一种利用nad(p)-依赖型醇脱氢酶催化生产d-阿洛酮糖的方法
阅读说明：本技术 一种利用nad(p)-依赖型醇脱氢酶催化生产d-阿洛酮糖的方法 (Method for producing D-psicose by using NAD (P) -dependent alcohol dehydrogenase as catalyst ) 是由 林建强 温鑫 宋欣 任一林 林建群 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶催化生产D-阿洛酮糖的方法,包括以下步骤：对NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh进行优化合成,构建重组质粒pET22b-adh,构建重组菌株,重组菌株在低温下诱导培养,得到粗酶液,分离纯化粗酶液并经超滤浓缩后得到纯酶液,利用粗酶液或纯酶液构建反应体系催化阿洛醇溶液生产D-阿洛酮糖。本发明方法简单、条件温和、转化效率高,且是本发明首次证实NAD(P)-依赖型醇脱氢酶能够用于催化阿洛醇生产D-阿洛酮糖,因此本发明方法有利于D-阿洛酮糖的工业化生产。(The invention discloses a method for producing D-psicose by using NAD (P) -dependent alcohol dehydrogenase catalysis, which comprises the following steps: for NAD (P) -dependent alcohol dehydrogenase gene adh Optimized synthesis is carried out to construct a recombinant plasmid pET22b- adh Constructing a recombinant strain, carrying out induction culture on the recombinant strain at low temperature to obtain a crude enzyme solution, separating and purifying the crude enzyme solution, carrying out ultrafiltration concentration to obtain a pure enzyme solution, and constructing a reaction system by using the crude enzyme solution or the pure enzyme solution to catalyze the arabitol solution to produce the D-psicose. The method is simple, mild in condition and high in conversion efficiency, and the method proves that the NAD (P) -dependent alcohol dehydrogenase can be used for catalyzing the production of D-psicose from the allol for the first timeThe method of the invention is beneficial to the industrial production of D-psicose.)
技术领域
本发明属于稀有糖生物转化技术领域，具体涉及一种利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶催化生产D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
国际稀有糖协会（International Society of Rare Sugars，ISRS）定义稀有糖为自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀有糖具有低热量、低吸收等特点，并且具有多种多样的生理功能，在膳食、保健、医药等领域发挥重要作用。
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体，是一种超低热量稀有糖，其甜度是蔗糖的70%，且几乎不被消化道吸收，因此D-阿洛酮糖可能会成为一种有利于减肥的理想的蔗糖替代甜味剂。另外，D-阿洛酮糖还具有降低血糖、抗氧化、神经保护以及治疗心血管疾病等作用。D-阿洛酮糖也被美国食品和药物管理局(FDA)批准为“一般认为是安全的”(GRAS），编号为GRN No. 400，允许用作食品和膳食补充剂的成分。
当前，D-阿洛酮糖的生产主要是通过生物转化的方式。据报道，D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（d-psicose 3-epimerase，DPE）、D-塔格糖 3-差向异构酶（d-tagatose 3-epimerase，DTE）或L-核酮糖 3-差向异构酶（l-ribulose 3-epimerases, LRE）皆可催化D-果糖为D-阿洛酮糖。其中，D-阿洛酮糖 3-差向异构酶对D-阿洛酮糖具有较高的底物特异性，具有重要研究价值。但是，利用差向异构酶催化D-果糖生产D-阿洛酮糖会受到热力学平衡的制约，导致D-阿洛酮糖的转化率低，生产能力弱。另外，菌株Bacillus pallidus Y25和Enterobacter aerogenes IK7的静息细胞反应可以实现由阿洛醇直接生产D-阿洛酮糖，但微生物转化法制备D-阿洛酮糖，虽不涉及热力学平衡问题，且工艺步骤简单，但微生物存在生产周期长、反应条件各异，产物提取工艺复杂等问题，也会导致总成本偏高，不适合工业化生产。
酶催化转化法具有催化反应条件温和、转化率高、产物易分离等优点，但目前并未见有关于任何酶催化阿洛醇产生D-阿洛酮糖的专利和报道。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶催化生产D-阿洛酮糖的方法，该方法通过酶催化将阿洛醇转化为D-阿洛酮糖，其操作简单，成本低，可以实现D-阿洛酮糖的规模化生产。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
本发明提供了一种利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶催化生产D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：
（1）重组质粒pET22b-adh的构建：将NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因合成无His标签的重组质粒pETDuet-1-adh，并以此为模板，以引物对adh-pET22b-Nde I-U：5’-GGGAATTCCATATGGCCCAGGCCCTGGTGCTGGAAAAG-3’；adh-pET22b-Xho I-D：5’-CCGCTCGAGCAGAACAATCTGCAGTTTAACATC-3’ 为上下游引物进行PCR扩增，获得的目的基因adh片段，产物回收后利用限制性内切酶Nde I和Xho I分别对质粒pET22b和PCR扩增产物进行双酶切，双酶切产物回收后利用T4连接酶进行连接，得到重组质粒pET22b-adh；
（2）重组菌株的构建：将重组质粒pET22b-adh通过热激转化法转入表达感受态细胞中，再于LB液体培养基上复苏，复苏后，再涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，静置培养过夜；挑取单菌落转接至添加氨苄青霉素的LB培养基中，继续培养得到重组菌株；
（3）粗酶液的制备：将重组菌株按照1%的接种量接种到含有Amp的LBG培养基中，37℃摇床培养至OD600在0.8时添加IPTG，然后将温度降低到20 ℃，继续诱导培养；培养完成后，将菌液低温离心，收集菌体后重悬，再利用超声波破碎仪对重悬菌液进行超声破碎，振幅设置为60，破5 s，停 10 s直到菌液透明，低温离心收集上清液，上清液即为粗酶液；
（4）纯酶液的制备：选择镍柱作为分离纯化柱，将粗酶液过镍柱，先用BindingBuffer冲洗镍柱，再用Elution Buffer淋洗蛋白，得到的淋洗液再利用10 kDa超滤管浓缩纯化至蛋白浓度为20 mg/ml，得到纯酶液；
（5）D-阿洛酮糖的制备：将体积比为10%的纯酶液或粗酶液与体积比为70%的20mMNa2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，10%的500 mM阿洛醇溶液、10%的20 mM NAD+溶液组成反应体系，将反应体系内的溶液混合均匀后置于50 ℃，摇床反应4 h，得到D-阿洛酮糖。
进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶来源于Gluconobacter frateurii。
进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因是根据NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始序列进行密码子优化后合成获得的。
进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因具有下列核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步的，所述步骤（5）中的另一反应体系包括体积比为10%的500 mM阿洛醇溶液和90%的粗酶液。
进一步的，所述Binding Buffer包括20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，30 mM 咪唑，pH7.4。
进一步的，所述Elution Buffer包括20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，200 mM 咪唑，pH 7.4。
进一步的，所述LBG培养基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠和5 g/L葡萄糖。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
本发明是首次利用来源于Gluconobacter frateurii的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）作为生物催化剂，催化阿洛醇转化生产D-阿洛酮糖。本发明方法简单、快速，既可以利用粗酶液也可以利用纯酶液生产D-阿洛酮糖，还能够在不额外添加价格昂贵的辅酶NAD+的情况下生产D-阿洛酮糖；本发明反应条件温和、转化率高、转化时间短、副产物少，尤其是纯酶液副产物极少，转化效果极好；并且该方法得到的产物易分离，成本低，不仅拓展了D-阿洛酮糖的生产方法，还可用于大规模的分离纯化D-阿洛酮糖，适合D-阿洛酮糖的工业化生产，因此该方法具有较高的实际应用价值。
附图说明
图1：重组质粒pET22b-adh构建图。
图2：重组质粒pET22b-adh菌落PCR验证（a）和双酶切验证图（b）；其中M：marker；C1：以pETDuet-1-adh为模板的阳性对照PCR产物；C2：以无菌双蒸水为模板的阴性对照PCR产物；1-10：以重组菌株E.coli DH5a-pET22b-adh单菌落为模板的PCR产物；11：Nde I和Xho I双酶切产物。
图3：SDS-PAGE重组蛋白分析图；其中M：protein marker；1：重组菌株E.coli BL21star (DE3)-pET22b全蛋白；2：重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b-adh全蛋白；3：重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b-adh上清液；4：重组菌E.coli BL21 star(DE3)-pET22b-adh沉淀。
图4：ADH纯化图；其中M：marker；1：ADH粗酶液；2：200 mM咪唑淋洗液。
图5：ADH纯酶液催化阿洛醇为D-阿洛酮糖的液相图；其中1：阿洛醇标准品；2：D-阿洛酮糖标准品；3：反应液。
图6：在添加辅酶NAD+的条件下ADH粗酶液催化阿洛醇为D-阿洛酮糖的液相图；其中1：阿洛醇标准品；2：D-阿洛酮糖标准品；3：反应液。
图7：在不添加辅酶NAD+的条件下ADH粗酶液催化阿洛醇为D-阿洛酮糖的液相图；其中1：阿洛醇标准品；2：D-阿洛酮糖标准品；3：反应液；4：副产物。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）来源于Gluconobacter frateurii NBRC 3264（NZ_BEWN01000006.1），该酶的ID号码为WP_099183078.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh是根据NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始序列进行密码子优化后合成的，优化后的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶催化生产D-阿洛酮糖的方法，具体如下：
一、重组质粒pET22b-adh的构建以及验证
重组质粒pET22b-adh构建谱图如图1所示。
1、PCR扩增目的基因adh：将优化后的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因adh通过生物公司合成的无His标签的重组质粒pETDuet-1-adh，以此为模板，以引物对adh-pET22b-Nde I-U：5’-GGGAATTCCATATGGCCCAGGCCCTGGTGCTG GAAAAG-3’（SEQ ID NO.3）和adh-pET22b-Xho I-D：5’-CCGCTCGAGCAG AACAATCTGCAGTTTAACATC-3’（SEQ ID NO.4）为上下游引物扩增目的基因adh，并对PCR扩增产物进行回收。
2、双酶切质粒pET22b和PCR扩增产物adh：利用限制性内切酶Nde I和Xho I分别对质粒pET22b和PCR扩增产物adh进行双酶切，并对双酶切产物进行回收。
3、连接：利用T4连接酶连接双酶切产物pET22b和adh，得到连接液。
4、构建重组菌E.coli DH5a-pET22b-adh：取50 μL 克隆感受态细胞E.coli DH5α，加入10 μL上述制得的连接液，冰浴30 min；然后在42 ℃水浴中热击45 s，再立即冰浴2min；而后加入500 mL无菌无抗生素的LB液体培养基，37 ℃、200 rpm复苏1 h，取100 mL转化液涂布于含有Amp抗性的LB固体平板，37 ℃静置培养过夜。
5、菌落PCR验证：从上述的LB固体平板上挑取10个单菌落依次混入含有10 μL无菌双蒸水的无菌PCR管中，所得细菌溶液作为PCR扩增模板。另外，设置以重组质粒pETDuet-1-adh为模板的阳性对照C1，设置以无菌双蒸水为模板的阴性对照C2。PCR反应结束后经琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图2a所示，所挑取的10个单菌落皆为阳性，验证成功。
6、双酶切验证：取菌落PCR验证成功的单菌落溶液接种到含有100 μg/ml Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 rpm培养12 h后提取质粒，利用限制性内切酶Nde I和Xho I对质粒进行双酶切，酶切结束后利用琼脂糖凝胶电泳验证adh是否连接成功，所得验证结果如图2b所示，双酶切验证成功。
7、公司测序：对经菌落PCR验证和双酶切验证成功后的重组质粒送测序公司进行测序验证，测序所得序列与已知序列一致，验证成功，最终成功得到重组质粒pET22b-adh。
二、E.coli BL21 star (DE3)-pET22b-adh的构建及SDS-PAGE蛋白表达验证
1、重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b-adh的构建和其诱导培养
（1）取50 μL表达感受态细胞 E.coli BL21 star (DE3)，加入5 μL测序成功的重组质粒 pET22b-adh，冰浴30 min，然后在42 ℃水浴中热击45 s，再立即冰浴2 min，而后加入500 μL无菌无抗生素的LB液体培养基，37 ℃，200 rpm复苏1 h后取100 μL转化液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，37 ℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10 mL LB培养基的50 mL锥形瓶中，并添加氨苄青霉素至浓度为100 μg/ml，37 ℃，200 rpm培养12 h。
（2）按照1%的接种量将重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b-adh接种到含有10 ml LBG培养基的50 mL锥形瓶中，37 ℃，200 rpm培养约3 h至OD600在0.8左右时添加0.2 mM IPTG，然后将温度降低到20 ℃，转速降低至100 rpm，继续诱导培养12 h。其中，LBG培养基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠和5 g/L葡萄糖。
2、对照菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b的构建和其诱导培养
（1）取50 μL表达感受态细胞 E.coli BL21 star (DE3)，加入5 μL空质粒pET22b，冰浴30 min，然后在42 ℃水浴中热击45 s，再立即冰浴2 min，而后加入500 μL无菌无抗生素的LB液体培养基，37 ℃，200 rpm复苏1 h后取100 μL转化液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，37 ℃静置培养过夜。次日，从LB固体平板上挑取单菌落转接至含有10 mL LB培养基的50 mL锥形瓶中，并添加氨苄青霉素至浓度为100 μg/ml，37 ℃，200rpm培养12 h。
（2）按照1%的接种量将重组菌E.coli BL21 star (DE3)-pET22b接种到含有10 mlLBG培养基的50 mL锥形瓶中，37 ℃，200 rpm培养约3 h至OD600在0.8左右时添加0.2 mMIPTG，然后将温度降低到20 ℃，转速降低至100 rpm，继续诱导培养12 h。
3、重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b-adh的蛋白表达验证
各取1mL上述诱导培养所得菌液，14000 rpm离心1 min，除去培养基上清，得到菌体。用无菌双蒸水重悬洗涤菌体两次，14000 rpm离心1 min，除去上清，得到菌体，再加入400 μL无菌双蒸水重悬菌体；然后用超声破碎仪破碎菌体，振幅设置为60，破5 s，停 10 s直到菌液透明。取30 μL用于全蛋白检测，剩余370 μL 14000 rpm离心5 min取30 μL上清作为可溶性蛋白检测，所得沉淀用无菌双蒸水重悬洗涤菌体两次后再加入无菌双蒸水重悬沉淀，取30 μL重悬液作为不可溶蛋白检测。在上述30 μL蛋白样品中各加入6 μL 上样缓冲液，充分混匀后利用PCR仪100 ℃裂解10 min变性。最后，进行SDS-PAGE蛋白电泳验证，所得结果如图3所示，目的蛋白ADH表达，而且主要存在于上清中，是可溶性蛋白。
三、NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）的纯化
按照1%的接种量将重组菌株E.coli BL21 star (DE3)-pET22b和E.coli BL21star (DE3)-pET22b-adh接种于含有100 μg/ml Amp的LBG液体培养基中，37 ℃，200 rpm培养约3 h至OD600在0.8左右时添加0.2 mM IPTG，然后将温度降低到20 ℃，转速降低至100rpm，继续诱导培养12 h。培养完成后，菌液10000 rpm，4℃离心5 min收集菌体，然后按照每1 g菌体添加5 mL Binding Buffer（pH 7.4，20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl，30 mM 咪唑）的比例添加Binding Buffer进行重悬；然后使用超声波破碎仪破碎菌体，振幅设置为60，破5s，停 10 s直到菌液透明，再10000 rpm，4℃离心15 min收集上清液，此上清液即为粗酶液。利用Bradford法对蛋白浓度进行定量，所得粗酶液中蛋白的浓度为20 mg/ml。
选择5 mL镍柱作为分离纯化柱，上清液过镍柱，然后用Binding Buffer冲洗镍柱，再用Elution Buffer（pH 7.4，20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，200 mM 咪唑）淋洗蛋白，得到淋洗液，上述操作均在冰上进行。利用SDS-PAGE对所得淋洗液进行纯度验证，所得结果如图4所示，含有200 mM咪唑的Elution Buffer可以将ADH蛋白洗脱下来，从而得到纯化的ADH蛋白。然后，用10 kDa超滤管浓缩纯化所得ADH蛋白至浓度为20 mg/ml，用于后续反应。
四、NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）纯酶液催化阿洛醇为d-阿洛酮糖的验证
以双蒸水配制500 mM 阿洛醇底物溶液，以双蒸水配制20 mM NAD+溶液，以双蒸水配制20 mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 7.0），以纯化所得ADH纯酶液作为生物催化剂。1 mL反应体系内含有700 μL 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH 7.0）、100 μL 500 mM 阿洛醇底物溶液、100 μL 20 mM NAD+溶液和100 μL ADH纯酶液。将上述溶液混合后，置于50 ℃，200 rpm摇床中反应4 h，利用HPLC对反应液进行检测分析。所用仪器为日本岛津液相色谱仪，检测器为示差折光检测器（RID），色谱柱为赛分科技有限公司的Carbomix Pb-NP 10:8% (7.8×300 mm，10 μm）分析柱，流动相为双蒸水，柱温78 ℃，流速0.5 ml/min，进样量为10 μl。所得HPLC谱图如图5所示，经验证ADH纯酶液可催化阿洛醇为d-阿洛酮糖。
实施例2
1、利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）粗酶液在添加辅酶NAD+的条件下催化阿洛醇为D-阿洛酮糖
以双蒸水配制500 mM 阿洛醇底物溶液，以双蒸水配制20 mM NAD+溶液，以双蒸水配制20mM Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH 7.0），以实施例1所得ADH粗酶液作为生物催化剂。1mL反应体系内含有700μL 20mM Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH 7.0），100 μL 500 mM 阿洛醇底物溶液，100 μL 20 mM NAD+溶液和100 μL ADH粗酶液。将反应混合液置于50 ℃，200rpm摇床中反应6 h，利用HPLC对反应液进行检测分析，所得D-阿洛酮糖的浓度约为3.5 g/L。所得HPLC谱图如图6所示，ADH粗酶液可催化阿洛醇为d-阿洛酮糖。
2、利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）粗酶液在不添加辅酶NAD+的条件下催化阿洛醇为D-阿洛酮糖
以双蒸水配制500 mM 阿洛醇底物溶液，以实施例1所得的ADH粗酶液作为生物催化剂。1 mL反应体系内含有100 μL 500 mM 阿洛醇底物溶液和900 μL ADH粗酶液。将反应混合液置于50 ℃，200 rpm摇床中反应6 h，利用HPLC对反应液进行检测分析，所得d-阿洛酮糖的浓度约为2.8 g/L。所得HPLC谱图如图7所示，虽然ADH粗酶液在不额外添加辅酶NAD+的条件下也可以催化阿洛醇为d-阿洛酮糖，但是与添加辅酶NAD+相比，D-阿洛酮糖的产量低，粗酶液用量较大，而且容易生成副产物。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛龙鼎生物技术有限公司
<120> 一种利用NAD(P)-依赖型醇脱氢酶催化生产D-阿洛酮糖的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> PRT
<213> Gluconobacter frateurii
<400> 1
Met Ala Gln Ala Leu Val Leu Glu Lys Lys Gly Glu Leu Ser Leu Arg
1 5 10 15
Glu Ile Ala Leu Pro Ser Glu Leu Gly Pro Asn Asp Val Arg Ile Ala
20 25 30
Ile His Thr Val Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Tyr Tyr Thr His
35 40 45
Gly Ala Ile Gly Pro Phe Val Val Arg Glu Pro Met Val Leu Gly His
50 55 60
Glu Ala Ser Gly Thr Ile Thr Glu Ile Gly Ser Asn Val Arg Ser Leu
65 70 75 80
Lys Val Gly Asp Arg Val Cys Met Glu Pro Gly Ile Pro Asp Pro Gln
85 90 95
Ser Arg Ala Thr Leu Met Gly Gln Tyr Asn Val Asp Pro Ala Val Arg
100 105 110
Phe Trp Ala Thr Pro Pro Ile His Gly Cys Leu Thr Pro Ser Val Val
115 120 125
His Pro Ala Ala Phe Thr Phe Lys Leu Pro Asp Asn Val Ser Phe Ala
130 135 140
Glu Gly Ala Met Ile Glu Pro Leu Ala Val Gly Val His Ala Ser Val
145 150 155 160
Lys Ala Ala Ile Lys Pro Gly Asp Ile Cys Leu Val Thr Gly Cys Gly
165 170 175
Pro Ile Gly Ile Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gly
180 185 190
Gln Val Phe Ile Thr Asp Leu Ala Pro Ala Lys Leu Ala Ile Ala Gly
195 200 205
Gln Tyr Asp Gly Ile Arg Pro Ile Asn Val Arg Asp Glu Lys Pro Arg
210 215 220
Asp Val Val Asp Ala Thr Cys Gly Ser Asp Trp Gly Val Asp Val Val
225 230 235 240
Phe Glu Ala Ser Gly Phe Ala Gly Ala Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Cys
245 250 255
Val Arg Pro Gly Gly Thr Ile Val Phe Val Gly Met Pro Ile Gln Lys
260 265 270
Val Pro Phe Asp Ile Val Ala Ala Gln Ala Lys Glu Ile Arg Met Glu
275 280 285
Thr Val Phe Arg Tyr Ala Asn Val Tyr Asp Arg Ala Ile Arg Leu Ile
290 295 300
Ser Ala Gly Lys Ile Asp Leu Lys Pro Leu Val Ser Glu Thr Phe Pro
305 310 315 320
Phe Asp Gln Gly Ile Ala Ala Phe Glu Arg Ala Ala Glu Ala Arg Pro
325 330 335
Ser Asp Val Lys Leu Gln Ile Val Leu
340 345
<210> 2
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcccagg ccctggtgct ggaaaagaaa ggcgaactga gtctgcgcga aattgccctg 60
ccgagcgaac tgggtccgaa tgatgttcgt attgcaattc ataccgtggg catttgtggc 120
agcgatgtgc attattatac ccatggtgcc attggtccgt ttgttgttcg cgaaccgatg 180
gttctgggcc atgaagcaag tggcaccatt accgaaattg gtagtaatgt gcgcagtctg 240
aaagttggcg atcgtgtttg catggaaccg ggcattccgg atccgcagag tcgcgcaacc 300
ctgatgggtc agtataatgt ggatccggcc gtgcgctttt gggcaacccc gcctattcat 360
ggttgcctga ccccgagtgt ggtgcatccg gcagcattca cttttaaact gccggataat 420
gttagttttg ccgaaggcgc catgattgaa ccgctggcag tgggtgtgca tgcaagcgtg 480
aaagcagcca ttaagccggg tgacatttgt ctggtgaccg gctgcggtcc gattggtatt 540
atgaccgccc tggcagccct ggccagtggc gcaggtcagg tgtttattac cgatctggcc 600
ccggcaaaac tggcaattgc aggtcagtat gatggtattc gcccgattaa tgttcgtgat 660
gaaaaaccgc gtgatgtggt tgatgcaacc tgtggcagcg actggggtgt ggatgttgtg 720
tttgaagcaa gcggttttgc cggcgcatac gatgatgccc tggcctgcgt gcgtccgggc 780
ggtaccattg tgtttgtggg tatgccgatt cagaaagtgc cgtttgatat tgtggccgcc 840
caggcaaaag aaattcgtat ggaaaccgtg tttcgctatg ccaatgttta tgatcgtgca 900
attcgcctga ttagtgcagg caaaattgat ctgaaaccgc tggtgagcga aacctttccg 960
tttgatcagg gtattgccgc atttgaacgt gccgcagaag cacgcccgag cgatgttaaa 1020
ctgcagattg ttctgtaa 1038
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaattcca tatggcccag gccctggtgc tggaaaag 38
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgctcgagc agaacaatct gcagtttaac atc 33
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