硒原子修饰在降低dNTP亲和力和DNA解链温度中的应用
阅读说明：本技术 硒原子修饰在降低dNTP亲和力和DNA解链温度中的应用 (Application of selenium atom modification in reducing dNTP affinity and DNA melting temperature ) 是由 黄震 罗光成 张军 于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种硒原子修饰在降低dNTP亲和力和DNA解链温度中的应用,采用硒原子修饰的dNTP(即硒代磷酸dNTP,dNTPαSe)作为反应底物,用以直接降低dNTP与DNA聚合酶之间的亲和力,以及降低产物DNA的Tm值,从而提升了DNA聚合反应的准确性。本发明不额外添加外源性化合物、不改变反应步骤、不增加反应体系复杂程度的前提下,仅通过对dNTP进行硒修饰即可实现dNTP亲和力的降低和产物DNA的Tm值降低。(The invention discloses an application of selenium atom modification in reducing dNTP affinity and DNA melting temperature, wherein dNTP (namely selenophosphoric acid dNTP, dNTP alpha Se) modified by selenium atoms is used as a reaction substrate to directly reduce the affinity between the dNTP and DNA polymerase and reduce the Tm value of product DNA, thereby improving the accuracy of DNA polymerization reaction. According to the invention, the reduction of dNTP affinity and the Tm value of product DNA can be realized only by selenium modification of dNTP on the premise of not additionally adding an exogenous compound, not changing reaction steps and not increasing the complexity of a reaction system.)
技术领域
本发明属于分子生物学
技术领域
，具体涉及硒原子修饰在降低dNTP亲和力和DNA解链温度中的应用。背景技术
核酸扩增技术是生命科学领域应用最为广泛的生物技术之一，在科学研究、疾病诊断和传染病防控方面都起着重要作用。无论的体内遗传物质复制，还是体外DNA扩增，其基本反应步骤都是是DNA聚合反应。DNA聚合反应在体内具有很高的准确性，细菌系统和哺乳动物系统的错误率分别为5×10-10和5×10-11。然而，体外DNA聚合反应的准确性下降了4-5个数量级，如polα、polδ、polε和pol III等聚合酶在体外的错误率在10-4到10-5之间。导致这一现象的原因是体外的反应环境发生了巨大变化，且缺乏修复系统。聚合酶准确度的降低将导致体外DNA扩增反应的非特异性扩增风险增加，这为开发高性能核酸检测技术带来巨大挑战。
为了提高体外DNA聚合反应的特异性，PCR添加剂和化学修饰核苷酸被广泛应用于核酸检测技术中。PCR添加剂一般为低分子化合物，如甜菜碱、二甲亚砜(DMSO)和甲酰胺等。这些PCR添加剂可以降低核酸的解链温度(Tm)，以及作为物理屏障阻碍了核酸之间的杂交，从而增强了PCR反应的特异性。另一种提高检测性能的策略是使用化学修饰的核苷酸，如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、AEGIS核苷酸和2-硒胸腺嘧啶等。这些修饰核苷酸具有减少DNA链之间的静电排斥，或增加碱基配对准确性的功能，从而改变核酸扩增技术的分析性能。
有关聚合酶结构功能的既往研究表明：DNA聚合反应的准确性与dNTP识别、聚合速率和错配校正等密切相关。dNTP识别是保障聚合反应准确性的重要环节，该环节由DNA聚合酶的手指结构域完成。正确配对的dNTP与聚合酶手指结构域具有较高的亲和力而被聚合到引物上，错误配对的dNTP因结合较弱而被聚合酶手指结构域剔除。因此，dNTP与聚合酶之间的亲和力，即dNTP亲和力，是影响DNA聚合反应准确性的关键因素。此外，DNA的解链温度(Melting temperature,Tm)也是影响DNA聚合反应准确性的又一关键因素，且降低核酸Tm值也有望提高DNA聚合反应准确性。众所周知，提高PCR的退火温度可以促进双链DNA解链，从而减少非特异性杂交的产生和增强PCR的特异性。这提示，当反应温度不变的情况下，降低双链DNA的Tm值，也许可以减少非特异性杂交的产生和增强PCR的特异性。基于上述理论基础，故我们提出假设：适当降低dNTP的亲和力和DNA的Tm值，可以增强其体外DNA聚合反应的准确性。
现有技术通过添加甜菜碱来降低DNA的Tm值并增加扩增反应特异性，一般情况下，富含AT的DNA序列比GC富集区DNA的溶解温度更低。因此，这种不同碱基序列间的热稳定性差异使得不同DNA序列具有完全不同的Tm值。然而，高浓度的甜菜碱能消除DNA碱基序列差异对Tm值的影响，并使DNA的Tm值降低，尤其是富含GC的DNA。但是为增加DNA扩增反应的准确性，甜菜碱常作为外源性添加剂添加到反应缓冲液中，这明显增加了扩增体系的复杂程度，也明显降低了DNA扩增反应的扩增效率。而且甜菜碱的功能单一，甜菜碱只能降低DNA的Tm值，而不能降低底物(dNTP)与DNA聚合酶之间亲和力。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提出一种通过硒原子修饰降低dNTP亲和力和DNA Tm值的技术方案，不额外添加外源性化合物、不改变反应步骤、不增加反应体系复杂程度的前提下，仅通过对dNTP进行硒修饰即可实现dNTP亲和力的降低和产物DNA的Tm值降低。
为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了硒代磷酸修饰在降低dNTP与DNA聚合酶亲和力中的应用。
本发明采用硒原子修饰的dNTP(即硒代磷酸dNTP，dNTPαSe)作为反应底物，用以直接降低dNTP与DNA聚合酶之间的亲和力。
所述聚合酶为DNA聚合酶，也包括具有逆转录功能的聚合酶。
同时，当dNTPαSe被聚合成Se-DNA后，Se-dsDNA的Tm值较相同序列的天然dsDNA更低。
因此，硒代磷酸修饰可用于降低DNA解链温度，以提高DNA聚合反应的准确性。
dNTPαSe增加DNA聚合反应准确性的机制如下图1所示。当以天然dNTP为底物时，由于天然dNTP与聚合酶的亲和力高，即使在引物-模板存在错配的情况下，dNTP也能被快速地聚合到错配引物上，从而导致非特异性扩增。当以dNTPαSe为底物时，由于它与聚合酶的亲和力相对较低，当引物-模板存在错配时，dNTPαSe难以被聚合到错配引物上，从而避免非特异性扩增的发生。然而，对于引物-模板完全匹配的情况，尽管dNTPαSe与聚合酶的亲和力有所降低，但聚合反应仍能顺利进行。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种通过硒代磷酸修饰降低dNTP和DNA亲和力，以及降低DNA解链温度的技术方案，与天然dNTP相比，dNTPαSe与DNA聚合酶的亲和力明显降低(约660倍，dNTPKd＝1.51×10-3M and dNTPαSe Kd＝9.90×10-5M)。与相应的天然DNA相比，Se-DNA与DNA聚合酶的亲和力降低了2.8倍(DNA Kd＝3.46×10-3M and Se-DNA Kd＝9.76×10-3M)。此外，Se-DNA双链的稳定性(Tm值)也远低于相应的天然dsDNA。在上述因素的共同作用下，DNA聚合反应的准确性明显增加，从而使DNA扩增反应的特异性明显增加。
附图说明
图1是本发明.dNTPαSe增加DNA聚合反应准确性的机制；
图2是本发明硒代磷酸修饰对dNTP、DNA亲和力的影响；
图3是本发明Se-dsDNA和dsDNA的Tm分析；
图4是本发明SEA在含有高浓度背景DNA的情况下扩增HPV16-DNA；A、实时荧光扩增曲线图；B、A中扩增产物的凝胶电泳分析；
图5是本发明LAMP检测含大量背景DNA的样本时出现非特异性扩增；A、实时荧光监测LAMP扩增反应；B、LAMP扩增产物的凝胶电泳分析。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1等温滴定分析硒代磷酸修饰对dNTP、DNA亲和力的影响
采用ITC法分析天然dNTP、天然DNA、dNTPαSe、Se-DNA与Bst DNA polymerase的亲和力。ITC分析时，将上述材料溶解于1×Isoth ermal Amplification Buffer，并用dNTP、DNA、dNTPαSe、Se-DNA来滴定Bst DNA聚合酶。Bst DNA聚合酶(15μM)添加到ITC200等温滴定仪的样品池，天然dNTP、天然DNA、dNTPαSe、Se-DNA(150μM)添加到ITC200等温滴定仪的注射器中，滴定反应在25℃的条件下进行。
结果发现(图2A和2B)：天然dNTP与DNA聚合酶之间具有很高的亲和力(Kd:1.51×10-7M)，而dNTPαSe与DNA聚合酶之间的亲和力相对较弱(Kd:9.90×10-5M)。经过聚合反应，dNTPαSe被聚合成Se-DNA后，进一步研究发现(图2C和2D)：Se-dsDNA(Kd＝9.76×10-3M)与DNA聚合酶的亲和力也明显低于天然dsDNA(Kd＝3.46×10-3M)。这些结果表明：硒代磷酸修饰明显降低了dNTP、DNA与DNA聚合酶之间的亲和力。
实施例2溶解曲线法分析硒代磷酸修饰对DNA的Tm值影响
根据dsDNA受热解链的基本热力学性质，本研究采用荧光染料法(SYBR Green I)来分析天然dsDNA和Se-dsDNA的Tm值。该实验在96系统上进行，即将温度从55℃升高到95℃(0.07℃/s)。在温度变化过程中，通过连续监测荧光变化得到熔解曲线和Tm值。
天然dsDNA直接由上海生工生物技术有限公司合成，其正义链序列为：5’-tctgaagtagatatggcagcacatagttactgttgttgatactacacg-3’。Se-dsDNA通过酶促合成获得(以dNTPαSe为底物)。其中，反义链Se-DNA通过以下方式获得：通过生工公司合成3’端磷酸终止的天然正义链DNA作模板，然后用一条5’端带多聚T的寡聚核苷酸作引物，在DNA聚合酶的催化下酶促合成反义链Se-DNA(引物序列：5’-tttttttt-cgtgtagtat-3’)；然后用12％的变性PAGE电泳分离纯化Se-DNA(其5’端因带有多聚T而泳动较慢)。正义链的Se-DNA用同样的方式获得。最后，将正、反义链的Se-DNA混合到一起制备出Se-dsDNA。
通过荧光染料溶解曲线法分析了硒代磷酸修饰对DNA溶解温度的影响。结果如图3所示：当dNTPαSe被聚合成Se-DNA后,Se-dsDNA的Tm值较相同序列的天然dsDNA更低(Se-dsDNA,61.9℃；天然dsDNA 70.5℃)。
实施例3对DNA聚合反应准确性和特异性的影响
由于dNTPαSe可以明显降低dNTP亲和力，以及降低DNA的Tm值，因此dNTPαSe具有增加DNA聚合反应准确性和特异性的潜能。为验证dNTPαSe这种潜能，采用LAMP等温扩增技术(当样本存在大量背景DNA时，极易发生非特异性扩增)为例子进行实验验证。将基于dNTPαSe的LAMP技术命名为：硒核苷酸增强型高特异性核酸扩增技术(Selenium-dNTP-enhancedspecific amplification,SEA)。
按照LAMP扩增原理，针对待测靶分子(本实施方案以检测HPV16-DNA为例)设计并合成引物，采用在线软件进行引物设计(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)。引物通过上海生工生物技术有限公司合成，然后配制成引物混合物，该混合物中各组分的浓度为：16μM的正向内部引物(FIP)、16μM的反向内部引物(BIP)、2μM的正向外部引物(F3)和2μM的反向外部引物(B3)。SEA和LAMP的引物组成完全相同。
配制底物混合物：底物混合物由dNTP(包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和dNTPαSe(包括dATPαSe、dTTPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe)组成，dNTPαSe在该底物混合物中的占比从5-50％不等。该混合物中，(dATP+dATPαSe)的浓度为2.5mM，(dTTP+dTTPαSe)的浓度为2.5mM，(dCTP+dCTPαSe)的浓度为2.5mM，(dGTP+dGTPαSe)的浓度为2.5mM。
配制SEA扩增缓冲液(2×)：40mM Tris-HCl(pH 8.8)、20mM(NH4)2SO4、100mM KCl、16mM MgSO4、1％Tween 20、2.5mM dNTP/dNTPαSe混合物、1.6M甜菜碱、和10,000×SYBRGreen I。LAMP扩增缓冲液除了以天然dNTP为底物外，其余成分与SEA扩增缓冲液完全一致。
按如下方式配制SEA反应体系，以20μL反应体系为例：10μL SEA扩增缓冲液(2×)、2μL引物混合物、1μL Bst 2.0DNA聚合酶(8U/μL)、待测模板，然后补ddH2O至20μL。样本检测时，同时设置阳性对照和阴性对照。
将配制好的反应体系放置于荧光恒温仪65℃恒温孵育120分钟，并实时监测反应体系的荧光变化(每分钟采集一次荧光信号)。
SEA扩增HPV16-DNA：临床样本往往含有大量的背景DNA，从而增加非特异性扩增的风险。为模拟真实临床样本检测，本实施方案在20微升的反应体系中添加了200ng的大肠杆菌基因组DNA作为背景。
结果显示：即使在含有高浓度背景DNA的情况下，SEA仍保持了良好的扩增效果，如下图4所示，其阳性对照仍表现为典型的“S型”扩增曲线，其阴性对照仍然在120分钟内无明显扩增(图4A)。其扩增产物电泳分析仍显示阳性对照具有阶梯样的特异性扩增产物，阴性对照无明显扩增产物(图4B)。
LAMP扩增HPV16-DNA：与SEA的扩增条件一致，在实施LAMP扩增时，在20微升的反应体系中添加了200ng的大肠杆菌基因组DNA作为背景。结果如下图5所示，当反应体系中存在大量背景DNA的情况下，基于天然dNTP的LAMP技术出现了非特异性扩增。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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<110> 纽奥维特（成都）生物科技有限公司
硒瑞恩特生物科技（成都）有限公司
<120> 硒原子修饰在降低dNTP亲和力和DNA解链温度中的应用
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctgaagtag atatggcagc acatagttac tgttgttgat actacacg 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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