阅读说明：本技术 一种单萜苷类化合物及其在制备抗炎药物中的用途 (Monoterpene glycoside compound and application thereof in preparation of anti-inflammatory drugs ) 是由 郭大乐 邓赟 王丽娜 陈金凤 谭璐 旷歧轩 于 2020-08-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种单萜苷类化合物及其在制备抗炎药物中的用途,具体提供了式I所示化合物、或其盐、或其溶剂合物及其在制备抗炎药物中的用途。实验结果表明,本发明从地榆植物的干燥根部分离出了式I所示的化合物,并具体得到了化合物1～4,实验证明本发明化合物能显著降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌一氧化氮和炎症因子(包括IL-6和TNF-α),对巨噬细胞炎症反应有很好的保护作用,具有显著的体外抗炎活性。此外,本发明的化合物还能够有效抑制抑制炎症斑马鱼巨噬细胞的迁移,具有良好的体内抗炎活性。本发明的化合物在制备抗炎药物中具有良好的应用前景。<Image he="377" wi="700" file="DDA0002623811790000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a monoterpene glycoside compound and application thereof in preparing anti-inflammatory drugs, and particularly provides a compound shown in a formula I, or salt or solvate thereof and application thereof in preparing anti-inflammatory drugs. Experimental results show that the compound shown in the formula I is separated from the dry roots of the garden burnet plants, and specifically the compounds 1-4 are obtained, and experiments prove that the compound can remarkably reduce the secretion of nitric oxide and inflammatory factors (including IL-6 and TNF-alpha) by RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide, has a good protection effect on macrophage inflammatory reaction, and has remarkable in-vitro anti-inflammatory activity. In addition, the compound can also effectively inhibit the migration of inflammatory zebra fish macrophages, and has good in-vivo anti-inflammatory activity. The compound of the invention is used in preparing anti-inflammatory drugsHas good application prospect.)

一种单萜苷类化合物及其在制备抗炎药物中的用途

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及一种单萜苷类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。

背景技术

地榆为广泛分布与亚洲、欧洲、北非和北美洲的蔷薇科植物。其干燥根茎为常用中药材，因其具有收敛、阵痛的功效，进而用于治疗烧伤、创伤、炎症和出血等症状已经具有上千年的历史。已经有研究表明三萜皂苷元类、三萜皂苷类、木酯素类、木酯素苷类、多糖类、水溶性丹宁类及单萜苷类成分为其部分药效物质基础。

有文献报道地榆的水、醇提取物具有较好的抗炎作用。腹腔注射低榆水提物400mg/kg或醇提取物650mg/kg，能够有效抑制大鼠甲醛足跖肿胀，且起效较快；腹腔注射水提取物750mg/kg或醇提取物800mg/kg对大鼠棉球肉芽肿具有显著抑制作用，抑制率70％以上。

但是，本领域公知的，地榆的水、醇提取物中的化学成分非常复杂，而地榆发挥抗炎作用的药效物质至今仍然不够明确。因此，研究地榆提取物中的化学成分，寻找能够有效发挥抗炎作用的具体化合物，对制备抗炎药物具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单萜苷类化合物及其在制备抗炎药物中的用途。

本发明提供了一种式I所示化合物、或其盐、或其溶剂合物：

其中，R₁选自H、被0～6个R₄取代的饱和或不饱和环烷基、被0～6个R₄取代的饱和或不饱和杂环基、

卤素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基；R₅选自被0～6个R₄取代的芳基、被0～6个R₄取代的杂芳基；

R₂、R₃各自独立地选自被0～4个R₄取代的以下基团：C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基；

R₄选自羟基、卤素、C1-5烷基、羧基；M为1～5个亚甲基。

进一步地，所述化合物的结构如式II所示：

其中，R₁选自H、被0～3个R₄取代的5～6元饱和杂环基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基；R₅选自被0～3个R₄取代的芳基、被0～6个R₄取代的杂芳基；

R₂选自被0～3个R₄取代的以下基团：C2-4烷基、C2-4烯基；

R₄选自羟基、C1-3烷基；M为1～3个亚甲基。

进一步地，所述化合物的结构如式III所示：

其中，R₁选自被0～3个R₄取代的5～6元饱和杂环基、C1-4烷基；R₅选自被0～3个R₄取代的苯环、被0～3个R₄取代的杂芳基；优选地，所述5～6元饱和杂环基中的杂原子为1个氧原子；

R₄选自羟基、C1-3烷基；M为1～3个亚甲基。

进一步地，所述化合物的结构如下所示：

本发明还提供了上述化合物、或其盐、或其溶剂合物在制备抗炎药物中的用途。

进一步地，所述药物能够抑制巨噬细胞一氧化氮的生成。

进一步地，所述药物能够抑制巨噬细胞炎症因子的表达。

进一步地，所述炎症因子为IL-6和/或TNF-α。

进一步地，所述药物能够抑制巨噬细胞的迁移。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物是以上述化合物、或其盐、或其溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得。

前缀Cx-y表示任何含“x”至“y”个碳原子的基团。因此，例如，C1-8烷基是指包含任何含1～8个碳原子的直链或支链的烷基。

“取代”是指分子中的1个、2个或多个氢原子被其它不同的原子或分子所替换，包括该分子中同位原子或异位原子上的1个、2个或多个取代。

“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

本发明中，“盐”是将化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和/或碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

本发明中，“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环基团或稠合多环基团，例如苯基和萘基。所述芳基可以稠合于其它环状结构(包括饱和、不饱和环)，但不能含有杂原子如氮、氧或硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。

“杂芳基”指包含一个到多个杂原子的具有共轭的π电子体系的单环基团或稠合多环基团。含有至少一个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。所述杂芳基可以稠合于芳环、杂环或烷烃环上。

实验结果表明，本发明化合物能显著降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌一氧化氮和炎症因子(包括IL-6和TNF-α)，对巨噬细胞炎症反应有很好的保护作用，具有显著的体外抗炎活性。此外，本发明的化合物还能够有效抑制抑制炎症斑马鱼巨噬细胞的迁移，具有良好的体内抗炎活性。本发明的化合物在制备抗炎药物中具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.化合物1、2的¹H-¹H COSY，HMBC和NOESY谱图中的重要相关信号。

图2.化合物1的高分辨质谱图。

图3.化合物1的核磁共振氢谱图(400MHz,CD₃OD)。

图4.化合物1的核磁共振碳谱图(100MHz,CD₃OD)。

图5.化合物1的¹H-¹H COSY谱图。

图6.化合物1的HSQC谱图。

图7.化合物1的HMBC谱图。

图8.化合物1的NOESY谱图。

图9.化合物2的高分辨质谱图。

图10.化合物2的核磁共振氢谱图(400MHz,CD₃OD)。

图11.化合物2的核磁共振碳谱图(100MHz,CD₃OD)。

图12.化合物2的¹H-¹H COSY谱图。

图13.化合物2的HSQC谱图。

图14.化合物2的HMBC谱图。

图15.化合物2的NOESY谱图。

图16.化合物3的核磁共振氢谱图(400MHz,CD₃OD)。

图17.化合物3的核磁共振碳谱图(100MHz,CD₃OD)。

图18.化合物4的核磁共振氢谱图(400MHz,CD₃OD)。

图19.化合物4的核磁共振碳谱图(100MHz,CD₃OD)。

图20.单糖对照品与化合物1、2水解后的色谱流出曲线图。

图21.单糖对照品与化合物1、2水解衍生后的色谱流出曲线图。

图22.化合物1～4对RAW264.7巨噬细胞活性的影响。

图23.化合物1～4对脂多糖诱导的巨噬细胞的NO表达水平的影响；图中每个值代表三个独立实验的平均值±SEM，与空白组相比###P＜0.001，与模型组相比***P＜0.001。

图24.化合物1～4对脂多糖诱导的巨噬细胞IL-6和TNF-α表达水平的影响；图中每个值代表三个独立实验的平均值±SEM，与空白组相比###P＜0.001，与模型组相比*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

图25.(A)荧光显微镜观察到的化合物1对经硫酸铜诱导的炎症斑马鱼神经丘周边的巨噬细胞的迁移行为的影响；(B)斑马鱼神经丘周围的巨噬细胞的数量，每个值代表三个独立实验的平均值±SEM，与模型组相比***P＜0.001。

图26.化合物1～4对斑马鱼神经丘周围巨噬细胞的分布情况的影响作用。

图27.图26的定量结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

地榆药材经鉴定为Sanguisorba officinalis。样本现存于药学院中药材标准化***重点实验室。

实施例1本发明化合物1～4的制备

取干燥粉碎后的地榆药材(9.97kg)，经70％乙醇在30℃下渗漏提取(每次10升，共三次，每次提取60min)，保留提取液回收溶剂，得粗浸膏(3.31kg)。将粗浸膏用水分散后，以乙酸乙酯、正丁醇进行依次萃取。取正丁醇部位(1.47kg)上大孔树脂D101柱色谱(10×120cm)，以乙醇/水混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱(v/v：0％，30％，50％，70％，95％；每个梯度4L)。取其中30％乙醇/水洗脱部位(0.74kg)上HP-20柱色谱(6×50cm)，以经乙醇/水混合溶液为洗脱剂进行梯度洗脱(v/v：0％，10％，20％，30％，40％，50％，100％；每个梯度900mL)得到7个流份，将10％-30％流分合并上Toyopearl HW-40柱色谱(4×40cm)，以乙醇/水混合溶液为洗脱剂(6：4,v/v)洗脱10倍柱体积得到三个组分，将3-6倍柱体积组分(9.4g)上葡聚糖凝胶Sephadex LH-20CC(150cm L×2cm D)，以甲醇/水混合溶液为洗脱剂(1：1，v/v)洗脱2倍柱体积得到三个组分，将0.5至1.5倍柱体积组分(1.87g)分成4份。第1份上制备液相色谱柱纯化，得到化合物1(25mg,甲醇/水：38/62，v/v；4ml/min；t_R:42min)；第2份上制备液相色谱柱纯化，得到化合物2(16.9mg；甲醇/水:70/30,v/v；4ml/min；t_R:54min)；第3份上制备液相色谱柱纯化，得到化合物3(52.8mg；甲醇/水:40:60,v/v；4ml/min；t_R:18min)；第4份上制备液相色谱柱纯化，得到化合物4(16.9mg；甲醇/水:30:70,v/v；4ml/min；tR:68min)。

8-羟基香叶醇基-1-氧-(6-氧-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷(化合物1)：黄色粉末,

-30.6(c 0.01,甲醇)；IR(KBr)ν_max 3421.6,2923.9,1683.8,1605.8,1447.3,1050.6cm-1；UVλ_max 208.3(3.82),228.4(3.80),300.8(3.37)nm；¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.09(2H,s,H-3”,7”),5.34(1H,t,J＝6.5Hz,H-2),5.23(1H,t J＝7.0Hz,H-6),4.55(1H,ddJ＝11.8,2.0Hz,H-6’a),4.40(1H,dd,J＝11.8,6.1Hz,H-6’b),4.31(1H,d J＝7.8Hz,H-1’),4.18-4.28(1H,m,H-1),4.05(2H,s，H-9),3.49-3.56(1H,m,H-5’)，3.35-3.45(1H,m,H-4’),3.34-3.42(1H,m,H-3’),3.19-3.25(1H,m,H-2’),2.16(2H,dd J＝14.9,7.4Hz,H-5),2.03(2H,t J＝7.5Hz,H-4),1.75(3H,s,H-8),1.60(3H,s,H-10)；¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD)δ:168.4(C-1”),146.5(C-4”,6”),142.0(C-3),139.9(C-5”),136.2(C-7),128.5(C-6),121.5(C-2),121.4(C-2”),110.2(C-3”,7”),102.6(C-1’),78.4(C-3’),75.5(C-5’),75.0(C-2’),71.9(C-4’),66.2(C-1),65.1(C-6’),61.4(C-9),40.7(C-4),26.8(C-5),21.7(C-8),16.4(C-10)；HRESIMS:m/z 507.1849[M+Na]⁺(计算值：C₂₃H₃₂O₁₁Na⁺,507.1837).

9-羟基香叶醇基-1-氧-ɑ-L-***糖-(1→6)-β-D-葡萄糖(化合物2)：淡黄色粉末,

-95.1(c 0.01,MeOH)；IR(KBr)ν_max 3327.8,2881.5,2327.3,1436.1,1039.5cm^-1；UVλ_max 208.3(3.64)nm；¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ:5.46(1H,m,H-2),5.34(1H,t,J＝7.0Hz,H-6),5.04(1H,d,J＝1.1Hz,H-1”),4.35(1H,d,J＝7.3Hz,H-1’),4.25-4.41(1H,m,H-1),4.14(2H,s,H-9),4.02-4.08(1H,m,H-2”),3.99-4.07(1H,m,H-4”),4.04(1H,dd,J＝11.1,2.3Hz,H-6’a),3.89(1H,dd,J＝5.9,3.2Hz,H-3”),3.81(1H,dd,J＝11.9,3.7Hz,H-5”a),3.67(1H,dd,J＝11.1,6.0Hz,H-6’b),3.67(1H,dd,J＝11.9,5.3Hz,H-5”b),3.43-3.50(1H,m,H-5’),3.34-3.42(1H,m,H-3’),3.30-3.40(1H,d,J＝8.9Hz,H-4’),3.24(1H,dd,J＝8.8,8.0Hz,H-2’),2.25(2H,dd,J＝14.7,7.9Hz,H-5),2.13(2H,dd,J＝14.4,7.9Hz,H-4),1.75(3H,s,H-8),1.60(3H,s,H-10)；¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD)δ:141.9(C-3),136.0(C-7),128.1(C-6),121.8(C-2),110.1(C-1”),102.3(C-1’),85.9(C-4”),83.3(C-2”),78.7(C-3”),78.0(C-3’),76.7(C-5’),75.0(C-2’),72.0(C-4’),68.3(C-6’),66.4(C-1),63.0(C-5”),61.3(C-9),40.8(C-4),26.7(C-5),21.5(C-8),16.4(C-10)；HRESIMS:m/z 487.2167[M+Na]⁺(计算值:C₁₅H₂₄O₂Na,487.2150).

8-羟基香叶醇基-β-D-葡萄糖苷(化合物3)：淡黄色粉末，ESI-MS m/z:355[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:5.45(1H,t,J＝6.9Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝6.9Hz,H-3),4.37(1H,d,H-1′),4.13(2H,s,H-1),2.27(2H,dd,J＝14.7,7.3Hz,H-5),2.13(2H,dd,J＝16.1,8.8Hz,H-4),1.81(3H,s,H-9),1.75(3H,s,H-9).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ:16.5(C-9),21.5(C-10),26.8(C-4),40.8(C-5),61.4(C-1),62.8(C-6'),66.3(C-8),71.7(C-4'),75.0(C-2'),78.0(C-5'),78.1(C-3'),102.7(C-1'),121.8(C-7),128.1(C-3),136.1(C-2),141.5(C-6)。

香叶醇基-6-氧-a-L-呋喃***糖-β-D-葡萄糖苷(化合物4)：淡黄色粉末，ESI-MS m/z:467[M-H]-；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:5.45(1H,t,J＝6.58Hz,H-2),5.05(1H,s,H-1”),4.39(1H,m,H-1),4.37(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),4.31(1H,dd,J＝11.8,7.6Hz,H-1),4.12(1H,m,H-6”),4.08(1H,m,H-2”),4.05(1H,m,H-4”),3.91(1H,m,H-3”),3.82(1H,dd,J＝11.9,3.3Hz,H-5”),3.75-3.71(1H,m,H-5”),3.65(1H,m,H-6'),3.50(1H,m,H-5'),3.38(1H,t,H-3'),3.36(1H,t,H-4'),3.26(1H,t,H-2'),2.12(2H,t,J＝7.0Hz,H-4),1.77(3H,s,H-10),1.57(2H,m,H-5),1.48(2H,m,H-6),1.25(6H,s,H-8,9).13CNMR(100MHz,CD3OD)δ:16.4(C-10),23.3(C-5),29.2(C-8,9),41.0(C-4),44.2(C-6),63.0(C-5”),66.3(C-1),68.0(C-6'),71.3(C-7),71.9(C-4'),74.9(C-2'),76.6(C-5'),77.9(C-3'),78.8(C-3”),83.1(C-2”),85.8(C-4”),102.6(C-1'),109.8(C-1”),121.4(C-2),142.2(C-3)。

以下通过实验例证明本发明化合物的有益效果。

实验例1：结构表征

(1)波谱学分析

分别对化合物1和2进行结构表征，得到核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图如图16-19所示。分别对化合物1和2进行结构表征，得到高分辨质谱图、核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图、¹H-¹H COSY谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、NOESY谱图，如图2-15所示。

化合物1为黄色粉末状固体，高分辨质谱中显示有m/z:507.1849[M+Na]⁺的准分子离子峰，推测其分子式为C₂₃H₃₂O₁₁(C₂₃H₃₂O₁₁Na⁺计算值为507.1837)，核磁共振氢谱显示δ7.09(2H,s,H-3”和H-7”)为一个典型的没食子酰基信号；δ5.24(1H,t,J＝6.5Hz,H-2)和δ5.23(1H,t,J＝7.0Hz,H-6)为两个烯烃质子信号；1.75(3H,s,H-8)和1.60(3H,s,H-10)为两个甲基信号。对化合物1的核磁共振碳谱和HSQC分析表明，该化合物具有21个碳原子，包括δ168.4(C-1”)处的一个酯羰基；δ146.5(C-4”和6”),142.0(C-3),139.9(C-5”),121.5(C-2),121.4(C-2”),及110.2(C-3”和C-7”)处的8个烯烃碳信号；δ78.4(C-3'),75.5(C-2'),75.0(C-4')和71.9(C-1')处的四个连氧次甲基信号及δ66.2(C-1),65.1(C-6')和61.4(C-9)处的三个连氧亚甲基信号；δ41.7(C-4)和26.8(C-5)处的两个亚甲基信号及δ21.7(C-8)和16.4(C-10)处的甲基信号。¹H-¹H COSY的相关信号H-1'/H-2',H-3'/H-4'和H-4'/H-5'；HMBC相关信号H-10/C-2,C-3,C-4和H-9/C-6,C-7,C-8及NOESY谱中的相关信号H-1/H-10和H-6/H-9表明该化合物有一个8-羟基香叶醇基片段^[15]，¹H-¹H COSY信号H-1'/H-2'/H-3'/H-4'/H-5'/H-6'；HMBC信号H-1'/C-3',C-5'和H-6'/C-4'及δ_H 4.31处的端基碳氢的耦合常数(7.8Hz)表明糖基为β构型的葡萄糖。酸水解及衍生化最终确定该糖单元为β-D-葡萄糖。H-5”/C-1”,C-2”,C-3”,C-4”,6”进一步确证了没食子酰基的存在。HMBC信号H-1/C-1'和H-6'/C-1”最终将三个片段的链接方式确定下来(图1)。化合物1的结构相应的被鉴定为8-羟基香叶醇基-1-氧-(6-氧-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷。

化合物2为白色粉末状样品，由高分辨质谱准分子离子峰m/z:487.2167，推测该化合物的分子式为C₂₁H₃₆O₁₁(计算值C₂₁H₃₆O₁₁Na,487.2150)。对化合物2的氢谱何碳谱进行分析，可推测出该化合物同样具有一个8-羟基香叶醇基片段。相对于化合物1，化合物2具有两个糖片段。端基碳的耦合常数表明这两个糖分别为β-葡萄糖和ɑ-***糖。酸水解和衍生化分析进一步确认了两个糖为β-D-葡萄糖和ɑ-L-***糖。H-1(δ4.25-4.41)与C-1'(δ102.3)和H-1”(δ5.04)与C-6'(δ68.3)的HMBC相关信号最终确定化合物的结构为8-羟基香叶醇基-1-氧-ɑ-L-***糖-(1→6)-β-D-葡萄糖。

(2)酸水解及衍生化分析

化合物1(1.12mg)和化合物2(1.35mg)与2M浓度的三氟乙酸在105摄氏度下共加热6个小时。冷却后用水分散并用二氯甲烷萃取三次，水层减压干燥后进行HPLC初步分析，通过氨基柱(85％CH₃CN/H₂O,流速＝1mL/min)进行分离并在ELSD检测器下进行检识，并以保留时间为指标以单糖标准品D-葡萄糖(t_R＝11.39min)和L-***糖(t_R＝7.89min)进行比对(图20)，初步确认糖的类别；同时水部分与500mg盐酸半胱氨酸甲酯溶于5毫升吡啶之中并加热至60摄氏度反应1小时，之后再加入0.5mL异硫氰酸苯酯继续在60摄氏度下反应1小时,减压除去溶剂，残留物进一步进行HPLC分析，经C-18色谱柱进行分离(25％CH₃CN/H₂O,流速＝0.8mL/min)，并在250nm下进行见识，通过与标准糖的衍生物的保留时间进行比对(图21)，最终确定了糖的绝对构型为D-葡萄糖(t_R＝14.03min)和L-***糖(t_R＝16.38min)。

通过上述结构分析，确定本发明实施例制得的化合物1～4的结构如下：

实验例2：本发明化合物对RAW264.7细胞增殖活性的影响

1、实验方法

小鼠巨噬细胞株RAW264.7，在含有抗生素(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)和10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中，于37℃，5％CO₂的孵箱条件中培养。

取生长状态良好的对数期RAW264.7细胞，以1×10⁵个/mL的密度将巨噬细胞悬浊液接种于96孔细胞培养板上，每个孔加入100μL细胞悬浊液，放入孵箱培养24h。小心吸去上清，加入含不同浓度的化合物(0、3.75、7.5、15、30、60、120μg/mL)的DMEM溶液，每个样品3个重复孔。放入孵箱继续培养24h后，每孔加入20μL MTT溶液，操作过程避光。放入孵箱继续孵育4h，小心吸去上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，避光轻微震荡，待培养板内结晶完全溶解后，酶标仪于570nm处测定OD值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率大于90％表明此浓度的药物对细胞增值无明显抑制作用。

2、实验结果

结果如图22所示，与空白组比较，化合物1～4在给药浓度为0-60μg/mL时对细胞增殖无明显抑制作用。因此在后续实验中选取化合物对细胞增殖无明显抑制的低、中、高浓度(15、30、60μg/mL)开展研究。

实验例3：本发明化合物对RAW264.7细胞炎症反应的影响

1、实验方法

(1)Griess法检测RAW264.7细胞NO释放量

选取生长状态良好的对数期raw264.7细胞，以1×10⁵个/mL的密度将细胞悬浊液接种于24孔细胞培养板上，每孔加入1mL细胞悬液，孵箱培养24h，小心吸去上清。空白组加入DMEM溶液1mL；模型组加入含LPS(脂多糖，100ng/mL)的DMEM溶液1mL；LPS+化合物组加入含LPS(100ng/mL)以及不同浓度(15、30、60μg/mL)化合物的DMEM溶液1mL；放入细胞孵箱继续培养24h。按照NO检测试剂盒操作，每个样品重复3个孔，使用酶标仪于540nm处测定OD值并计算NO含量。

(2)ELISA法检测RAW264.7细胞IL-6、TNF-α释放量

取对数期巨噬细胞RAW264.7，并调整浓度后，以1×10⁵个/mL的密度将细胞悬浊液接种于24孔细胞培养板上，每孔加入1mL细胞悬液，孵箱培养24h，小心吸去上清。空白组加入DMEM溶液1mL；模型组加入含LPS(100ng/mL)的DMEM溶液1mL；LPS+化合物组加入含LPS(100ng/mL)以及不同浓度(15、30、60μg/mL)化合物的DMEM溶液1mL；放入细胞孵箱继续培养24h。按照ELISA试剂盒说明书进行实验操作后，于450nm处测定各OD值，根据OD值，计算IL-6、TNF-α因子释放水平。

2、实验结果

化合物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞NO释放量的影响结果如图23所示。可以看出，经脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的生成水平较空白组显著增高(P＜0.001)，说明脂多糖诱导的炎症模型造模成功。与模型组相比，本发明化合物1～4和脂多糖与RAW264.7细胞共孵育后，细胞一氧化氮的生成水平显著降低(P＜0.001)，且在化合物浓度15-60μg/mL区段成剂量依赖性，当化合物浓度为60μg/mL时，细胞NO释放量最低。此外，对比化合物1～4发现，化合物1和2抑制RAW264.7细胞一氧化氮生成的作用比化合物3和4更好，化合物1在浓度为60μg/mL时抑制NO生成的效果与化合物3和4相比有显著性差异(p＜0.05)，化合物2在浓度为30μg/mL、15μg/mL时抑制NO生成的效果与化合物3和4相比有显著性差异(p＜0.05)。

化合物对RAW264.7细胞炎症因子IL-6、TNF-α表达的影响结果如图24所示。可以看出，与空白组相比，脂多糖能显著增加AW264.7巨噬细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达(P＜0.001)，再次说明脂多糖诱导的炎症模型造模成功。与模型组相比，本发明化合物1～4和脂多糖与RAW264.7细胞共孵育后，炎症因子IL-6的表达均显著降低(P＜0.001)，且15-60μg/mL浓度区段成剂量依赖性，当化合物浓度为60μg/mL时，IL-6的表达水平最低。与模型组相比，本发明化合物(特别是化合物1～3)和脂多糖与RAW264.7细胞共孵育后，炎症因子TNF-α的表达也明显降低，当化合物浓度为60μg/mL时，TNF-α的表达水平最低。对比化合物1～4发现，化合物1抑制RAW264.7细胞炎症因子IL-6和TNF-α表达的作用最好。化合物1抑制IL-6生成的效果与化合物3和4相比有显著性差异(p＜0.05)，化合物2抑制IL-6生成的效果与化合物3和4相比有显著性差异(p＜0.05)。化合物1抑制TNF-α生成的效果与化合物2和4相比有显著性差异(p＜0.05)，化合物2抑制TNF-α生成的效果与化合物3相比有显著性差异(p＜0.05)。

实验结果表明，本发明化合物(特别是化合物1和2)能显著降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞NO释放量，同时能显著降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞对IL-6和TNF-α的表达水平，对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应有良好的保护作用。

实验例4：本发明化合物对斑马鱼炎症模型的体内抗炎活性评价

1、实验方法

转基因TG斑马鱼(mpx:GFP)在斑马鱼实验平台中进行孵育(水温28.5摄氏度，pH7.2-7.5,传导率500-550μs/cm),光照14小时/10小时循环，将4-8个月的健康斑马鱼进行配对饲育产生鱼卵和幼苗。斑马鱼实验的开展遵循《美国国立卫生研究院实验动物使用和护理指南》并在成都中医药大学实验动物伦理委员会的批准下进行的。

在体式显微镜下挑选正常的3dpf(days after fertilization)转基因斑马鱼Tg(mpx：GFP)幼鱼，随机移入24孔板中，每孔15尾，加入不同浓度(7.5、15、30、60μg/mL)的化合物1溶液。将上述斑马鱼幼鱼放入28℃恒温培养箱中孵育1h后，再用10μM/L硫酸铜避光处理50min造成急性炎症。然后在荧光显微镜下观察不同浓度化合物共培养下荧光标记的巨噬细胞的迁移与定位，计数神经丘周围巨噬细胞的数量，统计化合物对炎症反应的影响。

另设不加化合物1的空白对照组(0.1％DMSO)和模型组(用10μM/L硫酸铜溶液处理50min造模)作为对照。

2、实验结果

转基因斑马鱼Tg(mpx：GFP)幼鱼的巨噬细胞带有绿色荧光标记。本发明利用CuSO4损伤神经丘(斑马鱼体表侧线器的末梢器官)，造成斑马鱼巨噬细胞迁移至神经丘周围，建立CuSO4诱发的斑马鱼炎症模型。结果如图25～27所示。

从图25可以看出，与空白对照组相比，模型组斑马神经丘周围巨噬细胞的数量显著提高，证明本发明CuSO4诱发的斑马鱼炎症模型造模成功。

与模型组相比，与化合物1(浓度为15～60μg/ml)共培养后的炎症斑马鱼神经丘周围巨噬细胞的数量显著降低(P＜0.001)；而且当化合物1的浓度为60μg/ml时，炎症斑马鱼神经丘周围的巨噬细胞的数目与空白对照组无显著性差别。

实验结果表明本发明的化合物1能够有效抑制抑制炎症斑马鱼巨噬细胞的迁移，具有良好的体内抗炎活性。

综上，本发明从地榆植物的干燥根部分离出了式I所示的化合物，并具体得到了化合物1～4，实验证明本发明化合物能显著降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌一氧化氮和炎症因子(包括IL-6和TNF-α)，对巨噬细胞炎症反应有很好的保护作用，具有显著的体外抗炎活性。此外，本发明的化合物还能够有效抑制抑制炎症斑马鱼巨噬细胞的迁移，具有良好的体内抗炎活性。本发明的化合物在制备抗炎药物中具有良好的应用前景。