一种利用d-葡萄糖生物合成d-阿洛糖的方法
阅读说明：本技术 一种利用d-葡萄糖生物合成d-阿洛糖的方法 (Method for biosynthesizing D-allose by using D-glucose ) 是由 李灏 郑灵洁 范立海 于 2020-11-26 设计创作，主要内容包括：一种利用D-葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法属于大肠杆菌代谢工程领域,旨在利用生物体合成D-阿洛糖,由于D-阿洛糖在自然界中含量极少,且提取率低,所以在工程大肠杆菌中合成D-阿洛糖是一个值得研究的内容。在大肠杆菌中引入三个外源基因gi、dpe、rpiB最终将D-葡萄糖异构合成D-阿洛糖。为了稳定产量,在途径构建时,敲除了FruA、ptsg、pfkB、glk、mak、pfkA六个基因,并且过表达了Galp,进而在D-阿洛糖合成时,能够实现多种碳水化合物的共利用,而且使得甘油用于菌种生长,D-葡萄糖以更高的转化率合成D-阿洛糖。(A method for biosynthesizing D-allose by using D-glucose belongs to the field of escherichia coli metabolic engineering, and aims to synthesize D-allose by using organisms. Introducing three exogenous genes gi, dpe and rpiB into escherichia coli to finally isomerize D-glucose into D-allose. In order to stabilize the yield, six genes of FruA, ptsg, pfkB, glk, mak and pfkA are knocked out during pathway construction, Galp is overexpressed, and further, during D-allose synthesis, the co-utilization of various carbohydrates can be realized, glycerol is used for strain growth, and D-allose is synthesized by D-glucose at a higher conversion rate.)
技术领域
本发明属于大肠杆菌代谢工程领域，具体涉及了合成D-阿洛糖的方法，尤其涉及一种以葡萄糖和甘油联合生产阿洛糖的工程菌及其构建方法和路径。
背景技术
D-阿洛糖是一种己醛糖，是一种罕见的单糖，为白色无味的结晶固体，是无热量的糖，没有毒性。化学式CH2OH(CHOH)4CHO，分离于一种非洲灌木的叶子，但是提取率极低，所以D-阿洛糖的人工合成变得更为迫切。D-阿洛糖溶于水但几乎不溶于甲醇，D-阿洛糖是葡萄糖的C-3差向异构体。D-阿洛糖主要以环状形式存在，由β-D-allo-1.5-吡喃糖(77.5％)，α-D-allo-1.5-吡喃糖(14％)，β-D-allo-1.4-呋喃糖(5％)和α-D-allo-1.4-呋喃糖(3.5％)组成，其中β-D-allo-1.5-吡喃糖是主要成分。
近年来，由于D-阿洛糖具有许多药物活性而引起了广泛关注，D-阿洛糖抑制癌变，特别是在氧化应激条件下，可以抑制多种癌细胞系的增殖，包括宫颈癌、肝细胞癌、卵巢、头颈部、皮肤和前列腺癌。并且在癌症治疗中D-阿洛糖和放射的组合提高了肿瘤的治愈率。D-阿洛糖还可以作为一种抗氧化剂，在作为药物制剂中的治疗剂和配方食品中的功能性成分有一定的潜力。D-阿洛糖作为一种抗炎剂，可抑制缺血-再灌注损伤，抑制节段性中性粒细胞生成，并降低血小板计数。D-阿洛糖与低剂量FK506联合使用显著增加了同种异体移植物的存活率，同时减少了组织损伤。此外，右旋糖酐对细胞有冷冻保护作用。因此，D-阿洛糖在外科手术和移植中有一定的应用前景。
然而，D-阿洛糖的来源主要来源于化学合成和生物合成，由于化学合成有很多弊端，比如合成路径复杂，副产物多，环境污染大，分离纯化难度高，所以在合成阿洛糖时，生物合成更具竞争力，而微生物发酵来生产阿洛糖，成本低且环保。
但是当使用D-葡萄糖作为唯一碳源时，D-阿洛糖在大肠杆菌中的产量比较低，因为葡萄糖既要产生细胞生物量又要提供生产D-阿洛糖。先前的报道表明，在敲除磷酸化的特异性通透酶后，可以降低葡萄糖的摄取利用，但是大肠杆菌的生物量会受到影响，所以需要额外的碳源来补齐对细胞生长的亏欠。由于实验途径的原因选择了糖酵解途径下游的三碳物质-甘油来补齐亏欠，而甘油本身结构简单，代谢途径明晰。当葡萄糖与甘油共存作为碳源，野生大肠杆菌优先消耗葡萄糖，实现葡萄糖和甘油共利用，且使菌能够利用葡萄糖高效生产D-阿洛糖仍具有很大挑战性。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种生产D-阿洛糖的工程菌及其构建方法和应用，并利用基因调控，使得细胞代谢平衡，在利用甘油提供生长的同时，D-葡萄糖用于合成D-阿洛糖。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
在代谢工程菌株大肠杆菌JM109(DE3)中利用D-葡萄糖合成D-阿洛糖，(如图1)首先要构建主途径所需的三个基因，然后再跟据代谢途径，敲除D-葡萄糖供生长消耗的途径，同时解除葡萄糖效应，实现多糖共利用的局面，使得大多数D-葡萄糖用于合成D-阿洛糖，而甘油的消耗主要是支持细胞生长，同时优化了D-葡萄糖进入细胞的非磷酸化途径。
本发明提供一种生产D-阿洛糖的工程菌，包括宿主菌和转入宿主菌的质粒载体，其中所述的质粒载体中整合了外源基因葡萄糖异构酶(gi)的基因、D-阿洛酮糖差向异构酶(dpe)基因与核糖-5-磷酸异构酶(rpiB)基因以及过表达了内源基因半乳糖通透酶(Galp)的基因。
其中所述宿主菌为野生或改造过的细菌或真菌，本发明优选的所述宿主菌为大肠杆菌。
基于上述，在代谢工程菌JM109(DE3)中利用D-葡萄糖合成D-阿洛糖，首先构建表达所需的3个基因，然后依次敲除下列基因：转运果糖磷酸化的pts途径(FruA)基因、转运葡萄糖的磷酸化pts途径(ptsg)基因、葡萄糖激酶(glk)基因，6-磷酸果糖激酶I、6-磷酸果糖激酶II、甘露糖果糖激酶(mak)，确保大多数的D-葡萄糖都转化合成D-阿洛糖，为了不影响工程菌的生长，在培养基中加入甘油供菌生长。在不影响菌种生长的情况下，使之尽可能多产D-阿洛糖。
一种利用葡萄糖和甘油生物合成D-阿洛糖的方法，其特征在于：在甘油和葡萄糖共存的情况下，能够实现碳水化合物的共利用，通过敲除ptsG基因与FruA基因，来消除葡萄糖与果糖对甘油利用的抑制，在过表达内源基因Galp基因提高葡萄糖进入细胞的非磷酸化途径，使得葡萄糖能够更快速的进入胞内，进行后续合成反应。
进一步，所述的利用D-葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法，包括以下步骤：
(1)构建并表达合成D-阿洛糖路径的基因，包括gi,dpe,rpiB；
(2)构建及过表达非磷酸途径转移D-葡萄糖的基因Galp；
(3)敲除糖酵解途径的基因，即glk、pgi、mak和pfkA/B，敲除ptsG和FruA基因解除ccr效应。
所述方法详述如下：
进一步，步骤(1)中的基因gi基因来自于链霉菌属，在这里是人工合成，序列参照NCBI，dpe,rpiB分别来源于根癌农杆菌属和热纤梭菌属，参考NCBI number。构建并表达由D-葡萄糖合成D-阿洛糖的途径，这项工作中，涉及到了关键基因的合成，其中化学合成了葡萄糖异构酶基因(gi)，将D-葡萄糖直接异构为D-果糖；阿洛酮糖差向异构酶基因(dpe)，将D-果糖异构为D-阿洛酮糖；以及核糖-5-磷酸异构酶基因(rpiB)，将阿洛酮糖异构为D-阿洛糖。扩增上述基因然后与载体(pETDuet-1)连接，构建成我们需要的重组质粒pETDuet-1-dpe-rpiB-gi，将重组质粒转染到大肠杆菌JM109(DE3)中，得到可以合成D-阿洛糖的菌株。
进一步，步骤(2)中过表达的Galp基因是大肠杆菌自身的基因，用于表达非磷酸化转运葡萄糖的膜蛋白。过表达了Galp基因。为了提高D-葡萄糖转运的非磷酸途径的效率，构建表达了Galp基因，在解除ccr效应后进一步使得非磷酸化效率更高。将上述基因与载体(pRSFDuet-1)连接，构建成我们需要的质粒pRSFDuet-1-Galp，将其转染到上述带有重组质粒pETDuet-1-dpe-rpiB-gi菌株中，构建完成。
进一步，步骤(3)在统一菌株中连续敲除基因的顺序必须是FruA，ptsG，敲除之后解除ccr效应，可以实现葡萄糖和甘油共利用。后再敲除pfka，glk，mak，pfkb。来阻断葡萄糖和果糖的消耗。代谢路径中相关基因的敲除。利用Red同源重组来敲除FruA和ptsG(D-葡萄糖和D-果糖进入细胞的磷酸化途径)，敲除这两个基因的目的是，解除ccr效应，又可提高非磷酸化途径的效率，继而后续接着敲除了glk和mak，截断了D-葡萄糖和D-果糖消耗的途径，从而更专注的生产目标产物，最后为了防止碳流的流失，敲除了pfka和pfkb，从而进一步完善通路，提高产物产量。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
在本发明中，利用了廉价的葡萄糖和甘油，通过敲除关键基因和过表达特定基因实现多种碳水化合物共利用，在后续截断了葡萄糖和果糖的消耗途径，从而实现葡萄糖提供生产，由于解除了ccr效应，使得甘油和葡萄糖的共同代谢，甘油提供生长。而在原始菌株中，是做不到这些的。本发明构建并提高了D-阿洛糖的产量，通过进一步改造途径，使得产量明显提高。
附图说明
图1是生物合成D-阿洛糖的途径构建与葡萄糖和果糖的基本代谢通路。
图2是合成D-阿洛糖载体构建示意图与非磷酸转运途径基因Galp的过表达的载体构建。
图3是ptsg、pfkB、glk、mak、pfkA、FruA基因敲除验证胶图。
具体实施方式
以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施案例1
培养基种类如下
LB培养基：
蛋白胨 10g/L
酵母粉 5g/L
氯化钠 10g/L
M9培养基：
将构建的合成D-阿洛糖的菌株JM109(DE3)-pETDuet-1-dpe-rpiB-gi-pRSFDuet-1-Galp，(质粒构建如图1)在-80℃保存的菌株，取出后将其放置常温，在超净台取4微升接入4毫升的灭菌的LB试管中，并加入试管培养基体积千分之一ampicillin和kanamycin，过夜培养14-16h。
后将上述菌接种带有千分之一ampicillin和kanamycin的摇瓶LB培养基中，接种量约为培养体积的千分之一，在26～37℃条件下，在摇床中在180-200rpm，培养48～72h，对照组JM109(DE3)-pETDuet-1-pRSFDuet-1与实验组OD600无变化，有阿洛糖产生率极低，说明途径改造有效，且并不影响菌株生长。
实施案例2
在工程菌底盘细胞JM109(DE3)上，进行途径改造，而D-果糖作为重要的中间产物，且由于它在糖酵解途径中的地位，所以在关注D-葡萄糖代谢途径的过程时，也要关注D-果糖的代谢途径。所以敲除基因的顺序必须是FruA，ptsG，敲除之后解除ccr效应，可以实现葡萄糖和甘油共利用。后再敲除pfka，glk，mak，pfkb。来阻断葡萄糖和果糖的消耗。代谢路径中相关基因的敲除。利用Red同源重组来敲除FruA和ptsG(D-葡萄糖和D-果糖进入细胞的磷酸化途径)，敲除这两个基因的目的是，解除ccr效应，又可提高非磷酸化途径的效率。
基因敲除的引物见下表1。
在敲除完成后(验证图如图3)，在分别在单纯的葡萄糖和果糖的培养基中培养，菌密度基本不变，说明敲除有效。同时在LB培养基中进行培养，菌种可以生长，即可进行下一步操作。对培养基成分进行调整。
在途径构建时，敲除了糖酵解途径的前半部分，在三碳化合物往后是未改造的，所以选择了甘油作为菌种生长的碳源。对照组(葡萄糖5～15g/L)与实验组(含5～15g/L葡萄糖和5～30g/L甘油)进行对比实验，证明可行。
实施案例3
首先制备携带相应质粒的菌株，4微升的菌株(JM109DE3/六敲JM109DE3)接入LB试管中，37°180rmp过夜培养；放大，取20微升种子液接入含20mL的LB培养基的小摇瓶中，培养两小时，OD约为0.6-0.8；将摇瓶取出冰浴10min,保证细胞活性；分装，每管1mL分装到16个1.5mL的离心管中，后离心6000rmp 4℃4min,弃上清液；合管，沉淀用800微升的10％甘油混悬，4管逐步合1管，后离心6000rmp 4℃4min,弃上清液；洗菌，每管用800微升的10％甘油混悬后离心6000rmp 4℃4min,弃上清液；重复上一步骤；最后4管分别用100微升10％的甘油混悬，感受态制成。
取质粒2微升(pETDuet-1-dpe-rpiB-gi/pRSFDuet-1-Galp)加入感受态中，轻轻混悬；将混悬物加入预冷的电转杯中，电击后，快速加入预冷的1mL LB放离心管中；电转完成后，放摇床中复苏1h，培养温度为37℃；后进行。
取100微升的菌液涂在倒好的平板上，涂干为止；剩余离心1min12000rpm,倒掉上清，剩余100微升即可；过夜培养14-16h，有单克隆菌落后进行菌落PCR验证，挑一半的菌进行菌P，验证得到正确的重组子；另一半的菌保存在冰箱，验证后，挑到LB试管中过夜培养，保存甘油管。
将构建的合成D-阿洛糖的六敲菌株JM109(DE3)-pETDuet-1-dpe-rpiB-gi-pRSFDuet-1-Galp和对照组JM109(DE3)-pETDuet-1-dpe-rpiB-gi-pRSFDuet-1-Galp与JM109(DE3)-pETDuet-1-pRSFDuet-1，三个菌株接种到带相应抗性的LB试管中过夜培养，在M9培养基(含5～15g/L葡萄糖和5～30g/L甘油)中培养14-16h后，进行发酵接种，发酵培养72-90h，消耗～7/L,D-果糖同时产生～3.5g/L，转化率约为50％，由果糖转化产生D-阿洛糖～1.2g/L，转化率约为10％，说明构建放入系统发挥了作用。
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