一种盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油的方法
阅读说明：本技术 一种盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油的方法 (Method for extracting majoram essential oil by salting out-steam distillation method ) 是由 朱学伸 赵雯雯 郑晶晶 刘少华 丁正峰 张宁玥 于 2020-11-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有抗氧化能力的马约兰精油的制备方法,其特征在于,所述工艺包括以下步骤：步骤一,称量材料并浸泡；步骤二,水蒸气蒸馏；步骤三,称重保存；步骤四,计算提取率。本发明使用提取溶剂为蒸馏水和氯化钠,材料易得且成本低。通过分析其抗氧化能力,抗氧化性的测定结果表明马约兰精油和Vc都具有良好的抗氧化性,并且它们在各自适宜的浓度范围内随着各自浓度的增加抗氧化的效果越好。(The invention relates to a preparation method of majoram essential oil with antioxidant capacity, which is characterized by comprising the following steps: step one, weighing and soaking materials; step two, steam distillation; step three, weighing and storing; and step four, calculating the extraction rate. The invention uses the extraction solvent of distilled water and sodium chloride, and has the advantages of easily obtained materials and low cost. The antioxidant capacity of the majoram essential oil is analyzed, and the antioxidant measurement result shows that the majoram essential oil and Vc have good antioxidant capacity, and the antioxidant effect of the majoram essential oil and the Vc is better along with the increase of the respective concentration in the respective proper concentration range.)
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域，具体为一种盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油的方法。
背景技术
马约兰（Origanum majorana），也称甘牛至、马郁兰，是唇形花科牛至属的多年生或一年生植物。全株散发着温和稍带苦药香味的辛香，香味馥郁，是一种优良的蜜源植物。成体植株约高60cm，小型丛生；叶片为绿色两面附有绒毛，呈倒置水滴形，叶长2.5cm左右；茎为绿色并略带红色；花有淡紫色和白色的，成簇生长在每根茎的首端，十分赏心悦目。马约兰适宜生长在中性的沙质土壤中，喜日照充足的环境，不耐寒适宜冷凉的气候，繁殖力和生命力都很强。地中海沿岸、西西里岛和土耳其是其原产地，现主要在法国、德国、意大利这些地方种植；我国马约兰资源主要为野生，未进行大批量人工繁育。在希腊神话中，马爱与美之神阿佛洛狄忒特别喜欢马约兰这种香草，而在罗马神话里，马约兰是祭祀爱神维纳斯的专用花卉，它代表着爱情、荣誉和繁殖。所以在希腊人和罗马人的传统的婚礼中他们会将马约兰花冠戴于新婚夫妇头上，象征幸福祈愿美满；在现代，马约兰这种香草植物被应用于食用、药用、日化和园林等多个领域，应用空间广，具有很大的开发价值。
精油提取方法可分为传统提取方法和新型提取方法。传统提取方法有挤压法、吸收法、水蒸气蒸馏法和有机溶剂萃取法，新型植物精油提取方法主要有超声波辅助提取法、微波萃取法、亚临界水萃取法、超临界CO2流体萃取法、同时蒸馏萃取法、分子蒸馏和生物酶制剂辅助提取法。本实验所用的水蒸气蒸馏法提取而来的精油具有无有机溶剂残留、安全性好的优点，另在水中加入适量的无机盐类，可以提高精油的提取率。水蒸气蒸馏法的工作原理是依据道尔顿定律，以水为提取介质，将植物材料和水直接或间接混合进行加热，植物体中的精油成分通常具有挥发性会随着水蒸气一同馏出，经过冷凝装置得到馏出液，再把收集到的馏出液进行水油分离，便获得精油成分。
马约兰精油是一种带有芳香气味的淡黄色精油，具有抗氧化性，可作为天然抗氧化剂。目前关于马约兰精油的相关研究报导还很少，在参考了其他众多植物精油提取的文献后，本文采用了盐析-水蒸气蒸馏法提取法提取马约兰精油，将马约兰精油的提取率作为依据，在单因素（液料比、NaCl溶液的浓度、浸泡时间）实验设计和分析的基础上，通过3因素3水平正交试验法优化马约兰精油的提取工艺条件，并用DPPH法测定马约兰精油的抗氧化性，从而为马约兰精油的进一步开发利用奠定科学基础。。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油的方法,
一种盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油的方法，所述工艺包括以下步骤：
（一）马约兰精油的提取
步骤1）称量材料并浸泡
步骤2）水蒸气蒸馏
步骤3）称重保存
步骤4）计算提取率
作为本发明的一种改进，对于步骤1）称量材料并浸泡，具体如下：用电子天平称取一定量的NaCl加入蒸馏装置中，再用量筒量取蒸馏水装入蒸馏装置中，用玻璃棒搅拌至NaCl充分溶解，最后把用电子天平称取的400g干燥马约兰粉碎叶片浸入NaCl溶液中，浸泡一段时间。
作为本发明的一种改进，对于步骤2）水蒸气蒸馏，具体如下：将蒸馏装置冷凝器通入冷凝水，调节火力，开始蒸馏，蒸馏温度为85℃。用精油分离器承接馏出物，蒸馏至蒸馏装置中剩余的NaCl溶液恰好没过马约兰粉碎叶片为止。
作为本发明的一种改进，对于步骤3）称重保存，具体如下：用移液枪吸出精油分离器中液体液面上的精油，称重记录，置于离心管中避光密封保存。
作为本发明的一种改进，对于步骤4）计算提取率，具体如下：用此公式计算提取率：提取率（X）=所得精油质量（mg）/ 干燥马约兰粉碎茎叶质量（g）。
作为本发明的一种改进，所述步骤2）中液料比为17：1，NaCl溶液的浓度为1mg/mL、浸泡时间为1h，在该提取条件下的提取率达0.698mg/g。
马约兰精油为触感稀滑且有清新药草香味的透明黄色油状液体。
本发明具有如下有益效果：1）该技术方案原料为马约兰，提取工艺为盐析-水蒸气蒸馏法，其工作原理是利用是依据道尔顿定律，以水为提取介质，将植物材料和水直接或间接混合进行加热，植物体中的精油成分通常具有挥发性会随着水蒸气一同馏出，经过冷凝装置得到馏出液，再把收集到的馏出液进行水油分离，便获得精油成分。
2）该方案使用提取溶剂为蒸馏水和氯化钠，材料易得且成本低。
3）该方案提取的最优条件的建立是在单因素实验的基础上，并通过3因素3水平正交试验优化得到：液料比为17：1，NaCl溶液的浓度为1mg/mL、浸泡时间为1h，在该提取条件下的提取率达0.698mg/g。4）通过分析其抗氧化能力，抗氧化性的测定结果表明马约兰精油和Vc都具有良好的抗氧化性，并且它们在各自适宜的浓度范围内随着各自浓度的增加抗氧化的效果越好。
附图说明
图1 NaCl溶液的浓度对马约兰精油提取率的影响。
图2 浸泡时间对马约兰精油提取率的影响。
图3 液料比对马约兰精油提取率的影响。
图4 Vc与盐析-水蒸气蒸馏法提取的马约兰精油对DPPH自由基的清除率。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面结合附图对本实施例做详细的说明。
实施例1
一种盐析-水蒸气蒸馏法提取精油，并用此精油的抗氧化活性检测的工艺包括以下步骤：
（一）马约兰精油的提取
步骤1）称量材料并浸泡：用电子天平称取一定量的NaCl加入蒸馏装置中，再用量筒量取蒸馏水装入蒸馏装置中，用玻璃棒搅拌至NaCl充分溶解，最后把用电子天平称取的400g干燥马约兰粉碎叶片浸入NaCl溶液中，浸泡一段时间。
步骤2）水蒸气蒸馏：将蒸馏装置冷凝器通入冷凝水，调节火力，开始蒸馏，蒸馏温度为85℃。用精油分离器承接馏出物，蒸馏至蒸馏装置中剩余的NaCl溶液恰好没过干燥马约兰粉碎叶片为止。。
步骤3）称重保存：用移液枪吸出精油分离器中液体液面上的精油，称重记录，置于离心管中避光密封保存。
步骤4）计算提取率：用此公式计算提取率：提取率（X）=所得精油质量（mg）/ 干燥马约兰粉碎茎叶质量（g）。
所述步骤2）中液料比为17：1，NaCl溶液的浓度为1mg/mL、浸泡时间为1h，在该提取条件下的提取率达0.698mg/g。
（二）抗氧化性测定
（1）待测样品溶液的配制
1）DPPH-无水乙醇试剂的配制，具体如下，用电子天平称取0.002mg的DPPH并放在烧杯里，加入少量的无水乙醇用玻璃棒搅拌将其溶解，再将该溶液装入25mL容量瓶中加入无水乙醇定容至刻度线，得到DPPH-乙醇溶液且浓度为2×10-4mol/L，把它装入50mL离心管，裹上锡箔纸，放进4℃冰箱里存放备用。
2）DPPH-无水乙醇试剂本底吸光值样品溶液的配制，具体如下，用移液枪吸取2mL步骤1）配制好的DPPH-无水乙醇溶液，按表1进行加样后摇匀，将其在室温条件下避光放置30min。
表1 DPPH氧化法测定马约兰精油抗氧化能力加样表（/mL）
编号 样品溶液 无水乙醇 DPPH-乙醇溶液 蒸馏水 A<sub>2</sub> 0.0 0.0 2.0 2.0 A<sub>1</sub> 1.5 0.0 2.0 0.5 A<sub>0</sub> 1.5 2.0 0.0 0.5
3）对照组Vc清除自由基样品溶液的配制，具体如下，分别称取1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的Vc，将称取好的Vc分别放入10mL容量瓶中，再加入蒸馏水定容，配制成一系列浓度梯度:0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL，按表2进行加样后摇匀，将其在室温条件下避光反应30min。
4) 对照组Vc本底吸光值样品溶液的配制，具体如下，用移液枪吸取2mL步骤3）中配制好的DPPH-无水乙醇溶液，按表1进行加样后摇匀，将其在室温条件下避光放置30min。
5) 马约兰精油清除自由基样品溶液的配制，具体如下，分别称取10mg、20mg、30mg、40mg、50mg马约兰精油，将称取好的马约兰精油分别置于10mL容量瓶中，用无水乙醇定容，稀释成一系列浓度梯度:1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，按表2进行加样后摇匀，将其在室温条件下避光反应30min。
6）马约兰精油本底吸光值样品溶液的配制，具体如下，用移液枪分别吸取、配制好的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的马约兰精油稀释液，按表2进行加样后摇匀，将其在室温条件下避光放置30min。
7）空白液的配制，具体如下，用移液枪吸取2mL无水乙醇和2mL蒸馏水放在试管中，摇匀后装入5mL离心管中，将其并在室温条件下避光放置30min。
8）样品溶液吸光值测定，具体如下，使用分光光度计，调节波长为517nm，放入空白液调零，依次分别放入待测样品溶液，测定其吸光值。
9）抗氧化性的计算方法，具体如下，根据以下公式计算样品的抗氧化能力：清除率（%）=[A2-(A1-A0)]/A2×100%（其中A2为DPPH-无水乙醇试剂本底吸光值，A1为马约兰精油清除自由基样品溶液的吸光值，A0为不同浓度马约兰精油样品溶液的本底吸光值，重复测定3次取平均值）。
本发明的技术工艺主要通过下述技术方案得以优化：
（一）单因素实验方法及结果与分析
单因素实验方法：
不同液料比下对马约兰精油提取的影响
准确称取3份400g干燥马约兰粉碎叶片依次进行实验，分别按14:1、17:1、20:1的液料比，加入质量分数为0.75mg/mL的NaCl溶液，待浸泡0.5h后，加热蒸馏至蒸馏装置中剩余的NaCl溶液恰好没过干燥马约兰粉碎叶片为止，用移液枪吸出精油分离器中液体液面上的精油装入已称重过的离心管中，再次称重记录精油的质量，最后将装有精油的离心管裹上锡箔纸在室温下保存，计算出精油的提取率，重复测定3次取平均值
不同NaCl溶液的浓度下盐析-水蒸气蒸馏对马约兰精油提取的影响
准确称取3份400g干燥马约兰粉碎叶片依次进行实验，按17:1的液料比，分别加入0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL的NaCl溶液，待浸泡0.5h后，加热蒸馏至蒸馏装置中剩余的NaCl溶液恰好没过干燥马约兰粉碎叶片为止，用移液枪吸出精油分离器中液体液面上的精油装入已称重过的离心管中，再次称重记录精油的质量，最后将装有精油的离心管裹上锡箔纸在室温下保存，计算出精油的提取率，重复测定3次取平均值。
（3）不同浸泡时间下盐析-水蒸气蒸馏提取马约兰精油
准确称取3份400g干燥马约兰粉碎叶片依次进行实验，按17:1的液料比，加入0.75mg/mL的NaCl溶液，分别浸泡0.5h、1h、1.5h后，加热蒸馏至蒸馏装置中剩余的NaCl溶液恰好没过干燥马约兰粉碎叶片为止，用移液枪吸出精油分离器中液体液面上的精油装入已称重过的离心管中，再次称重记录精油的质量，最后将装有精油的离心管裹上锡箔纸在室温下保存，计算出精油的提取率。
单因素实验结果与分析：
根据上图1我们可以知道，在其他条件不变的情况下，不同NaCl溶液的浓度对盐析-水蒸气蒸馏法马约兰精油提取率的影响。当NaCl溶液的浓度为0.5mg/mL时，马约兰精油的提取率为0.048mg/g；当NaCl溶液的浓度为0.75mg/mL时，马约兰精油的提取率为0.290mg/g；当NaCl溶液的浓度为1mg/mL时，马约兰精油的提取率为0.157mg/g。NaCl溶液的浓度对马约兰精油的提取率有明显影响，马约兰精油提取率随着NaCl溶液的浓度增加先增大，且当NaCl溶液的浓度达到0.75mg/mL时，精油提取率达到最大值，之后又减小。这与盐析效应相关，在水中加入适量的NaCl后，马约兰精油在水中的溶解度降低，使提取率增大；但加入的NaCl过多，溶液的沸点过低容易导致溶液狂沸，蒸馏难以控制，这样马约兰精油中的易挥发成分的损失会增加，导致马约兰精油的提取率降低。因此，选择NaCl溶液的浓度为0.75mg/mL来进行盐析-水蒸气蒸馏提取马约兰精油较为适宜。
由图2可以看出，在其他条件不变的情况下，不同浸泡时间对盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油提取率的影响。当浸泡时间为0.5h时，马约兰精油的提取率为0.290mg/g；当浸泡时间为1h时，马约兰精油的提取率为0.313mg/g；当浸泡时间为1.5h时，马约兰精油的提取率为0.191mg/g。马约兰精油的提取率随浸泡时间的增加而增大，且当浸泡时间为1h时，获得马约兰精油的最大提取率，之后减小。可能是由于在一定浸泡时间范围内，随着浸泡时间的增加，精油成分能更充分完全地从马约兰粉碎叶片中渗透出来；但浸泡时间过长，可能会使精油成分分解而溶解在水中，也可能会使植物材料中的果胶成分溶出产生乳化作用抑制挥发性成分蒸出[34]，从而导致提取率下降。因此，选择浸泡时间为1h来进行盐析-水蒸气蒸馏提取马约兰精油较为适宜。
由图3可以看出，在其他条件不变的情况下，不同液料比对盐析-水蒸气蒸馏法马约兰精油提取率的影响。当液料比为14:1时，马约兰精油的提取率为0.040mg/g；当液料比为17:1时，马约兰精油的提取率为0.289mg/g；当液料比为20:1时，马约兰精油的提取率为0.089mg/g。马约兰精油提取率随着液料比的增大先增大后减小，当料液比为17:1时，取得马约兰精油的最大提取率，之后减小。可能的原因是在适宜液料比范围内随着提取剂的增多，马约兰粉碎叶片与提取剂接触更加充分，更多的使精油成分能从马约兰粉碎叶片中溶出，所以提取率增大[31]；但提取剂过多可能会致使马约兰精油在提取剂中的溶解量增加[32]，另外在蒸馏过程中蒸馏装置中的提取剂在不断减少，当提取剂过少时会导致在加热过程中产生局部过热现象，易使精油成分被破坏分解，导致精油的提取率降低。因此，选择液料比为17:1来进行盐析-水蒸气蒸馏提取马约兰精油较为适宜。
正交试验设计及其结果与分析：
在单因素实验的基础上，选取液料比、NaCl溶液的浓度和浸泡时间3个因素，每个因素选取3个水平，对盐析-水蒸气蒸馏提取马约兰精油的工艺参数进行L9（33）正交优化设计。设计结果见下表1。其中水平项的“1”“2”“3”依次代表低水平、中水平与高水平。
表2 三因素三水正交试验析设计表
水平 液料比A NaCl溶液的浓度B（mg/mL） 浸泡时间C（h） 1 14:1 0.50 0.5 2 17:1 0.75 1.0 3 20:1 1.00 1.5
以马约兰精油的提取率为评价指标，将三因素三水平正交实验设计表进行数据分析，做出马约兰精油提取条件L9（33）正交设计表如下表2。共9组实验，根据运行序依次进行实验，测得各组实验的提取率。
表3 马约兰精油提取条件优化实验设计及结果
编号 A B(mg/mL) C（h） 提取率（mg/g） 1 14:1 0.50 0.5 0.102 2 17:1 0.75 0.5 0.287 3 20:1 1.00 0.5 0.242 4 20:1 0.75 1.0 0.448 5 17:1 0.50 1.0 0.555 6 14:1 1.00 1.0 0.362 7 14:1 0.75 1.5 0.264 8 17:1 1.00 1.5 0.676 9 20:1 0.50 1.5 0.008 K<sub>1</sub> 0.728 0.665 0.631 K<sub>2</sub> 1.518 0.999 1.365 K<sub>3</sub> 0.698 1.280 0.948 k<sub>1</sub> 0.243 0.222 0.210 k<sub>2</sub> 0.506 0.333 0.455 k<sub>3</sub> 0.233 0.427 0.316 R 0.273 0.205 0.245
正交试验结果见表2，比较各R值大小，可见RA＞RC＞RB，因此各因素对马约兰精油提取率的影响大小为：A（液料比）>C（浸泡时间）>B（NaCl溶液的浓度），液料比对马约兰精油的提取存在显著性影响，浸泡时间有明显影响，NaCl溶液的浓度影响不显著。依据k值越大的工艺条件越有利于精油的提取，优选如下：A（液料比）选其较好水平A2；B（NaCl溶液的浓度）选其较好水平B3；C（浸泡时间）选其较好水平C2。则盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油最佳提取工艺组合为A2B3C2，即液料比17:1，NaCl溶液的浓度1mg/mL，浸泡时间1h。
根据正交试验得到的最优提取组合方案A2B3C2做验证实验，得到马约兰精油提取率为0.698mg/g，高于表3中的最高提取率0.676mg/g。
（二）马约兰精油抗氧化性测定结果及分析
由图4可以看出，Vc与盐析-水蒸气蒸馏法提取的马约兰精油对DPPH自由基的清除率。Vc与马约兰精油都可以清除DPPH自由基，并且它们在各自适宜的浓度范围内随着各自浓度的增加清除的效果越好。其中Vc表现出更强的抗氧化性，即在相同浓度下，Vc的DPPH清除率高于马约兰精油。但马约兰精油在实验的梯度浓度范围内其DPPH清除率呈上升趋势最大可达76%。
通过研究单因素实验，设计了正交试验。借助正交试验分析了NaCl溶液的浓度、浸泡时间和料液比三个因素对盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油的影响。根据正交实验分析结果显示，NaCl溶液的浓度、浸泡时间和料液比过低或过高都会对精油的提取率产生在影响，且正交实验分析三种因素对精油提取率影响大小顺序为：液料比>NaCl溶液的浓度>浸泡时间。另外通过正交实验表还探究出盐析-水蒸气蒸馏法提取马约兰精油涉及到的三个因素最佳组合方式，通过实验验证了它的正确性。
DPPH是一种具有单电子的稳定自由基，在517nm波长处有着强吸收，于是抗氧化剂便可通过使其单电子配对的方式减弱强吸收，所以测得的吸光值与其接受的电子呈定量关系，可根据其在517nm处的吸光值判断样品抗氧化活性。马约兰精油中含有的抗氧化活性成分，可作为天然食品抗氧化剂用于食品加工或制作成保健食品，应用前景十分广阔。通过DPPH法对利用盐析-水蒸气蒸馏法提取而来的马约兰精油和阳性对照Vc进行抗氧化性测定，结果显示两者都具有抗氧化性，且在一定范围内抗氧化性与浓度呈正相关。其中Vc表现出更强的抗氧化性，即在相同浓度下，Vc的DPPH清除率高于马约兰精油。但马约兰精油在实验的梯度浓度范围内其DPPH清除率呈上升趋势最大可达76%。
总体来说，马约兰精油具有抗氧化能力，可作为天然抗氧化剂，具有一定发展前景。盐析-水蒸气蒸馏法提取而来的马约兰精油无有机溶剂残留，安全性好，也适于作为天然食品抗氧化剂应用在食品加工或制作成保健食品。
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