支链酮酸(bcka)的混合物和制备这样的混合物的方法
阅读说明：本技术 支链酮酸(bcka)的混合物和制备这样的混合物的方法 (Mixtures of branched ketoacids (BCKA) and methods of making such mixtures ) 是由 C·贾雷基 D·费特 于 2019-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及制备两种或更多种支链酮酸的均匀混合物的方法,其中在第一步骤中,将两种或更多种游离酮酸混合,和在第二步骤中,将混合的酮酸与一种或多种碱土金属盐共结晶,并涉及含有支链酮酸混合物的食物、食品补充剂或药物产品,其用于支持肌肉结构、提高肌肉性能和改善总体健康状况,同时通过与摄入相应氨基酸相比减少的氮供应和改善的体内氮代谢而减轻了氮解毒代谢。(The present invention relates to a method for preparing a homogeneous mixture of two or more branched-chain keto acids, wherein in a first step two or more free keto acids are mixed and in a second step the mixed keto acids are co-crystallized with one or more alkaline earth metal salts, and to a food, food supplement or pharmaceutical product containing a mixture of branched-chain keto acids for supporting muscle structure, increasing muscle performance and improving overall health, while reducing nitrogen detoxification metabolism by a reduced nitrogen supply and an improved nitrogen metabolism in vivo compared to the intake of the corresponding amino acids.)
技术领域
本发明涉及制备两种或更多种支链酮酸的均匀混合物的方法，其中在第一步骤中，将两种或更多种游离酮酸混合，和在第二步骤中，将混合的酮酸与一种或多种碱土金属盐共结晶。本发明还涉及含有支链酮酸混合物的食物、食品补充剂和药物产品，其用于支持肌肉结构，提高肌肉性能和改善总体健康状况，同时通过与摄取相应氨基酸相比减少的氮供应和通过改善的体内氮代谢而减轻了氮解毒代谢。
背景技术
缺乏身体运动是可能导致体能下降并因此导致生活品质降低的一个危险因素。为了防止体能下降以及为了重建体能，体育锻炼是必不可少的，其中发生一系列的细胞过程，例如肌肉损伤和肌肉分解，肌肉再生，肌肉肥大和肌纤维转化。在所述细胞过程中，能量和蛋白质代谢起到决定性作用。因此，氨基酸的供应对于在肌肉组织中发生的代谢过程起到决定性作用。特别地，支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是蛋白质生物合成中必要的底物和重要的调节剂，并且是骨骼肌中谷氨酰胺和丙氨酸合成的主要氮源。此外，丙氨酸还是糖异生作用的重要前体，并且谷氨酰胺起到在器官之间的氮转运体的作用。
蛋白质的平均需求量为约660mg/kg体重，然而其可能通过体育锻炼显著提高。蛋白质的需求一般可通过均衡饮食来满足，然而所述均衡饮食是不容易实现的。体育锻炼，由于增加的蛋白质降解和减少的蛋白质合成，会导致对营养物的需求有变化，此外还导致改变的代谢位置结果，其例如是由于体育锻炼对激素系统的影响引起的，和最后，还有缺乏关于随着身体负荷增加而适当饮食的知识，尤其是与年龄有关的，使得营养不良可能迅速发生。
出于这些原因，在经历身体负荷的个体中使用食品补充剂似乎是合乎逻辑的。关于这一点，已经进行的研究具有不同结果，这些结果与补充肌酸对受试者效能的影响有关。此外，已知可以通过高的碳水化合物供应来促进肌肉再生。
过去，对使用支链氨基酸(BCAA)作为饮食替代品同样进行了深入研究，但没有明确的结果。尽管在一项研究中报道了通过补充BCAA提高了精神和身体性能(Blomstrand,E.等人，Eur.J.Appl.Physiol.Occup Physiol 63:83-88,1991)，但在另一项研究中，未发现对体能有影响(van HG,Raaymakers,Saris,Wagenmakers,J.Physiol 486(Pt3),789-794,1995)。
支链氨基酸的α-酮酸同样在氨基酸代谢中起重要作用，尤其是在骨骼肌和肝脏中。肌肉蛋白质的三分之一由支链氨基酸组成，这些支链氨基酸不能由身体形成，而是必须随食物一起摄入。在肌肉中，尤其是在体力消耗的情况下，蛋白质会被连续不断地合成和分解，其中在氨基酸的分解中，伴随着氨基基团转移到载剂上形成相应的α-酮酸。获得的酮酸然后可进一步被酶促氧化以产生能量。所述载剂被运输到肝脏，并在那里释放出有毒的氨，所述氨必须被转化成尿素并经由肾脏排泄。
衍生自支链氨基酸的α-酮酸用于药物目的的用途早已为人所知。例如，特别地，α-酮异己酸盐(alpha-keto isocaproate)(酮亮氨酸)可用于减少肌肉中的蛋白质分解和用于减少在肌肉活动后由蛋白质分解导致的尿素形成(US 4,677,121)。该文献中还描述了酮亮氨酸在营养不良、肌肉萎缩症或尿毒症以及其它疾病中的用途，这些疾病是在肌肉中蛋白质分解的次要后果。在这种情况下，通过静脉注射给药酮亮氨酸。此外，已经提出对必须维持减少蛋白质饮食(例如由于肾衰竭)的患者给药亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的α-酮酸(US 4,100,161)。α-酮酸在蛋白质代谢中关于各种医学指征的作用还描述在Walser,M.等人,Kidney International,第38卷(1990)，第595-604页中。
相反，在功能性食品领域中，支链氨基酸被直接用于支持肌肉增长，例如在运动员中(Shimomura,Y.等人，American Society for Nutrition)。在US 6,100,287中描述了亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的α-酮酸用于改善肌肉性能以及也用于支持疲劳后肌肉恢复的用途，其中使用由相应的阴离子酮酸与作为抗衡离子的阳离子氨基酸形成的盐，所述阳离子氨基酸例如精氨酸或赖氨酸。然而，结果是还形成了多胺，已知它们可能导致细胞凋亡(程序性细胞死亡)。多胺分解产物的排泄是经由肾脏进行的，因此肾脏受到进一步的压力。
WO 2008/122613描述了含有支链氨基酸的α-酮类似物的食品补充剂，其用于支持肌肉结构，增加肌肉性能和改善总体健康状况，同时通过与摄取相应氨基酸相比减少的氮供应和改善的体内氮代谢而减轻了氮解毒代谢。尤其公开了具有α-酮异己酸盐和α-酮异戊酸盐或α-酮β-甲基戊酸盐的组合或α-酮异戊酸盐和α-酮β-甲基戊酸盐的组合或所有三种α-酮酸或它们的盐的组合的食品补充剂。此外，不同的α-酮类似物的特定比例是优选的。
从US 2011/0257236A1和US 4,677,121中已知，比例约为2:1:1的支链氨基酸L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸和它们各自的酮酸的两种组合都能够抑制在剧烈运动过程中对肌肉的损害。另外，已经非常成熟的是，将酮酸亮氨酸、异亮氨酸，缬氨酸和羟蛋氨酸用在药物中，其用于在慢性肾脏疾病的情况下维持蛋白质水平(描述在US 4,100,160和US 4,100,161中)。尽管报道了支链L-氨基酸的联合加工的方法和优点，但到目前为止，单独的支化酮酸和羟蛋氨酸作为钙盐形式的加工已经被报道。
然而，当分别制备支链酮酸盐和在随后的阶段将它们混合时，所述支链酮酸盐具有不同的粒子尺寸分布并且它们的晶型也是不同的。特别地，酮异亮氨酸的钙盐具有非常大的晶体。结果，难以制备所述支链酮酸盐的均匀混合物，并且必须将产物研磨以提供适用于保健品的均匀混合物。为了提供具有均一粒子尺寸分布的均匀混合物，可例如应用干掺混法，其中需要对几种具有不同粒子尺寸的组分进行称重、预混、研磨和再次混合以确保均匀性。根据所述混合物中希望的组成，作为第一步，将适量的单独释放的氨基酸称重用于预混合步骤。为了进行预混合，需要将所述混合物转移到干燥机中并将其在干燥机中混合，以获得均匀混合物。在随后的步骤中，需要将所述混合物研磨以获得适当的均一粒子尺寸分布。在最后的混合步骤中，需要将所述混合物转移到干燥机中以获得均匀的氨基酸混合物。
从现有技术出发，需要具有支链酮酸的组合的食品补充剂，其提升运动后的健康状况、增加肌肉合成和肌肉的效率并永久降低新陈代谢的氮负担。更具体地，需要以预定比例由支链酮酸组成的均匀混合物，并且需要简化的制备具有均一粒子分布的均匀混合物的方法，所述混合物含有酮类似物和必需氨基酸的酮基和羟基组分。
发明内容
所述问题通过提供一种制备两种或更多种酮酸的均匀(homogenous)混合物的方法来解决，其中
—在第一步骤中，将两种或更多种支链酮酸混合，和
—在第二步骤中，将混合的酮酸与一种或多种碱土金属盐共结晶。
令人惊奇的发现是，在两种或更多种酮酸共结晶后，无需额外的加工即可实现这种产物的均匀性。所获得的混合物具有均一的粒子尺寸分布和均一(homogenous)的晶型。
在一个优选的实施方案中，所述碱土金属选自镁和钙，优选钙。
特别优选的是，所述碱土金属盐选自碳酸钙、氢氧化钙、乙酸钙、氯化钙、氧化钙、氢氧化镁和乙酸镁。
在本发明的一个替代性实施方案中，在根据本发明的方法中使用的酮酸选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸、酮苯丙氨酸和羟蛋氨酸。在一个优选的实施方案中，所述酮酸选自酮亮氨酸、酮缬氨酸和酮异亮氨酸。
在本发明的一个实施方案中，将游离的酮酸以希望的摩尔比例加入到水或母液溶液中，所述水或母液溶液中已经加入了化学计量量的碱土金属盐。
在这个实施方案中，优选通过再循环所述母液使水相被产物饱和。所述母液的这种再循环具有预料不到的效果—由于所述母液的最佳饱和，发现无需调节组成以补偿变化的溶解度就可以实现目标组成。将游离的酸以希望的比例加入到母液溶液中，所述母液溶液中已经加入了化学计量量的钙盐。
在一个备选的实施方案中，所述游离的酮酸是作为水溶液或作为在有机溶剂中的溶液添加的，所述有机溶剂优选选自甲基异丁基酮、丙酮和叔丁基甲基醚。
在本发明的一个优选配置中，在共结晶步骤之前使用以下方法中的一种将混合的酮酸纯化：水蒸气蒸馏、溶剂萃取、离子交换色谱法或与碱土金属盐一起粗结晶。
所述酮酸可经由化学合成或经由发酵过程制备。纯化通常是通过溶剂萃取，或通过水蒸气蒸馏，然后成盐来实现的。
在本发明的一个进一步优选的配置中，使用联合水蒸气蒸馏纯化混合的酮酸，以与输入物类似的比例提供纯化的酮酸的水溶液。考虑到沸点的不同：酮缬氨酸游离酸(在5毫巴下为70-80℃)，酮亮氨酸游离酸(在5毫巴下为约100℃)和酮异亮氨酸游离酸(在5毫巴下为约115℃)，这是一个令人惊奇的结果。
本发明的另一个主题是可通过如上所述的方法获得的至少两种酮酸的混合物，其中所述混合物包含混合的碱土金属盐并具有均一的粒子尺寸分布和均一的晶型。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述混合物中的粒子尺寸不大于400μm，优选不大于300μm，更优选不大于200μm或最优选不大于150μm。
在一个特别优选的配置中，所述混合物含有酮亮氨酸和酮异亮氨酸的混合钙或镁盐。
在一个特别优选的配置中，所述混合物含有酮亮氨酸和酮缬氨酸的混合钙或镁盐。
在一个特别优选的配置中，所述混合物含有酮异亮氨酸和酮缬氨酸的混合钙或镁盐。
在一个特别优选的配置中，所述混合物含有比例大致为2:1:1的酮亮氨酸、酮异亮氨酸和酮缬氨酸的混合钙或镁盐。
在一个特别优选的配置中，所述混合物含有酮亮氨酸、酮异亮氨酸、酮缬氨酸、羟蛋氨酸和酮苯丙氨酸的混合钙或镁盐。
本发明还涉及含有根据上述实施方案的酮酸混合物的食物、食品补充剂或药物产品。
此外，可以将另外的无氮添加剂添加到食品补充剂中。可被特别强调的那些是给能化合物，其优选选自碳水化合物，例如葡萄糖，而且还有促进再生过程的添加剂，例如维生素，特别是维生素A，维生素B1、B2、B6和B12，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，泛酸，烟酸，叶酸，生物素，胆碱和肌醇。此外，在所述食品补充剂中还可存在抗氧化剂，例如β-胡萝卜素、柠檬酸钾、柠檬酸、乳酸、生育酚、抗坏血酸钠或抗坏血酸钾或抗坏血酸。选自钠、钾、镁、钙、铁、锌、锰、铜、硒、铬、磷和碘的矿物质和微量元素同样可作为添加剂。在这种情况下，以食品领域常规的量添加所述添加剂。
优选的食品补充剂可含有例如(在每种情况下的量均为优选的日剂量)：
10-500mg钠，
10-500mg钾，
50-500mg钙，
10-300mg镁，
1-20mg锌，
5-50mg铁，
0.1-1mg碘，
5-100μg硒，
5-100μg铬，
最高至100mg维生素B1，
最高至100mg维生素B2，
最高至100mg维生素B6，
最高至200mg维生素B12，
最高至5g维生素C，
最高至500mg维生素E，
最高至300mg泛酸，
最高至1g烟酸，
最高至10mg叶酸，
最高至1mg生物素。
可考虑作为添加物的另外的添加剂是饱和或不饱和脂肪酸，特别是C6-C22脂肪酸。此外，可以使用选自葵花油、芝麻油、菜籽油、棕榈油、蓖麻油、椰子油、红花油、大豆油、猪油、牛脂和鱼油的脂肪和油。此外，在食品补充剂中还可以本领域技术人员已知的常规量存在防腐剂、食用染料、甜味剂、增味剂和/或香味物质。特别地，考虑掩味物质作为添加剂，因为例如游离的α-酮酸可能尝起来是酸的或它们的盐可能尝起来令人不愉快。如果所用的添加剂的用量相对大，则在这种情况下可以使用无氮添加剂。然而，特别优选的食品补充剂不含有含氮添加剂。
所要求保护的食品补充剂可例如以粉末、片剂、微片、丸剂、颗粒剂、小袋、胶囊的形式或以溶液或悬浮液的形式使用。在片剂形式中，优选将所述α-酮酸或其盐以约30至80体积％配制在所述食品补充剂中，优选使用无氮添加剂，特别是碳水化合物、脂肪和油，并且如果合适，还有氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，它们可以约70至20体积％的量存在于所述食品补充剂中。
例如，胶囊可用以下物质填充：包衣丸剂形式的本发明的组合物或包衣颗粒剂，其中“包衣”意思是至少被涂层涂覆。在另一个实施方案中，本身被涂层包衣的胶囊可用以下物质填充：包衣或未包衣的丸剂，粉末，或包衣或未包衣的颗粒剂。
如果希望以粉末或片剂形式直接给药食品补充剂，则添加常规载剂可能是有利的。合适的载剂例如是线性或(超)支化聚酯，聚醚，聚甘油，聚乙交酯，聚丙交酯，聚丙交酯-共-乙交酯，聚酒石酸酯和多糖或基于聚环氧乙烷的树枝状聚合物，聚醚树枝状聚合物，包衣的PAMAM树枝状聚合物，例如，聚丙交酯-共-乙交酯涂层或聚芳基醚。
所述片剂、丸剂或胶囊还可另外具有包衣，以例如允许所述食品补充剂首先在肠道中释放。在这种情况下，优选使用以下包封材料：羧甲基纤维素，硝酸纤维素，聚乙烯醇，虫胶，角叉菜胶，藻酸盐，明胶，醋酸邻苯二甲酸纤维素，聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯(HPMC-AS)，纤维素乙酸偏苯三酸酯，乙基纤维素，聚甘油，聚酯或基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸/丙烯酸的酯或它们的衍生物的共聚物(例如)。
相反，如果给药所述食品补充剂的溶液或悬浮液，则添加乳化剂或胶体可能是有用的，以便能够在水性体系中尽可能好地吸收所有希望的组分。合适的添加剂例如是聚乙烯醇，可食用脂肪酸的甘油酯，它们的乙酸、柠檬酸、乳酸或酒石酸的酯，聚氧化亚乙基硬脂酸酯，可食用脂肪酸的碳水化合物酯、丙二醇酯、甘油酯或脱水山梨糖醇酯，或十二烷基硫酸钠。
本发明进一步涉及含有所要求保护的食品补充剂的食品(功能性食品)。这些可以是例如特别适合于消耗所述食品补充剂的饮料或棒类(bar)。
在这种情况下，可以将所述食品与所要求保护的食品补充剂在它们的制备过程中混合，或者可以随后将所述食品补充剂的配制剂例如以粉末或片剂的形式添加到所述食品中。此处例如可提及的是将泡腾片剂或粉末溶解在矿泉水中。
原则上可以全天使用所描述的食品补充剂或食品，但是特别在体力消耗期间或之后是推荐的。体育锻炼会导致肌肉适应性调整，其包括肌肉损伤、肌肉肥大和肌肉转化。在这种情况下，训练单元被认为是训练阶段和再生阶段的组合。训练单元的欠佳设计可能会导致例如过度训练综合症，其表现为持久的疲劳和降低的体能。这种过度训练综合症常常由营养不良所引起或加剧。
在所述方面中，本发明的食品补充剂特别针对运动员，在这种情况下，针对娱乐性和顶级运动员二者，包括力量运动员，以及对健康和健身感兴趣的那些运动员。同样特别有利的是由老年人使用食品补充剂，所述老年人已知常常具有有限的氮经济性和有限的氮排泄能力。
本发明进一步涉及所要求保护的食品补充剂的以下用途：用于制备可以口服的产品，所述产品例如功能性食品，特别是饮料、凝胶、乳脂、肉汤、能量棒等，以及片剂，粉末，其例如可以在小袋、袋子、管中提供，和用于支持肌肉构建，肌肉系统的功效，用于保护肌肉系统免受应激下的细胞损伤，用于提高总体健康状况，总体体能和用于支持躯体应激后的肌肉再生，同时缓解关于氮解毒的新陈代谢。
本发明还涵盖用于医疗目的的食品，例如食品、饮料、补充剂、用于医疗目的的特殊食品或药物产品。
因此，本发明还涵盖根据上述实施方案的混合物用于制备食物、食品补充剂或药物产品的用途。
具体实施方式
实施例
方法的起始材料是经由化学或发酵过程制备的酮酸的钠盐水溶液。表1列出了起始溶液的优选浓度。
表1：单一酮酸钠盐的起始溶液的优选浓度。
所述酮酸可经由先前报道的化学或发酵过程制备。可通过水蒸气蒸馏、溶剂萃取或从发酵溶液中粗沉淀，然后进行成盐来实现纯化。
在图1中描绘了工艺流程的一个实例，图1显示了大致2:1:1的酮亮氨酸:酮缬氨酸:酮异亮氨酸钙盐的共蒸馏和共结晶。如图1所示的，将支链酮酸酮亮氨酸(KIC)、酮缬氨酸(KIV)和酮异亮氨酸(KMV)组合并在约pH 1下酸化。在添加水的情况下，进行联合水蒸气蒸馏，然后使用Ca(OAc)2成盐。将所得产物浓缩并共结晶，并且可以将其在最后一步中分离。
实施例1：使用联合水蒸气蒸馏纯化支链酮酸(BCKA)
将酮亮氨酸(331g 6.9重量％溶液，含有22.8g钠盐)，酮异亮氨酸(61g 18.8重量％溶液，含有11.4g钠盐)和酮缬氨酸(144g 8.6重量％，含有12.4g钠盐)的钠盐溶液以上文指定的浓度加入到耐酸容器中，从而获得2:1:1.2的基于活性物质的比例。在本实施例中描述的酮缬氨酸的量适用于将新鲜液用于成盐的过程(描述参见实施例5-7)。当使用再循环的母液时，可以将酮缬氨酸的比例降低到1。
在环境温度下在搅拌情况下，加入约165g 50重量％的硫酸以将溶液的pH调节至pH<1。在调整pH后，加热和抽真空以实现在60-80℃/200-300毫巴下的蒸馏(更高的温度将导致游离酮酸的热分解)。
加入另外的水，并在270-300毫巴真空下于最高80℃下进行蒸馏，直至蒸馏出约42g/g酮酸。馏出物含有约2.2重量％的BCKA。
已发现可以同时蒸馏这三种支链酮酸，从而提供了比例与输入物类似的经纯化酮酸的水溶液(参见图2，其显示了在联合水蒸气蒸馏过程中游离酮酸的面积％组成)。
对底液(残余物)的分析表明，所述酮酸的回收几乎是定量的。此外，还发现，当与单个酮酸的蒸馏相比较时，联合蒸馏在水蒸气消耗方面的效率总体上是更好的。如图2中所示的，这对于酮异亮氨酸尤其如此。
总重量
酮酸含量
g水/g酮酸
酮酸混合物
529.8g
12.0g
44.2
酮亮氨酸
534.0g
12.0g
44.5
酮缬氨酸
425.6g
12.0g
35.5
酮异亮氨酸
638.3g
12.0g
53.2
表2：游离酮酸蒸馏的效率，以每克游离酸的克/水表示
实施例2：使用溶剂萃取纯化支链酮酸
以如下摩尔比例将以下酮酸作为它们各自的游离酸、钠盐或钙盐形式添加至水中以提供约5％(重量/体积)溶液：酮缬氨酸:酮亮氨酸:酮异亮氨酸为约1:2:1。将所述溶液用盐酸水溶液在环境温度下调节至pH<1，然后用甲基异丁基酮(MIBK)萃取该酸性溶液。将含有所述游离酮酸的MIBK溶液加热到60℃，然后添加碳酸钙固体以将pH调整到>3(目标：3-5，在给定的实施例中略有超出)。将该两相混合物加热至80℃，使各层沉降，然后分离。在80℃下用MIBK进一步萃取下部的水层(含产物)以除去杂质，并然后真空蒸馏以去除残留的MIBK和使批料部分地浓缩，将水层冷却至环境温度以使产物结晶。将固体通过过滤进行分离，用水洗涤，然后在真空下在最高75℃下干燥至干。
实施例3：通过从发酵溶液中沉淀纯化支链酮酸
用盐酸水溶液将酮亮氨酸发酵溶液的约5％水溶液酸化至pH为约2。在环境温度下加入碳酸钙固体直到pH为>3(目标：约3-5)。将沉淀的固体通过过滤进行分离，用水洗涤，然后在真空下在最高75℃下干燥至干。
实施例4(对比例)：制备单独支链酮酸的钙盐
用钙盐(通常为碳酸钙、氢氧化钙或乙酸钙)使游离酮酸结晶(或更准确地说，成盐)的方法是非常成熟的。所述游离酮酸可以作为水溶液(如果充分稀释)或者作为在一种或多种有机溶剂(例如(但不限于)甲基异丁基酮、丙酮、叔丁基甲基醚)中的溶液的形式添加。
当分别制备所述三种酮酸盐时，它们具有不同的粒子尺寸分布，并且它们的晶型也完全不同。图3显示了单个支链酮酸钙盐的显微镜照片(倍率：100倍，比例尺为200μm)；a)酮缬氨酸Ca盐；b)酮亮氨酸Ca盐；c)酮异亮氨酸Ca盐。特别地，酮异亮氨酸的钙盐具有特别大的晶体。单个支链酮酸钙盐的相应粒子尺寸分布(PSD)在图4中示出，并且清楚地显示酮缬氨酸、酮亮氨酸和酮异亮氨酸的钙盐的变化的粒子尺寸分布；a)酮缬氨酸Ca盐；b)酮亮氨酸Ca盐；c)酮异亮氨酸Ca盐—x轴表示以μm为单位的粒子尺寸，和y轴表示粒子的％。红线描绘了粒子的总和。
结果，难以制备所述酮酸盐的均匀混合物，并且必须将产物研磨以获得适用于保健品或任何其它应用的混合物。
实施例5：制备钙盐的混合物(用乙酸钙)
在共结晶的情况下，起始游离酮酸的组成必须考虑所述钙盐溶解度的可变化性(比较表3，其显示了在20℃下在水中的溶解度，以g/L为单位)以实现在成品中希望的比例：
表3：酮酸和α-羟蛋氨酸的水溶解度(在20℃下，以g/L为单位)
一般来说，为了使结晶过程的收率最大化，常常应用母液的再循环。在共结晶的情况下，母液的这种再循环具有预料不到的效果——由于母液的最佳饱和，发现无需调整组成以补偿如上文所述的变化的溶解度即可实现目标组成，可以简单地将游离酸以希望的比例加入到其中已加入化学计量量的钙盐的母液溶液中。这在图5中对于支链酮酸酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮亮氨酸举例示出。
组合、酸化和水蒸气蒸馏
在这种情况下，将酮亮氨酸(331g 6.9重量％溶液，含有22.8g钠盐)，酮异亮氨酸(61g 18.8重量％溶液，含有11.4g钠盐)和酮缬氨酸(144g 8.6重量％溶液，含有12.4g钠盐)的钠盐溶液以表1中指定的浓度加入到耐酸容器中，以获得2:1:1.2的基于活性物质的比例。在本实施例中描述的酮缬氨酸的量适用于将新鲜液用于成盐的情况(描述参见实施例5-7)。当使用再循环的母液时，可以将酮缬氨酸的比例降低到1。在环境温度下和在搅拌情况下，加入约165g 50重量％的硫酸以将溶液的pH调节至pH<1。在pH调节后，施加热和真空以实现在60-80℃/200-300毫巴下的蒸馏。加入另外的水，并在270-300毫巴真空下于最高80℃下蒸馏，直至蒸馏出约42g/g酮酸。馏出物含有约2.2重量％的BCKA。
成盐和分离
向7.7克(约0.5摩尔当量)乙酸钙在23.3克水中的溶液(约25％溶液)中加入550g含有约12克支链酮酸的游离酮酸馏出物。检查pH后，添加另外量的25％乙酸钙溶液以达到3-4的pH。一旦调节了pH，就将批料加热到75-80℃，在250-350毫巴真空下蒸馏以浓缩，如在以下步骤中描述的。
采用新鲜液的首个批次
将批料在75-80℃下浓缩至约15重量％，然后冷却至约20-25℃以结晶。在约20-25℃下搅拌约1小时后，将产物通过过滤进行分离并将其干燥。产物产量为11.8g，对应于78％(参照起始物料)。保留母液用于随后的批次。
采用再循环母液的后续批次
向78g母液中加入15g(0.5摩尔当量)乙酸钙。向该乙酸钙/母液溶液中，加入550g的游离酮酸馏出物，其含有比例为2:1:1的酮亮氨酸：酮异亮氨酸：酮缬氨酸的约12g支链酮酸。预期pH为3-4。将该批料在75-80℃下浓缩至约11-13重量％，然后冷却至约20-25℃以结晶。在约20-25℃下搅拌约1小时后，将产物通过过滤进行分离并将其干燥。产物产量为12.2-14g，对应于80-94％。保留母液用于随后的批次。
另一方面，通过共结晶制备的产物是均匀的，如图6中所示的，并且具有更均一的粒子尺寸分布(如图7中所示)，这使得其无需进一步处理而适合于应用。图6示出了共结晶的支链酮酸钙盐(2:1:1酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸)的显微镜照片(倍率：100倍，比例尺为200μm)。图7示出了共结晶的支链酮酸钙盐(2:1:1酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸)的粒子尺寸分布(PSD)—x轴显示了以μm为单位的粒子尺寸，和y轴显示了粒子的％。红线描绘了粒子的总和。
当比较根据本发明共结晶的BCKA的混合物与没有任何共结晶或共加工的BCKA的混合物的粒子尺寸分布时，可以进一步看出均一粒子尺寸分布的效果。
如图8a)中所示的，对于共结晶的支链酮酸盐，可以测量到均一的粒子尺寸分布。然而，当混合相同的支链酮酸盐而不进行任何共结晶或共加工时，可以检测到所述三种酮酸的三个不同的峰，其中酮异亮氨酸具有比酮亮氨酸和酮缬氨酸大得多的粒子，所述酮缬氨酸显示出最小的粒子尺寸，如图8b)中所示的。图8显示了a)共结晶的支链酮酸钙盐(2:1:1酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸)和b)支链酮酸钙盐(2:1:1酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸)的混合物的粒子尺寸分布(PSD)—x轴显示了以μm为单位的粒子尺寸，和y轴显示了粒子的体积％。
实施例6：制备钙盐混合物(用碳酸钙)
将支链酮酸按以下摩尔比例加入到BCKA母液中(约5％(重量/体积))：酮缬氨酸:酮亮氨酸:酮异亮氨酸1.1:2:1。将该混合物加热至60℃，然后分份加入约0.5摩尔当量的碳酸钙。将该悬浮液加热至>75℃，并在搅拌一段时间后，将反应混合物冷却至环境温度。将固体通过过滤进行分离，用水洗涤，并干燥。
实施例7：制备钙盐混合物(用氢氧化钙)
制备在水(或者母液)中包含2当量酮酸混合物的5-10％的溶液(可以是单相或两相的)，所述酮酸混合物由1.1:2:1的酮缬氨酸:酮亮氨酸:酮异亮氨酸组成，并将所述溶液加热至约50-70℃。在此温度下，加入约1当量氢氧化钙。一旦添加完成，就将内容物加热至75-90℃以溶解固体，然后将所述溶液冷却至环境温度。通过过滤分离所得的固体，并将其用水洗涤。可以将所述固体在真空下在最高至60℃下干燥。实现的收率为40-80％。当使用再循环母液时实现了更高的收率。
实施例8：制备钙盐混合物
使用与实施例2(用于形成游离酸)和用于成盐/分离的实施例4至7中所述的那些方法类似的方法制备以下钙盐：
·酮苯丙氨酸/α-羟蛋氨酸
·酮苯丙氨酸/酮缬氨酸
·α-羟蛋氨酸/酮异亮氨酸
实施例9：制备镁盐混合物(用乙酸镁)
在50-75℃下，向约1当量的乙酸镁四水合物在水中的约5-10％溶液中添加30-60％的酮酸混合物的甲基异丁基酮(MIBK)溶液，所述酮酸混合物由1.1:2:1的酮缬氨酸:酮亮氨酸:酮异亮氨酸组成(BCKA)。将该两相溶液加热至75-85℃，在该温度下进行相分离。在最大80℃下，将水溶液在真空下浓缩至最小体积，然后在添加正丁醇后，再次浓缩以除去正丁醇残留的水(通过共沸蒸馏)，以提供固体。所述固体可以在真空下在最高至70℃下干燥。实现的收率为约80-90％。表4中显示了不同的支链酮酸镁盐的特性。
表4：支链酮酸镁盐的总结：单一酮酸盐和支链酮酸盐混合物(2:1:1的酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸)
还制备了以下混合物：
酮亮氨酸和酮异亮氨酸的混合镁盐，
酮亮氨酸和酮缬氨酸的混合镁盐，和
酮异亮氨酸和酮缬氨酸的混合镁盐。
实施例10：制备镁盐混合物(用氢氧化镁)
制备在水(或者母液)中包含2当量酮酸的5-10％的溶液(可以是单相或两相的)，并将所述溶液加热至约50-70℃。在此温度下，加入约1当量氢氧化镁。一旦添加完成，就将内容物在75℃下在真空下浓缩直至获得固体。将所述固体干燥。实现的收率为>90％。
实施例11：制备以不同比例的混合钙/镁盐混合物
制备在水(或者母液)中包含2当量酮酸的5-10％的溶液(可以是单相或两相的)，并将所述溶液加热至约50-70℃。在此温度下，以2:1、1:1或1:2的比例加入总共约1当量氢氧化镁/钙。一旦添加完成，就将内容物在75℃下在真空下浓缩直至获得固体。将所述固体干燥。实现的收率为>90％。具有不同混合物比例的支链酮酸的混合钙/镁盐的特性在表5中示出。
表5：具有不同混合物比例的支链酮酸的混合钙/镁盐的总结
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