阅读说明：本技术 一种神经节苷脂单体的纯化制备方法 (Method for purifying and preparing ganglioside monomer ) 是由 梁鑫淼 张华林 叶贤龙 闫竞宇 郭志谋 金高娃 于 2019-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种神经节苷脂单体的纯化制备方法,以神经节苷脂分级产物为原料进行高效液相色谱技术纯化分离制备,该分级产物中含有GA(去唾液酸神经节苷脂)、GM(单唾液酸神经节苷脂)、GD(二唾液酸神经节苷脂)、GT(三唾液酸神经节苷脂)、GQ(四唾液酸神经节苷脂)等神经节苷脂(gangliosides)单体,本发明制备方法采用以硅胶为基质,以C4~C18脂肪烃链为键合相的反相填料,即反相模式,并通过缓冲盐、浓度、pH条件以及流动相进行洗脱,具有分离度好,周期短,操作简便可控,载样量高等优点。(The invention discloses a method for purifying and preparing ganglioside monomers, which is prepared by using a ganglioside classification product as a raw material and performing High Performance Liquid Chromatography (HPLC) purification and separation, wherein the classification product contains ganglioside (ganglioside) monomers such as GA (asialoglycoside), GM (monosialoganglioside), GD (disialoganglioside), GT (trisialoganglioside), GQ (tetrasialoganglioside) and the like.)

一种神经节苷脂单体的纯化制备方法

技术领域

本发明涉及生物提取领域，具体涉及一种神经节苷脂单体的纯化制备 方法。

背景技术

神经节苷脂(gangliosides，GLS)是一组含有唾液酸的鞘糖脂，分子由疏 水的神经酰胺和亲水的含唾液酸的寡糖链组成，广泛分布于脊椎动物各组 织的细胞膜上，其中以神经系统含量最为丰富。通常根据唾液酸数目不同 分为GA(去唾液酸神经节苷脂)、GM(单唾液酸神经节苷脂)、GD(二唾液 酸神经节苷脂)、GT(三唾液酸神经节苷脂)、GQ(四唾液酸神经节苷脂)等。

神经节苷脂的功能大致可归纳为以下几种：1.促进神经细胞及大脑组织 的正常发育，防治脑瘫等疾病；2.修复损伤神经及大脑组织,防治脑中风； 3.增强记忆功能；4.延缓神经细胞的衰老,防治帕金森、老年痴呆等疾病，其 作用备受医药领域关注。

目前，对神经节苷脂粗脂分离制备方法主要有：1、离子交换色谱法， 该方法主要依赖神经节苷脂中唾液酸的个数不同，导致所带电荷不同，填 料对其吸附不同的方式进行分离，但是流动相有盐离子的存在，后续脱盐 步骤复杂，导致样品损失严重；2、大孔吸附树脂分离法，有机化合物根据 吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达 到分离的目的，但该方法有机残留物高，预处理难度大，强度差，使用寿 命短，分离效果差等缺点，很难作为一种稳定且简便的分离制备方法。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种神经节苷脂单体的纯化制备方法，具 有分离度好，周期短，操作简便可控，载样量高等优点，适用于神经节苷 脂分级产物制备神经节苷脂单体。

为达到上述目的，本发明提供了一种神经节苷脂单体的纯化制备方法， 包括以下步骤：

溶样：将预处理好的神经节苷脂分级产物使用水和有机溶剂按 90/10～10/90比例的溶液溶解，得溶解液；

配置流动相：采用所述有机溶剂-缓冲盐水溶液作为流动相，其中所述 有机溶剂的体积浓度为5％～95％，所述缓冲盐水溶液浓度为1～1000mM， pH值为2.0～9.0；

上样洗脱：采用反相色谱柱，取所述溶解液进样，再用所述流动相洗 脱；

浓缩：收集洗脱后的样品进行浓缩处理，得分离后的神经节苷脂单体。

进一步地，所述预处理好的神经节苷脂分级产物含有GA、GM、GD、 GT、GQ中的一种或多种神经节苷脂单体。

进一步地，所述有机溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇、二 氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氢呋喃中的一种或多种。

进一步地，所述缓冲盐水溶液中的阳离子为Na⁺、K⁺、Li⁺、H⁺、Et₃NH⁺、 NH₄ ⁺中的一种或多种，阴离子为PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^3-、CH₃COO^-、HCOO^-、 Cl^-、ClO₄ ^-、HCO₃ ^-中的一种或多种。

进一步地，所述反相色谱柱中填料为硅胶或聚合物表面键合烷基固定 相，碳原子数为1～30正链烷基中的一种或多种，粒径为3～50μm，孔径为 比表面积为200～500m²/g，纯化制备载样量为固定相重量的0.1～5 g/g填料。

进一步地，所述色谱柱内径为2.1mm～100mm，色谱柱床高度为 100mm～1000mm。

进一步地，所述流动相流速为0.2mm/s～2mm/s，所述色谱柱柱温为 5℃～85℃，紫外检测波长为195nm～245nm。

进一步地，所述溶样步骤中可通过超声溶解，过0.45μm有机膜，得溶 解液。

进一步地，所述浓缩步骤中，收集洗脱后的样品可在40℃下进行旋蒸 蒸发浓缩处理，转速为70r/min。

本发明有益效果如下：本发明方法具有分离度好，周期短，操作简便 可控，载样量高等优点，适用于神经节苷脂分级产物制备神经节苷脂单体。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的 实现进行详细阐述。

本发明一种神经节苷脂单体的纯化制备方法流程包括以下步骤：

步骤101溶样：将预处理好的神经节苷脂分级产物使用水和有机溶剂 按90/10～10/90比例的溶液溶解，得溶解液；

这里，所述预处理好的神经节苷脂分级产物含有GA、GM、GD、GT、GQ中的一种或多种神经节苷脂单体；

这里优选地，所述有机溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇、 二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氢呋喃中的一种或多种；

这里所述溶样步骤中，可通过超声溶解，过0.45μm有机膜，得溶解液；

步骤102配置流动相：采用所述有机溶剂-缓冲盐水溶液作为流动相， 其中所述有机溶剂的体积浓度为5％～95％，所述缓冲盐水溶液浓度为 1～1000mM，pH值为2.0～9.0；

这里优选地，所述缓冲盐水溶液中的阳离子为Na⁺、K⁺、Li⁺、H⁺、Et₃NH⁺、 NH₄ ⁺中的一种或多种，阴离子为PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^3-、CH₃COO^-、HCOO^-、 Cl^-、ClO₄ ^-、HCO₃ ^-中的一种或多种；

这里优选地，所述有机溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇、 二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氢呋喃中的一种或多种；

这里优选地，所述流动相流速为0.2mm/s～2mm/s，所述色谱柱柱温为 5℃～85℃，紫外检测波长为195nm～245nm；

步骤103上样洗脱：采用反相色谱柱，取所述溶解液进样，再用所述 流动相洗脱；

这里优选地，所述反相色谱柱中填料为硅胶或聚合物表面键合烷基固 定相，碳原子数为1～30正链烷基中的一种或多种，粒径为3～50μm，孔径 为比表面积为200～500m²/g，纯化制备载样量为固定相重量的 0.1～5g/g填料；

这里更优选地，所述反相色谱柱中填料为硅胶表面极性基团键合固定 相；

这里优选地，所述色谱柱内径为2.1mm～100mm，色谱柱床高度为 100mm～1000mm；

步骤104浓缩：收集洗脱后的样品进行浓缩处理，得分离后的神经节 苷脂单体。

这里所述浓缩步骤中，收集洗脱后的样品可在40℃下进行旋蒸蒸发浓 缩处理，转速为70r/min。

实施例1

步骤1：取神经节苷脂分级产物于试管中，加入50％甲醇，配成50mg/ml 样品，超声溶解，过0.45μm有机膜，得澄清溶解液；

步骤2：使用C8反相色谱柱，柱规格4.6×250mm，粒径5μm，孔径 进样量为13mg，流速为0.7mL/min，柱温为35℃，检测波长为205 nm，流动相为乙腈、100mM磷酸二氢铵(pH＝6.50)，0～40min内乙腈的浓 度从45％～60％，梯度洗脱，按峰形收集；

步骤3：收集洗脱后的样品在40℃下进行旋蒸蒸发浓缩处理，转速为 70r/min，得分离后的神经节苷脂单体。

将分离后的神经节苷脂进行质谱鉴定，神经节苷脂单体的平均纯度可 以达到90.5％，回收率为85.6％，分离度较好，周期较短，操作便捷，载样 量较高，能达到0.43g/100g填料，重复性较好，易于实现工业化生产。

实施例2

步骤1：取神经节苷脂分级产物于试管中，加入50％甲醇，配成100 mg/ml样品，超声溶解，过0.45μm有机膜，得澄清溶解液；

步骤2：使用C8HC反相色谱柱，柱规格10×250mm，粒径10μm，孔 径进样量为54mg，流速为2mL/min，柱温为35℃，检测波长为 205nm，流动相为流动相为乙腈、50mM磷酸氢二铵(pH＝6.50)，0～40min 内乙腈的浓度从45％～60％，梯度洗脱，按峰形收集；

步骤3：收集洗脱后的样品在40℃下进行旋蒸蒸发浓缩处理，转速为 70r/min，得分离后的神经节苷脂单体。

将分离后的神经节苷脂进行质谱鉴定，神经节苷脂单体的平均纯度可 以达到91.3％，回收率为83.7％，分离度较好，周期较短，操作便捷，载样 量较高，能达到0.36g/100g填料，重复性较好，易于实现工业化生产。

实施例3

步骤1：取神经节苷脂分级产物于试管中，加入50％甲醇，配成50mg/ml 样品，超声溶解，过0.45μm有机膜，得澄清溶解液；

步骤2：使用C8M反相色谱柱，柱规格10×250mm，粒径10μm，孔 径进样量为73.5mg，流速为2mL/min，柱温为35℃，检测波长为 205nm，流动相为流动相为乙腈、50mM碳酸铵(pH＝6.50)，0～40min内 乙腈的浓度从45％～60％，梯度洗脱，按峰形收集；

步骤3：收集洗脱后的样品在40℃下进行旋蒸蒸发浓缩处理，转速为 70r/min，得分离后的神经节苷脂单体。

将分离后的神经节苷脂进行质谱鉴定，神经节苷脂单体的平均纯度可 以达到91.8％，回收率为84.2％，分离度较好，周期较短，操作便捷，载样 量较高，能达到0.49g/100g填料，重复性较好，易于实现工业化生产。

实施例4

步骤1：取神经节苷脂分级产物于试管中，加入50％甲醇，配成50mg/ml 样品，超声溶解，过0.45μm有机膜，得澄清溶解液；

步骤2：使用C18反相色谱柱，柱规格10×250mm，粒径30μm，孔径 进样量为46.5mg，流速为2mL/min，柱温为35℃，检测波长为205 nm，流动相为乙腈、50mM磷酸二氢铵(pH＝5.5)，0～40min内乙腈的浓度 从45％～60％，梯度洗脱，按峰形收集；

步骤3：收集洗脱后的样品在40℃下进行旋蒸蒸发浓缩处理，转速为 70r/min，得分离后的神经节苷脂单体。

将分离后的神经节苷脂进行质谱鉴定，神经节苷脂单体的平均纯度可 以达到90.6％，回收率为87.8％，分离度较好，周期较短，操作便捷，载样 量较高，能达到0.31g/100g填料，重复性较好，易于实现工业化生产。

实施例5

步骤1：取神经节苷脂分级产物于试管中，加入50％甲醇，配成80mg/ml 样品，超声溶解，过0.45μm有机膜，得澄清溶解液；

步骤2：使用C8I反相色谱柱，柱规格30×250mm，粒径15μm，孔径 进样量为450mg，流速为20mL/min，柱温为35℃，检测波长为 205nm，流动相为乙腈、50mM碳酸氢铵(pH＝6.50)，0～40min内乙腈的 浓度从45％～60％梯度洗脱，按峰形收集；

步骤3：收集洗脱后的样品在40℃下进行旋蒸蒸发浓缩处理，转速为 70r/min，得分离后的神经节苷脂单体。

将分离后的神经节苷脂进行质谱鉴定，神经节苷脂单体的平均纯度可 以达到90.8％，回收率为81.3％，分离度较好，周期较短，操作便捷，载样 量较高，能达到0.45g/100g填料，重复性较好，易于实现工业化生产。

实施例6

步骤1：取神经节苷脂分级产物于试管中，加入50％甲醇，配成60mg/ml 样品，超声溶解，过0.45μm有机膜，得澄清溶解液；

步骤2：使用C4反相色谱柱，柱规格10×250mm，粒径5μm，孔径 进样量为43.5mg，流动相为乙腈、50mM磷酸二氢钠(pH＝6.50)，0～40min 内乙腈的浓度从15％～85％，梯度洗脱，按峰形收集；

步骤3：收集洗脱后的样品在40℃下进行旋蒸蒸发浓缩处理，转速为 70r/min，得分离后的神经节苷脂单体。

将分离后的神经节苷脂进行质谱鉴定，神经节苷脂单体的平均纯度可 以达到92.7％，回收率为80.6％，分离度较好，周期较短，操作便捷，载样 量较高，能达到0.29g/100g填料，重复性较好，易于实现工业化生产。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范 围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利 权利要求范围内。