1:50时相同蔗糖与麦芽三糖比例下获得的GnG(1.96×107g/mol)。
对比例2
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将麦芽三糖的添加量修改为0.048mM，将GP的添加量修改为5U/μmol麦芽三糖(GP/BE的比例为1:400)，结果如图12所示：
对麦芽三糖的添加量为0.048mM时的中间合成产物的分子量进行分析，发现在反应4h内样品呈现单峰分布，随着其分子量增加到一定程度，逐渐出现右峰，且该峰随反应时间的不断延长逐渐左移(分子量增加)，而左峰分子量稳定。因此双峰的出现是由于密集外链的空间位阻作用，阻止了BE继续作用与外侧链，而在SP持续作用下剩余的G-1-P，使得GP和BE重新作用于新的引物分子合成新的产物。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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