一种基于多元素分析的海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法
阅读说明：本技术 一种基于多元素分析的海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法 (Seawater and freshwater aquaculture salmonidae fish tracing method based on multi-element analysis ) 是由 李丽 韩萃 董双林 高勤峰 于 2021-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于多元素分析的海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法,从而有效的区分海水和淡水来源的鲑科鱼类,是使用待检测的鲑科鱼类的Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn元素的含量作为指标,使用线性判别分析(LDA)方法、K近邻(KNN)方法和随机森林(RF)方法来进行溯源分析。本发明通过比较海水和淡水养殖鲑科鱼类体内元素组成差异,从而建立一种海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法,可以有效的对海水和淡水来源的鲑科鱼类进行溯源。(The invention provides a seawater and fresh water cultured salmonidae fish traceability method based on multi-element analysis, so that salmonidae fishes from seawater and fresh water sources can be effectively distinguished, the content of Ag, Al, Ba, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ga, K, Mg, Mn, Na, Ni, Sr and Zn elements of salmonidae fishes to be detected is used as an index, and a Linear Discriminant Analysis (LDA) method, a K Nearest Neighbor (KNN) method and a Random Forest (RF) method are used for traceability analysis. The source tracing method for the salmonidae fishes cultivated in the seawater and the freshwater is established by comparing the difference of the element compositions in the seawater and the freshwater in the salmonidae fishes, and can effectively trace the sources of the salmonidae fishes from the seawater and the freshwater.)
技术领域
本发明属于养殖鱼类来源检测
技术领域
，具体涉及一种基于多元素分析的海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法。背景技术
水产品是世界上贸易程度最高的食品，近年来，伴随着水产品需求量逐年增加，其贸易不断扩张，欺诈现象越来越严重(梁森，2015；Addisu and Takele.,2015；Shen etal.,2016)。而水产品的种类替代、产地信息混乱及养殖环境信息的有意篡改等欺诈行为引起消费者对食品安全的担忧(Anderson et al.,2010；Cline,2012；Khaksar et al.,2015；Molkentin et al.,2015；Hu et al.,2018；Pardo et al.,2018；Zhang et al.,2019)。因此，开展其溯源技术研究对保障水产品安全，维护消费者消费信心十分重要(Addisu andTakele,2015；Li et al.,2016；Sheikha and Xu,2017)。
鲑科鱼类是世界上重要的经济养殖种类，生鲜或加工后的鲑科鱼类在全球范围内被广泛交易。根据联合国粮食及农业组织(FAO,Food and Agriculture Organization ofthe United Nations)数据统计，2017年全球鲑科鱼类产量超过300万吨(FAO,2020)。其中，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑(Salmo salar)是两种产量最高的鲑科鱼类，在淡水和海水中均有养殖(Shoji et al.,1996)。通常，在淡水或低盐度水中养殖的鱼类，其风味易受由蓝藻和放线菌产生的土臭素和2-甲基异冰片等异味物质影响(Burr et al.,2012)。因此，近年来，消费者对鲑科鱼类产品的养殖环境尤为关注，这也诱导了不法商家刻意篡改鲑科鱼类产品养殖环境信息。为维护消费者权益，迫切需要建立海水和淡水养殖鲑科鱼类的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多元素分析的海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法，从而有效的区分海水和淡水来源的鲑科鱼类。
本发明首先提供一种海水和淡水来源鲑科鱼类的溯源方法，所述的方法是使用待检测的鲑科鱼类的Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn元素的含量作为指标，使用线性判别分析(LDA)方法、K近邻(KNN)方法和随机森林(RF)方法来进行溯源分析；
所述的方法，一种是使用待检测的鲑科鱼类的Ag、Ba、K、Mg、Na及Sr元素的含量作为指标使用LDA、KNN和RF进行溯源分析；
所述的方法，为LDA、KNN和RF方法，其中使用的指标为待检测的鲑科鱼类中的Ca、Cr、Fe、Ga、K、Na、Sr和Zn元素的含量；
所述的方法，为LDA、KNN和RF方法，其中使用的指标为待检测的鲑科鱼类背肌中的K、Na及Zn元素的含量；
本发明还通过LDA分析提供一种海水和淡水来源鲑科鱼类的判别模型，利用Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn元素的含量作为指标的线性判别函数如下：
淡水组＝0.08Ag+0.10Al–0.50Ba–0.04Ca+2.18Cd–1.29Co+0.09Cr+0.31Cu+0.22Fe+0.03Ga+0.00K+0.01Mg–1.53Mn+0.01Na–1.17Ni+2.57Sr+0.58Zn–34.61；
海水组＝0.36Ag+0.12Al–1.93Ba-0.05Ca+4.10Cd–0.62Co-0.15Cr+0.43Cu+0.22Fe+0.00Ga-0.00K+0.03Mg–2.15Mn+0.03Na–1.19Ni+0.51Sr+0.78Zn–52.81。
所述的以Ag、Ba、K、Mg、Na及Sr元素为指标的溯源模型，其线性判别函数如下：
淡水组＝0.16Ag–0.35Ba+0.00K+0.01Mg+0.01Na+2.24Sr–21.20；
海水组＝0.50Ag–1.82Ba–0.00K+0.02Mg+0.02Na+0.34Sr–35.61；
以Ca、Cr、Fe、Ga、K、Na、Sr和Zn元素为指标，通过LDA建立的线性判别函数如下：
淡水组＝–0.03Ca+0.17Cr+0.18Fe+0.04Ga+0.00K+0.01Na+2.86Sr+0.51Zn–25.04；
海水组＝–0.04Ca+0.05Cr+0.21Fe+0.02Ga+0.00K+0.02Na+1.54Sr+0.74Zn–35.70；
再一种溯源模型，以K、Na及Zn元素的含量为指标，通过LDA建立的线性判别函数如下：
淡水组＝0.00K+0.01Na+0.15Zn–18.48；
海水组＝–0.00K+0.02Na+0.28Zn–29.08。
本发明通过比较海水和淡水养殖鲑科鱼类体内元素组成差异，从而建立一种海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法，可有效的对海水和淡水来源的鲑科鱼类进行溯源。
具体实施方式
本发明比较海水和淡水养殖鲑科鱼类体内元素组成差异，从而建立一种海水和淡水养殖鲑科鱼类溯源方法。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：筛选检测指标
1、样品采集
于2018年4月至2019年1月期间从中国和智利采集鲑科鱼样品(N＝131)，其中，淡水样品采自中国刘家峡地区(FLJX，N＝57)和北京地区(FBJ，N＝12)，海水样品采自中国烟台地区(SYT，N＝45)、智利蒙特港(SPM，N＝11)和纳塔莱斯港(SPN，N＝6)(SPM和SPN样品购自山东美佳集团有限公司)。采集的样品使用冷冻干燥机干燥后放入干燥器中保存。
2、样品微波消解
取0.2g固体鱼样品放入消解罐中，加入6mL HNO3(65％)和2mL H2O2(30％)预消解31min。完成预消解后，加超纯水至10mL。将消解罐放入微波消解仪(MWD-650，METASH仪器有限公司，上海，中国)中进行消解。优化后消解程序设置为：第一阶段，1600W，爬坡时间5min，温度120℃，保持10min；第二阶段，1600W，爬坡时间5min，温度160℃，保持5min；第三阶段，1600W，爬坡时间5min，温度200℃，保持20min。完成消解后，将消解罐置于赶酸器(SPH-2，Metash仪器有限公司，上海，中国)中，170℃条件下进行赶酸，直至剩余液体少于1mL，取出消解罐。待剩余液体冷却至室温，用超纯水反复冲洗并定容至25mL。再用0.45μm滤膜过滤后，4℃保存。
3、电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)检测
采用ICP-AES(ICAP-6300,Thermo,USA)分析步骤2中处理的样品中的Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn含量。ICP-AES的仪器工作条件为：功率1150W，冷却气流量12L·min-1，雾化器气流量1.0L·min-1，辅助气流量0.5L·min-1，雾化器气压力0.2MPa，样品引入流速1.0mL·min-1。每种元素的分析波长见表1。将多元素混和标准液逐级稀释，共6个梯度，每个梯度3个重复，建立元素标准曲线。其中元素Ca、Fe、K及Na的线性范围为0.1～50mg·L-1，其他元素的线性范围为0.01～5mg·L-1。所有元素的校准曲线均具有良好的线性，相关系数均在0.99以上(表1)。加标回收率为91.37～104.62％。测定了10个试剂空白中元素的浓度，并计算了每种元素的标准差。每种元素的检测限(LOD)和有效浓度(LOQ)为标准差的3.3倍和10倍(表1)。
表1：分析程序的有效性数据表
4、统计分析
采用SPSS 19.0软件(SPSS,Inc.Chicago,IL)对数据进行统计分析。用Kolmogorov-Smirnov检验和Levene检验对数据进行正态分布和方差齐性检验。如果数据不符合正态分布或方差齐性假设，则对其进行log转换。海水和淡水鲑科鱼体内的元素差异采用独立样本t检验进行比较。多元统计分析(SDA、KDA、KNN和RF)采用SAS 9.4(SASInstitute,Inc.Cary,North Carolina,USA)和R语言(R 3.6.3，“randomForest”和“caret”包)分析软件。
5、海水和淡水养殖鲑科鱼体内元素的含量
共测定了鲑科鱼背肌中17种元素(Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn)的含量，用平均值±标准差(Mean±S.D)表示。其中，海水和淡水鲑科鱼中K、Mg和Na元素含量均超过1000μg·g-1，Ca和Fe含量超过100μg·g-1，Al、Cr、Ga及Zn元素含量超过10μg·g-1，Ag、Ba、Co、Cu、Mn和Ni元素含量超过1μg·g-1，元素Cd和Sr的含量低于1μg·g-1。
采用独立样本t检验对海水和淡水养殖的鲑科鱼体中17种元素(Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn)进行比较。结果表明，8种元素(Ca、Cr、Fe、Ga、K、Na、Sr和Zn)存在显著差异(P<0.05)，其中，Ga和Na在海水鲑科鱼体内含量高于淡水鲑科鱼，而Ca、Cr、Fe、K、Sr和Zn在淡水鱼体内含量更高(表2)。
表2：海水和淡水养殖鲑科鱼体内元素含量均值和标准差(μg·g-1干重)
注：根据独立样本t检验分析，不同小写字母表示组间有显著差异(P<0.05)。
实施例2：建立海水和淡水养殖鲑科鱼类判别模型
逐步判别分析(SDA)可用于筛选出最具判别不同组样品功能的指标。根据实施例中的检测数据，建立4种数据集；其中数据集1包含所有的17种元素；17种元素经过SDA筛选后，Ag、Ba、K、Mg、Na及Sr元素被筛选出，并组成数据集2；数据集3由海水和淡水养殖鲑科鱼类体内经t检验有显著差异的元素组成(Ca、Cr、Fe、Ga、K、Na、Sr和Zn)；数据集4由数据集3经SDA筛选出的Na、K和Zn元素组成。利用这4种数据集，比较基于不同变量的海水和淡水养殖鲑科鱼类判别模型的准确性，以建立最优的判别模型。
结合上述4种数据集，采用线性判别分析(LDA)方法、K近邻(KNN)分析方法和随机森林(RF)方法建立海水和淡水养殖鲑科鱼类的判别模型。
将样品随机分为两部分，即训练集(包含80％样品，N＝104)和预测集(包含20％样品，N＝27)，分别用于建立判别模型(初始判别率)和检验判别模型预测能力(预测判别率)，模型经交叉检验后得出交叉检验判别率。
首先，利用数据集1(包含Ag、Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Sr和Zn)，线性判别分析LDA方法模型的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为97.12％、95.19％、92.59％(表3)。线性判别函数如下：淡水组＝0.08Ag+0.10Al–0.50Ba–0.04Ca+2.18Cd–1.29Co+0.09Cr+0.31Cu+0.22Fe+0.03Ga+0.00K+0.01Mg–1.53Mn+0.01Na–1.17Ni+2.57Sr+0.58Zn–34.61；海水组＝0.36Ag+0.12Al–1.93Ba-0.05Ca+4.10Cd–0.62Co-0.15Cr+0.43Cu+0.22Fe+0.00Ga-0.00K+0.03Mg–2.15Mn+0.03Na–1.19Ni+0.51Sr+0.78Zn–52.81。
K近邻(KNN)分析方法中k值为5，在初始判别中，1个淡水样品和2个海水样品判别错误；交叉检验后，2个淡水样品和2个海水样品判别错误；预测集中，1个淡水样品和1个海水样品判别错误。整体初始、交叉检验以及预测判别率分别为97.12％、96.15％及92.59％。
RF模型得到的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为96.15％、95.19％及96.30％(表3)。3种模型的判别准确率均在92％以上，RF预测判别率最高，达到了96.30％。
表3：基于17种元素和多元统计分析的淡水(FS)和海水(SS)养殖鲑科鱼类判别结果
利用数据集2(包含Ag、Ba、K、Mg、Na及Sr)，LDA模型建立的线性判别函数如下：淡水组＝0.16Ag–0.35Ba+0.00K+0.01Mg+0.01Na+2.24Sr–21.20；海水组＝0.50Ag–1.82Ba–0.00K+0.02Mg+0.02Na+0.34Sr–35.61。LDA模型的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为98.08％、97.12％及96.30％。KNN模型的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为97.12％、96.15％及92.59％。RF模型得到的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为97.12％、93.88％及96.30％(表4)。比较3种模型判别精度可见，LDA判别率最高，在96％以上。
表4：基于Ag、Ba、K、Mg、Na及Sr元素和多元统计分析的淡水(FS)和海水(SS)养殖鲑科鱼类判别结果
利用数据集3(包含Ca、Cr、Fe、Ga、K、Na、Sr和Zn)，LDA模型建立线性判别函数如下：淡水组＝–0.03Ca+0.17Cr+0.18Fe+0.04Ga+0.00K+0.01Na+2.86Sr+0.51Zn–25.04；海水组＝–0.04Ca+0.05Cr+0.21Fe+0.02Ga+0.00K+0.02Na+1.54Sr+0.74Zn–35.70。LDA判别结果显示，淡水样品的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为100％、100％及92.86％，海水样品的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为91.84％、91.84％及92.31％。整体初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为96.15％、96.15％及92.59％。KNN(k＝5)判别结果显示，淡水样品的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为100％、98.18％及92.86％，海水样品的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率均达到了100％。KNN模型的整体初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为100％、99.04％及96.30％。RF判别结果显示，淡水样品的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为96.36％、96.36％及92.86％，海水样品的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为93.88％、93.88％及100％。RF模型的整体初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为95.19％、95.19％及96.30％(表5)。比较3种模型判别精度发现，KNN的初始判别率和交叉检验判别率最高，预测判别率最高的模型为KNN和RF。
表5：基于Ca、Cr、Fe、Ga、K、Na、Sr元素和Zn和多元统计分析的淡水(FS)和海水(SS)养殖鲑科鱼类判别结果
数据集4只包含K、Na及Zn，基于数据集4的LDA模型判别函数如下：淡水组＝0.00K+0.01Na+0.15Zn–18.48；海水组＝–0.00K+0.02Na+0.28Zn–29.08。LDA模型得到初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为96.15％、96.15％及100％。KNN(k＝5)模型得到初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为99.04％、99.04％及100％。RF模型得到的初始判别率、交叉检验判别率以及预测判别率分别为97.12％、96.15％及96.30％(表6)。比较3种模型判别精度发现，KNN判别率最高，均在99％以上。
表6：基于Na、K和Zn和多元统计分析的淡水(FS)和海水(SS)养殖鲑科鱼类判别结果
通过比较不同数据集以及不同判别模型的判别率，本发明基于不同数据集的3种模型的判别率均高于92％，表明多元素分析结合多元统计分析是鉴定海水和淡水养殖鲑科鱼类的有效方法。其中基于数据集4的KNN模型的判别率最高，判别精度>99％。
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