具体实施方式

通过附图和以下相关的优选实施方案，可以容易地理解上述的本发明的目的、其它目的、特征和优点。但是，本发明并不限于以下说明的实施方案，而是可以实现为其它实施方案。提供以下描述的实施方案的目的在于，使公开内容充分且完整，并向本领域技术人员充分传达本发明的思想。

在本说明书中，应理解“包含”、“包括”或“具有”等术语用于指定说明书中记载的特征、数字、步骤、动作、构成要素、部件或它们的组合的存在，而并不预先排除一个或一个以上的其它特征或数字、步骤、动作、构成要素、部件或它们的组合的存在或附加可能性。

除非另有说明，表示本说明书中使用的成分、反应条件、聚合物组合物和配制物的量的所有数字、值和/或表述在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰，这是因为这种数字本质上是反映从其它获得这种值时出现的测量的各种不确定性的近似值。此外，本说明书中公开数值范围时，这种范围是连续的，并且除非另有说明，包括从这种范围的最小值到包括最大值在内的所述最大值的所有值。此外，这种范围指整数时，除非另有说明，包括从最小值到包括最大值在内的所述最大值的所有整数。

以下，对本发明的制备化妆料组合物的方法和包含幼苗人参发酵物的化妆料组合物进行详细说明。

根据上述的一个实施方案制备的化妆料组合物包含幼苗人参发酵物作为有效成分，优选地，所述幼苗人参发酵物可以利用乳酸菌使幼苗人参提取物发酵而获得。本发明的所述幼苗人参是常规的幼苗人参，通常是栽培1-2年的人参，与根相比，叶和茎中含有约7-8倍的皂苷成分，由于水耕栽培、全年均可生产和栽培时间的缩短，与以往利用的根人参相比，具有价格低的优点，因此只要是易于用作人参加工品的原料，则没有特别限制。此外，只要所述幼苗人参中包含如下的皂苷，则没有特别限制，所述皂苷影响中枢神经系统、内分泌系统、免疫系统、代谢系统等，对身体调节功能发挥各种效果，除此之外，所述皂苷具有以下药理作用，如脂肪分解能力强，促进营养物的吸收和消化，通过细胞内的酶活化促进新陈代谢，通过增加能量来恢复体力，改善疲劳、虚弱和食欲不振，促进血清蛋白合成等效果。

所述幼苗人参提取物、幼苗人参发酵物和乳酸菌可以与下述制备方法中说明的内容相同或不同。

在100重量％的化妆料组合物中，本发明的所述幼苗人参发酵物的含量可以为0.001-60重量％，优选可以为0.5-10重量％。当幼苗人参发酵物的含量小于0.001重量％时，存在抗氧化、皮肤保湿或改善皱纹等功效可能会降低的缺点，当幼苗人参发酵物的含量超过60重量％时，存在可能会产生毒性的缺点。

本发明的化妆料组合物可以制成本领域中通常制备的任何剂型，例如，可以配制成溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、面霜、润肤露、粉剂、肥皂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳状粉底、蜡状粉底和喷雾剂等，但并不限定于此。更详细地，本发明的化妆料组合物可以制成柔肤化妆水、营养化妆水、营养面霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁面水、面膜、喷雾剂或粉剂的剂型。

作为对本发明的化妆料组合物中含有的化妆料有效的载体，可以根据剂型利用本领域中通常利用的载体。

当本发明的剂型是糊剂、面霜或凝胶时，作为载体成分，可以利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌等。

当本发明的剂型是粉剂或喷雾剂时，作为载体成分，可以利用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，特别地，当本发明的剂型是喷雾剂时，可以进一步包含推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

当本发明的剂型是溶液或乳浊液时，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳浊剂，例如有水、丁二醇、己二醇、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇(1,3-butyl glycol)油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或失水山梨醇脂肪酸酯。

当本发明的剂型是悬浮液时，作为载体成分，可以利用水、乙醇或丙二醇等液相的稀释剂，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨醇酐酯等悬浮剂，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂或黄芪胶等。

当本发明的剂型是含有表面活性剂的清洁剂时，作为载体成分，可以利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

本发明的化妆料组合物的剂型优选可以选自溶液、乳浊液、悬浮液和它们的组合。

本发明的化妆料组合物中包含的成分除了包括有效成分和载体成分之外，还包括化妆料组合物中通常利用的成分，例如可以包括抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料等常规的助剂。

图1是示出本发明的制备化妆料组合物的方法的流程图。参考图1，所述制备化妆料组合物的方法包括：准备幼苗人参的步骤S10，对所述幼苗人参进行提取以获得幼苗人参提取物的步骤S20，将所述幼苗人参提取物进行过滤的步骤S30，以及利用乳酸菌使过滤的所述幼苗人参提取物发酵以获得幼苗人参发酵物的步骤S40。

所述准备幼苗人参的步骤S10是粉碎幼苗人参以更容易地对幼苗人参进行提取的步骤。所述幼苗人参可以与所述化妆料组合物中说明的内容相同或不同。

将准备的所述幼苗人参进行粉碎的步骤不受特别限制，只要是用于获得提取物的常规的粉碎方法即可。但是，为了有效地对幼苗人参进行提取，可以将幼苗人参以10-55℃进行干燥后粉碎。当干燥温度小于10℃时，不能充分干燥幼苗人参，当干燥温度超过55℃时，存在有效成分被破坏的缺点。

所述获得幼苗人参提取物的步骤S20是对幼苗人参进行提取以获得幼苗人参提取物并为了使所述幼苗人参提取物发酵而准备的步骤。所述幼苗人参提取物不受特别限制，只要是用于获得幼苗人参发酵物的常规的幼苗人参提取物即可，可以包含选自热水提取物、溶剂提取物和它们的组合中的提取物。

用于获得所述热水提取物的热水提取方法可以包括以下步骤：相对于准备的所述幼苗人参，加入8-22倍体积的纯净水，优选加入18-22倍体积的纯净水；以及在50-90℃下，对加入所述纯净水的幼苗人参进行提取1-3小时。此外，当热水提取时间小于1小时时，无法充分提取有效成分，因此存在无法充分显示出功效的缺点，当热水提取时间超过3小时时，与投入的时间相比，提取效率不高，因此存在不经济的缺点。此外，当热水提取温度小于50℃时，存在无法完全提取有效成分的缺点，当热水提取温度超过90℃时，存在有效成分被破坏的缺点。

用于获得所述溶剂提取物的溶剂提取方法不受特别限制，只要是用于获得溶剂提取物的常规的提取方法即可。所述溶剂可以包含选自发酵酒精、乙醇、甲醇、丁醇、丙醇、乙酸乙酯、异戊二醇、甘油、乙二醇、丙二醇、丁二醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、丙酮、乙腈、石油醚、二乙醚和它们的组合中的溶剂，优选可以为水。

所述将幼苗人参提取物进行过滤的步骤S30是将提取的所述幼苗人参提取物进行过滤以成为利用乳酸菌进行发酵的状态的步骤。本发明的过滤不受特别限制，只要是用于过滤提取物的常规的过滤方法即可。优选地，为了利用乳酸菌有效地发酵，滤纸可以为0.20-0.50μm，更优选地，滤纸可以为0.45μm。当滤纸小于0.20μm时，存在发酵代谢产物会消失的缺点，当滤纸超过0.50μm时，可能会残留菌。

所述获得幼苗人参发酵物的步骤S40是利用乳酸菌使过滤的所述幼苗人参提取物发酵以获得幼苗人参发酵物的步骤。本发明的发酵方法不受特别限制，只要是常规的提取物的发酵方法即可，但是，优选地，为了提高抗氧化活性效果、皮肤保湿效果或改善皱纹的效果，相对于100重量份的幼苗人参提取物，可以加入0.1-1.5重量份的乳酸菌并在35-39℃下发酵3-5天，优选地，相对于100重量份的幼苗人参提取物，可以加入1.0重量份的乳酸菌并在37℃下发酵3-5天，以获得幼苗人参发酵物。当所述乳酸菌的含量小于0.1重量份时，存在发酵率降低的缺点，当所述乳酸菌的含量超过1.5重量份时，存在过度发酵的缺点。此外，当发酵温度小于35℃或超过39℃时，存在乳酸菌的存活率降低的缺点。此外，当发酵时间小于3天时，存在发酵代谢产物的含量少的缺点，当发酵时间超过5天时，由于过度发酵，存在可能会成为发酵醋的缺点。

所述发酵中使用的乳酸菌是可以使幼苗人参提取物发酵而获得具有优异的抗氧化活性效果、皮肤保湿效果或改善皱纹的效果的幼苗人参发酵物的常规的乳酸菌，例如，所述乳酸菌可以是选自乳杆菌(Lactobacillus)属、双歧杆菌(Bifidobacterium)属和链球菌(Streptococcus)属中的一种以上的菌株。

所述乳杆菌属菌株包含鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、融合乳杆菌(L.confusus)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、干酪乳杆菌(L.casei)等，所述双歧杆菌属菌株包含短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)等，所述链球菌属菌株包含粪链球菌(Str.faecalis)、嗜热链球菌(Str.thermophilus)等。

所述乳酸菌并不限定于特定的乳酸菌，但优选为可以最有效地向幼苗人参赋予优异的抗氧化活性效果、皮肤保湿效果或改善皱纹的效果的乳杆菌属菌株，更优选为鼠李糖乳杆菌菌株，进一步优选为鼠李糖乳杆菌KCTC5033菌株。

之后，进一步地，可以再次将发酵物进行一次过滤，以最终获得幼苗人参发酵物。

以下，为了帮助理解本发明，提出优选的实施例。但是，下述实施例仅仅是为了更容易地理解本发明而提供的，本发明的内容并不限定于下述实施例。

实施例

S10：将幼苗人参以50℃进行干燥后粉碎。S20：相对于准备的幼苗人参样品，加入20倍体积量的纯净水，然后在80℃下进行热水提取2小时。S30：在进行所述提取后，利用0.45μm的滤纸进行过滤。S40：在获得的提取物中，以1％的用量加入鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)KCTC5033，然后在37℃下进行发酵过程3-5天。所述鼠李糖乳杆菌KCTC5033获自生物资源中心。之后，进行过滤，并将幼苗人参发酵物用作本发明的样品。

试验例1-幼苗人参发酵物的细胞毒性的评价(EZ-cytox试验(assay))

试验例1-1皮肤细胞的培养

在皮肤角质细胞的培养中，使用作为皮肤角质形成细胞的HaCaT细胞，所述HaCaT细胞获自Cell Line Service GmbH.(德国)。使用含有青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，在37℃下，在5％的CO₂的恒温器中培养，并以2-3天为间隔进行传代培养。

此外，在皮肤成纤维细胞的培养中，使用作为皮肤成纤维细胞的正常人皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts，NHDF)，所述正常人皮肤成纤维细胞获自Lonza(Lonza Walkersville公司)，并且使用含有hFGF-B、胰岛素(Insulin)、GA-1000和胎牛血清(FBS)的成纤维细胞基础培养基(Fibroblast Basal Medium，FBM)，在37℃下，在5％的CO₂的恒温器中培养，并以3-5天为间隔进行传代培养。

试验例1-2细胞毒性的评价(EZ-cytox试验)

EZ-cytox试验是通过利用水溶性四唑盐(water solution tetrazolium salt，WST)与活细胞的脱氢酶(Dehydrogenase)反应而生成橙色的水溶性甲瓒(formazan)的原理来测量细胞存活率的代表性方法。

为了确认在细胞中的毒性，利用DMEM培养基，将HaCaT细胞和NHDF细胞以5×10⁴和1×10⁴细胞/mL(cells/mL)分配在96孔板(well plate)中，并在37℃下，在5％的CO₂的条件下培养18小时。对于培养的细胞，换成无血清(serum-free)培养基，并用各种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的所述实施例中制备的幼苗人参发酵物进行处理。之后，将EZ-cytox添加到各个孔(well)中，在37℃下，在5％的CO₂的条件下反应30分钟，然后使用酶标仪(microplate reader)在450nm下测量吸光度。细胞毒性评价的对照组利用没有用任何提取物处理的细胞。计算各个实验组的平均吸光度值，并与对照组的吸光度值进行比较，以此评价细胞存活率。

[表1]

如所述表1所示，所述实施例中制备的幼苗人参发酵物在各种浓度下在皮肤角质形成细胞和皮肤成纤维细胞中没有观察到细胞毒性。

试验例2-确认幼苗人参发酵物的保湿效果

将HaCaT细胞以1.0×10⁵细胞/mL分配在24孔板中，并在37℃下，在5％的CO₂的条件下培养18小时。换成无血清DMEM，用各种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的所述实施例中制备的幼苗人参发酵物进行处理，并培养24小时。对于本实验的阴性对照组，没有用任何提取物进行处理，对于阳性对照组，用浓度为10μM的视黄酸(retinoic acid，RA)进行处理。之后，取各组的培养液，利用HA-ELISA试剂盒(Cusabio生物技术有限公司(Cusabio BiotechnologyCo.,Ltd))测量透明质酸(HA)的生成量，根据制造商提供的方法进行，并将其结果示于图2和表2中。

[表2]

参考图2和表2，确认了幼苗人参发酵物浓度依赖性地增加HA的生成。此外，可以知道与作为对照组的视黄酸相比，幼苗人参发酵物更加增加透明质酸的生成。

试验例3-确认幼苗人参发酵物的改善皱纹的效果

试验例3-1确认PIP生成效果

将NHDF成纤维细胞以2×10⁴细胞/mL分配在24孔板中，然后在细胞培养条件下培养24小时。培养后，换成无血清FBM，用各种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的所述实施例中制备的幼苗人参发酵物进行处理，并培养24-48小时。对于本实验的阴性对照组，没有用任何提取物进行处理，对于阳性对照组，用浓度为10ppm的抗坏血酸(ascorbic acid)进行处理。培养后，取各组的上清液，对于培养基中游离的前胶原(procollagen)的量，利用I型前胶原肽(procollagen type I peptide，PIP)EIA试剂盒(Takara生物医学公司(TakaraBiomedical Co.))在450nm下测量吸光度以定量胶原蛋白的量。测量方法是根据制造商提供的方法进行。其结果示于图3和表3中。

[表3]

参考图3和表3，确认了幼苗人参发酵物浓度依赖性地增加胶原蛋白的合成。

试验例3-2确认胶原纤维(collagenfiber)生成效果

将NHDF成纤维细胞以2×10⁴细胞/mL分配在24孔板中，然后在细胞培养条件下培养24小时。培养后，换成无血清FBM，用各种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的所述实施例中制备的幼苗人参发酵物进行处理，并培养24-48小时。对于本实验的阴性对照组，没有用任何提取物进行处理，对于阳性对照组，用浓度为10ppm的抗坏血酸进行处理。培养后，用HEPES-BSS进行洗涤，然后根据免疫荧光染色方法对细胞内的胶原纤维进行染色。之后，用荧光显微镜测量荧光表达程度，并将其结果示于图4中。

参考图4，确认了幼苗人参发酵物浓度依赖性地增加胶原纤维的生成。

因此，所述实施例中制备的幼苗人参发酵物浓度依赖性地增加胶原蛋白的合成和胶原纤维的生成，这表示具有优异的改善皱纹的效果。

试验例4-确认幼苗人参发酵物的抗氧化活性效果

试验例4-1测量抗氧化效果

自由基清除试验是利用如下原理的试验方法，即稳定的2,2-二苯基-1-苦肼基(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical，DPPH)的吸光度在517nm下显示出最大吸光度，通过样品，自由基DPPH被清除，从紫色变成淡黄色，即，随着自由基清除率增加，在所述517nm的波长下的吸光度降低。

首先，用甲醇进行稀释，以使所述实施例中制备的幼苗人参发酵物的浓度成为3.125％、6.25％、12.5％、25％、50％，从而制备幼苗人参发酵物的稀释液。将1mL的所述幼苗人参发酵物的稀释液和1mL的0.1mM DPPH(西格玛(Sigma))溶液进行混合，从而准备样品。将制备的样品在室温下放置15分钟，然后利用酶标仪在517nm的波长下测量吸光度。在本试验例中，通过如上所述的方法对第一对照组(1mL的DPPH和10ppm的抗坏血酸)样品进行测量，第二对照组(1mL的DPPH和1mL的甲醇)的使用是为了获得对样品和对照组的各自的颜色校正值。测量幼苗人参发酵物的自由基清除活性的结果示于图5和表4中。

[表4]

参考图5，确认了幼苗人参发酵物的自由基清除活性浓度依赖性地增加。

试验例4-2测量细胞内活性氧(ROS)的抑制效果

为了测量细胞内活性氧(ROS)的变化，将HaCaT细胞以1.0×10⁵细胞/孔(cells/well)接种到24孔板中，并培养24小时，然后用各种浓度(0.5％、1.0％、2.0％)的所述实施例中制备的幼苗人参发酵物进行处理后培养24小时。对于培养的细胞，用PBS进行洗涤，然后用300μM的H₂O₂处理3小时以进一步培养。添加50μM的用于测量细胞内活性氧(ROS)的染料二氯荧光素二乙酸酯(dichlorofluorescein diacetate，DCF-DA)，并培养1小时后用PBS进行洗涤，然后用荧光显微镜测量荧光表达程度，将其结果示于图6中。

参考图6，确认了幼苗人参发酵物浓度依赖性地抑制ROS的生成。

因此，幼苗人参发酵物的自由基清除活性浓度依赖性地增加，而且抑制ROS的生成，这表示具有优异的抗氧化效果。

综上所述，本发明人制备了幼苗人参发酵物，并确认了所述发酵物具有低细胞毒性，而且具有优异的保湿因子生成量增加效果、胶原蛋白和胶原纤维生成量增加效果、自由基清除效果和细胞内活性氧抑制效果。这表示本发明的幼苗人参发酵物可以用作源自天然物的保湿、抗皱纹和抗氧化的功能材料，包含本发明的幼苗人参发酵物的化妆用组合物可以在用于改善皮肤状态的美容和食品领域中广泛使用。