阅读说明：本技术 四种血液来源蛋白的纯化方法 (Purification method of four blood-derived proteins ) 是由 易维京 朱攀 任燕斌 赵威 赵忠颢 于 2020-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了四种血液来源蛋白的制备方法,采用阴/阳离子交换层析和亲和层析相配合的纯化方法,从同一份血液样本中,同时纯化出α1-抗胰蛋白酶(AAT)、转铁蛋白(TRF)、α1-酸性糖蛋白(AAG)和结合珠蛋白(HP)四种蛋白,本发明公开的制备方法操作简单,所得到的目的蛋白活性稳定、纯度高、收率高,适合用于工业生产和临床应用。(The invention discloses a preparation method of four blood source proteins, which adopts a purification method combining anion/cation exchange chromatography and affinity chromatography to simultaneously purify four proteins of alpha 1-antitrypsin (AAT), Transferrin (TRF), alpha 1-acid glycoprotein (AAG) and Haptoglobin (HP) from the same blood sample.)

四种血液来源蛋白的纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白的分离纯化，具体涉及四种血液来源蛋白的纯化方法。

背景技术

在生物医药快速发展的时代，血液制品行业已成为生物医药及诊断产业的重要组成部分。目前血浆来源的血液制品(血浆蛋白药物)主要有白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、蛋白酶抑制剂四大类，发达国家的血液制品企业可以从血浆中获取超过20种的血浆蛋白药物。然而，受人才、技术、临床认知水平等因素制约，国内的血液制品企业最多只能获得不超过10种，且主要是基于低温乙醇沉淀工艺分离提纯的产品，包括人血白蛋白、免疫球蛋白和凝血因子VIII产品等。目前国内主要提纯血浆蛋白药物仍基于Cohn等人二十世纪四十年代发明的低温乙醇法，通过调节乙醇浓度、盐浓度、温度和pH，依靠血浆蛋白的溶解度不同来分离，此方法虽然程序简单、溶剂价廉，适用于工业化生产，但有较大的局限性，主要可分离血浆中含量较高的蛋白(如白蛋白和免疫球蛋白)，对含量较少的蛋白(如α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白等)则很难提纯。

α1-抗胰蛋白酶(AAT)制剂可以用来治疗先天或后天性AAT缺乏所致肺气肿、急性肺损伤、囊性纤维化、成人呼吸紧迫综合症等疾病，在临床上具有较高的应用价值。

转铁蛋白(TRF)已有的许多研究证实转铁蛋白具有抗菌的功能，同时也是细胞生长和增殖所必须的生长因子。但是制备转铁蛋白的常规纯化方法(例如冷乙醇沉淀法，硫酸铵沉淀法，利凡诺沉淀法等)由于生产效率低、生产过程繁琐以及产品纯度不够高等原因已经不能满足现阶段对于转铁蛋白的需求。

结合珠蛋白(HP)结合珠蛋白是一种急性期时相反应蛋白。可以用来治疗溶血症疾病，给与HP之后，可以防止Hb尿的发生。此外HP可能在治疗Hb铁的细菌引起的危机生命的感染方面也具有一定价值。随着现代医疗的进步，HP的需求量日益增大。

α1-酸性糖蛋白(AAG)是主要的急性时相反应蛋白，在急性炎症时含量增高，与免疫防御功能有关。随着各种试剂盒的研发，AAG蛋白无论是作为研究的目的蛋白还是验证的标准品，其需求都在逐年增大，所以AAG蛋白的提纯和制备至关重要。

随着现代医疗的进步，ATT、TRF、HP、AAG的需求日益增大，但由于其性质各异，在血清中单个纯化，会存在纯度低，收率低，不利于放大等问题。现有技术很难做到多种蛋白同时纯化，因为用有机溶剂或高盐处理后的蛋白，往往活性偏低，严重影响后续使用。因此，需要寻找一种同时制备ATT、TRF、HP、AAG的方法。

发明内容

为了解决上述难以纯化多种蛋白的问题，本发明提供四种血液来源蛋白的纯化方法，利用同样的样本同时纯化四种蛋白，降低成本，获得四种高纯度、高收率的蛋白。

本发明纯化的四种蛋白为ATT、TRF、HP、AAG，配合离子交换层析和亲和层析，达到分离纯化四种蛋白的目的。

本发明方法操作简单，成本低，产物纯度高，稳定性强，且处理量大，适合大规模生产。

具体包括如下步骤：

a、将血清透析到pH为4.2到4.8的层析缓冲液中，得透析样品，用阴离子交换层析对所述样品进行纯化，收集流穿液I和洗脱液I；

b、洗脱液I经亲和层析纯化得流穿液II及HP蛋白；

c、流穿液II透析到pH为3.0-3.8的层析缓冲液中，得透析流穿液II，用阴离子交换层析对所述透析流穿液II进行纯化，收集AAG蛋白；

d、调流穿液I的pH至5.0-5.8，用阳离子交换层析进行纯化，收集流穿液III与洗脱液 II；

e、将流穿液III用亲和层析进行纯化得AAT蛋白；

f、将洗脱液II透析到pH为5.3-5.8的层析缓冲液中，得透析洗脱液II，用阴离子交换层析对所述透析洗脱液II进行纯化，得TRF蛋白。

优选地，所述阴/阳离子交换层析和亲和层析，均包含平衡、上样、流穿和洗脱四个过程。

优选地，所述层析缓冲液为酸性缓冲液，可选醋酸缓冲液，磷酸缓冲液，盐酸缓冲液，碳酸缓冲液；更优选为醋酸缓冲液。

优选地，所述平衡的过程中，所述阴/阳离子交换层析所用试剂为层析缓冲液，所述亲和层析所用试剂为平衡缓冲液。

更优选地，所述平衡缓冲液选自PBS、PB或Tris缓冲液。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤a、c、d、f中需用到洗脱试剂A，所述洗脱试剂A包括：醋酸钠缓冲液和NaCl。

优选地，所述阴/阳离子交换层析过程中，所述洗脱过程，采用0-100％洗脱试剂A梯度洗脱。

本发明所述“0-100％洗脱试剂A”为：开始洗脱时为填料中的试剂为完全的层析缓冲液，即洗脱试剂A为0％，不断加入洗脱试剂A梯度，逐渐置换掉填料中的层析缓冲液，最终填料中的溶液全部为洗脱试剂A，即洗脱试剂A为100％.

优选地，所述洗脱的过程中，步骤b中所用试剂为甘氨酸缓冲液。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤e中所用试剂包括Tris和MgCl₂。

优选地，所述阴离子交换层析的填料为强阴离子交换层析填料(Q)或弱阴离子交换层析填料(DEAE)；所述强阴离子交换层析填料可选UniGel-30Q、UniGel-50Q、NanoGel-50Q，所述弱阴离子交换层析填料可选UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-SepharoseF.F、DEAE-SepharoseCL-6B。

优选地，所述阳离子交换层析的填料为强阳离子交换填料(SP)或弱阳离子交换填料 (CM)；所述强阳离子交换层析填料的填料可选UniGel-30SP、UniGel-80SP、Sepharose-SP、 NanoGel-50SP，所述弱阳离子交换填料可选UniGel-30CM、UniGel-80CM、UniCore-CM、CM-SepharoseF.F。

优选地，上述步骤a中所述层析缓冲液为10-50mM醋酸钠缓冲液，pH4.5-4.8，所述洗脱试剂A包括：10-50mM醋酸钠缓冲液和0.5-1M的NaCl，pH4.5-4.8；洗脱液I从电导8ms/cm起开始收集。

上述步骤c中所述层析缓冲液为10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝3.0-3.8，所述洗脱试剂A 包括：10-50mM醋酸钠缓冲液和0.5-1M的NaCl，pH＝3.0-3.8；AAG目的峰在电导9ms/cm时开始收集，整个洗脱过程只产生1个蛋白峰。

上述步骤d中，所述层析缓冲液为10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝5.0-5.8，所述洗脱试剂 A包括：10-50mM醋酸钠缓冲液和0.5-1M的NaCl，pH＝5.0-5.8。

优选地，本发明所用离子交换层析：层析柱为XK26(GE)，填料体积50ml，装柱高度10cm；洗脱方式为梯度洗脱，流速：15ml/min，线性洗脱体积800ml。

为保证纯化效果，洗脱过程在流穿过程完成后进行。

优选地，所述步骤b，亲和层析平衡用缓冲液为PBS或PB，更优的为5-40mM的PBS。

步骤b中，所述亲和层析的步骤具体如下：将亲和层析柱经PBS缓冲液平衡之后，加入洗脱液I进行亲和层析，首先流出的为流穿液II，再加入洗脱试剂B，洗脱附着在HP亲和柱中的HP蛋白；所述洗脱试剂B可选甘氨酸缓冲液，所述甘氨酸缓冲液优选pH＝2.7。

所述步骤e平衡用缓冲液为PBS或20-50mM Tris缓冲液，更优的为20-50mM Tris缓冲液，将亲和层析柱经Tris pH7.4缓冲液平衡之后，加入流穿液III进行亲和层析，首先流出的为流穿液IV，再加入洗脱试剂C，洗脱附着在AAT亲和柱中的AAT蛋白；所述洗脱试剂C为：25mM Tris、2M MgCl₂，所述洗脱液IV优选pH＝7.4。

本发明还提供另一种纯化方法，具体包括如下步骤：

a、将血清透析到pH为4.5-5.8的层析缓冲液中，得透析样品，用阴离子交换层析对所述样品进行纯化，收集流穿液I和洗脱液I；

b、调流穿液I的pH至5.2-5.5，用阳离子交换层析纯化，再调pH至5.3-5.5，用阴离子交换层析纯化，得TRF蛋白；

c、洗脱液I用亲和层析纯化，得流穿液II及HP蛋白；

d、流穿液II经亲和层析，得流穿液III及AAT蛋白；

e、将流穿液III透析到pH为3.0-3.8的层析缓冲液中，得透析流穿液III，用阴离子交换层析对所述透析流穿液III纯化，收集AAG。

优选地，所述阴/阳离子交换层析和亲和层析，均包含平衡、上样、流穿和洗脱四个过程。

优选地，所述层析缓冲液为酸性缓冲液，可选醋酸缓冲液，磷酸缓冲液，盐酸缓冲液，碳酸缓冲液；更优选为醋酸缓冲液。

优选地，所述平衡的过程中，所述阴/阳离子交换层析所用试剂为层析缓冲液，所述亲和层析所用试剂为平衡缓冲液。

更优选地，所述平衡缓冲液选自PBS、PB或Tris缓冲液。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤a、b、e中需用到洗脱试剂A，所述洗脱试剂A包括：醋酸钠缓冲液和NaCl。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤c中所用试剂为甘氨酸缓冲液。

优选地，步骤d中所用试剂包括Tris和MgCl₂。

优选地，所述阴离子交换层析的填料为强阴离子交换层析填料(Q)或弱阴离子交换层析填料(DEAE)。

优选地，所述阳离子交换层析的填料为强阳离子交换层析填料(SP)或弱阳离子交换层析填料(CM)。

本发明还提供另一种纯化方法，具体包括如下步骤：

a、将血清透析到pH为4.2-5.0的层析缓冲液中，得透析样品，用阳离子交换层析对所述样品进行纯化，收集流穿液I和洗脱液I。

b、流穿液I经亲和层析纯化，得流穿液II和HP蛋白；

c、洗脱液I经亲和层析纯化，得流穿液III及AAT蛋白；

d、将流穿液II透析到pH为3.0-3.8的层析缓冲液中，得透析流穿液II，用阴离子交换层析纯化所述透析流穿液II，收集AAG蛋白；

e、将流穿液III透析到pH为5.3-5.5的层析缓冲液中，得透析流穿液III，用阴离子交换层析纯化所述透析流穿液III，得TRF蛋白。

优选地，所述阴/阳离子交换层析和亲和层析，均包含平衡、上样、流穿和洗脱四个过程。

优选地，所述层析缓冲液为酸性缓冲液，可选醋酸缓冲液，磷酸缓冲液，盐酸缓冲液，碳酸缓冲液；更优选为醋酸缓冲液。

优选地，所述平衡的过程中，所述阴/阳离子交换层析所用试剂为层析缓冲液，所述亲和层析所用试剂为平衡缓冲液。

更优选地，所述平衡缓冲液选自PBS、PB或Tris缓冲液。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤a、d、e中需用到洗脱试剂A，所述洗脱试剂A包括：醋酸钠缓冲液和NaCl。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤b中所用试剂为甘氨酸缓冲液。

优选地，步骤c中所用试剂包括Tris和MgCl₂。

优选地，所述阴离子交换层析的填料为强阴离子交换层析填料(Q)或弱阴离子交换层析填料(DEAE)。

优选地，所述阳离子交换层析的填料为强阳离子交换层析填料(SP)或弱阳离子交换层析填料(CM)。

本发明还提供另一种纯化方法，具体包括如下步骤：

a、将血清透析到pH为3.5-4.0的层析缓冲液中，得透析样品，用阳离子交换层析对所述样品进行纯化，收集流穿液I和洗脱液I；

b、将洗脱液I透析到pH为3.0-3.8的层析缓冲液中，得透析洗脱液I，用阴离子交换层析对所述透析洗脱液I进行纯化，收集AAG蛋白；

c、流穿液I亲和层析纯化，得流穿液II及HP蛋白；

d、流穿液II亲和层析纯化，得流穿液III及AAT蛋白；

e、将流穿液III透析到pH为5.3-5.5的层析缓冲液中，得透析流穿液III，用阴离子交换层析对所述透析流穿液III进行纯化，得TRF蛋白。

优选地，所述阴/阳离子交换层析和亲和层析，均包含平衡、上样、流穿和洗脱四个过程。

优选地，所述层析缓冲液为酸性缓冲液，可选醋酸缓冲液，磷酸缓冲液，盐酸缓冲液，碳酸缓冲液；更优选为醋酸缓冲液。

优选地，所述平衡的过程中，所述阴/阳离子交换层析所用试剂为层析缓冲液，所述亲和层析所用试剂为平衡缓冲液。

更优选地，所述平衡缓冲液选自PBS、PB或Tris缓冲液。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤a、b、e中需用到洗脱试剂A，所述洗脱试剂A包括：醋酸钠缓冲液和NaCl。

优选地，所述洗脱的过程中，步骤c中所用试剂为甘氨酸缓冲液。

优选地，步骤d中所用试剂包括Tris和MgCl₂。

优选地，所述阴离子交换层析的填料为强阴离子交换层析填料(Q)或弱阴离子交换层析填料(DEAE)。

优选地，所述阳离子交换层析的填料为强阳离子交换层析填料(SP)或弱阳离子交换层析填料(CM)。

技术效果：

1、实现了对血液中含量较少的蛋白的高纯度、高得量的提取。根据之前实验结果来看，直接用亲和层析方式在血清中纯化蛋白，由于干扰物质很多，纯化出的目的蛋白纯度很低，且对收率也影响很大；通过离子交换层析先将目的蛋白富集去杂，再用亲和/离子交换层析等方式去精纯，可有效解决纯度和收率问题。

2、实现了从同一份样品中同时提存四种所需蛋白。目前国内外没有将AAT、AAG、HP、TRF 4个蛋白在同一份人血清中同时纯化的报道，大部分都是在Cohn组分IV基础上分别纯化，蛋白的纯度与活性无法得到保证，可重复性较低。

本发明主要根据蛋白质等电点的不同，合理设计实验方案，用阴阳离子交换填料结合亲和层析进行纯化；纯化方式简单、纯化条件温和、成本低廉、利于放大生产。所得到的目的蛋白活性稳定、纯度高、收率高等特点。因此本发明方法具有较大的应用价值和潜力。

附图说明

图1：HP、AAG、AAT、TRF富集凝胶图

图2：HP的纯化

图3：AAG的纯化

图4：AAT的纯化

具体实施方式

实施例中离子交换层析，所用填料体积50ml，装柱高度10cm；洗脱方式为：0-100％洗脱试剂A梯度洗脱，流速：15ml/min，线性洗脱体积800ml。洗脱试剂A为：20mM醋酸钠缓冲液和0.5MNaCl。

每个实施例中洗脱液和流穿液并不互相关联，均为单独编号。

实施例1：从人血中分离纯化HP、AAG、AAT、TRF。

阴离子交换层析所用填料为：UniCore-DEAE，阳离子交换层析所用填料为：UniGel-80SP。

1、将样本人血清透析到层析缓冲液(pH＝4.7)中，得透析样品，用阴离子交换层析对透析样品进行纯化；层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝4.7，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，0-100％的洗脱试剂A的pH＝4.7，收集流穿液I和洗脱液I；在pH＝4.7的条件下，流穿液I包含TRF和AAT两种蛋白，洗脱液I包含HP和AAG两种蛋白。

2、用20mM PBS平衡HP亲和层析柱，将洗脱液I上样到HP亲和层析柱中进行纯化，收集先流出的流穿液II，流穿液II含有AAG蛋白；加入pH＝2.7的甘氨酸缓冲液，洗脱亲和层析填料中附着的HP，收集HP。

3、将流穿液II透析到层析缓冲液(pH＝3.4)中，得透析流穿液II，用阴离子交换层析对透析流穿液II进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝3.4，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，收集AAG；所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝3.4。

4、将流穿液I的pH调至5.2，用阳离子交换层析纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝5.2。用层析缓冲液平衡阳离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.2，收集洗脱液II与流穿液III；洗脱液II含有TRF 蛋白，流穿液III含有AAT蛋白。

5、进一步提纯上述流穿液III，用25mM Tris pH7.4缓冲液平衡亲和层析柱，之后将流穿液 III添加到AAT亲和层析柱中，去除掉先流出的流穿液之后，加入25mM TrispH7.4和2M的 MgCl₂进行洗脱，得提纯的AAT蛋白；

6、进一步提纯上述洗脱液II，将洗脱液II透析到层析缓冲液(pH＝5.3)中，得透析洗脱液 II，用阴离子交换层析对透析洗脱液II进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液， pH＝5.3，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.3，得TRF蛋白。

纯化后四种蛋白的纯度和收率结果如下表一，可以看出，利用本工艺方法，可以得到足以用于工业生产的高质量蛋白。

表一：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白收率及纯度

实施例2：从人血中分离纯化AAT、AAG、HP、TRF。

阴离子交换层析所用填料为：UniGel-30Q，阳离子交换层析所用填料为：UniGel-30SP。

1、将样本人血清透析到层析缓冲液(pH＝5.0)中，得透析样品，用阴离子交换层析对透析样品进行纯化；层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝5.0，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.0，收集流穿液I和洗脱液I；在pH＝5的条件下，流穿液I包含TRF蛋白，洗脱液I包含AAT、HP和AAG三种蛋白。

2、将流穿液I的pH调至5.3，用阳离子交换层析填料进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM 醋酸钠缓冲液，pH＝5.3，用层析缓冲液平衡阳离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A 梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.3，再用醋酸调pH至5.5，用阴离子交换层析进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝5.5，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.5，得 TRF蛋白。

结果如图1所示：M：marker，泳道1为样品，泳道2为经过阳离子交换层析柱的TRF条带，泳道3为经过阴离子交换层析后的TRF纯化条带，泳道4：，泳道5为去除的主要杂质，从图中可以看出，纯化的条带干净，蛋白量大，纯化效果好，且去除的杂质多，说明纯化的蛋白纯度高。

3、用20mM PBS平衡亲和层析柱，将洗脱液I上样到HPT亲和层析柱中纯化，收集先流出的流穿液II，流穿液II含有AAG蛋白和AAT蛋白；加入pH＝2.7的甘氨酸缓冲液，洗脱亲和层析填料中附着的HP，收集HP。

结果如图2所示，其中M：marker，泳道1：HP非变性胶条带，泳道2：HP变性条带。因为HP蛋白为多聚混合物，故非变性胶为100KD左右的多条带，而变性胶图为3条电泳带，因为HP本身为多聚体，所以结果表明，HP纯化效果很好，没有杂带。

4、进一步提纯上述流穿液II，用25mM Tris pH7.4缓冲液平衡亲和层析柱，之后将流穿液II 添加到AAT亲和层析柱中，收集流穿液III，流穿液III含有AAG蛋白；加入25mMTris pH7.4 和2M的MgCl₂进行洗脱，得提纯的AAT蛋白。

结果如图4所示，其中M：marker，泳道1和2都为AAT纯化条带，可以看出条带干净，说明纯化效果良好。

5、将流穿液III透析到层析缓冲液(pH＝3.4)中，得透析流穿液III，用阴离子交换层析对透析流穿液III进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝3.4；0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，收集AAG；所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝3.4。

结果如图3所示，其中M：marker，泳道1和2均为AAG条带，从图中可以看出条带干净，说明纯化效果很好。

纯化后四种蛋白的纯度和收率结果如下表二，可以看出，利用本工艺方法，可以得到足以用于工业生产的高质量蛋白。

表二：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白收率及纯度

实施例3

阴离子交换层析所用填料为：NanoGel-50Q，阳离子交换层析所用填料为：UniCore-CM。

1、将样本人血清透析到层析缓冲液(pH＝4.5)中，得透析样品，用阴离子交换层析对透析样品进行纯化；层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝4.5，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝4.5，收集流穿液I和洗脱液I；在pH＝4.5的条件下，流穿液I包含HP和AAG两种蛋白，洗脱液 I包含AAT和TRF两种蛋白。

2、用20mM PBS平衡亲和层析柱，将流穿液I上样到HPT亲和层析柱中进行纯化，收集先流出的流穿液II，流穿液II含有AAG蛋白；加入pH＝2.7的甘氨酸缓冲液，洗脱亲和层析柱中附着的HP，收集HP。

3、用25mM Tris pH7.4缓冲液平衡AAT亲和层析柱，将洗脱液I添加到平衡后的亲和层析柱，收集流穿液III，流穿液III含有TRF蛋白；加入25mM Tris pH7.4和2M的MgCl₂进行洗脱，得提纯的AAT蛋白。

4、将流穿液II透析到层析缓冲液(pH＝3.3)中，用醋酸调pH至3.3，用阴离子交换层析进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH3.3，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，收集AAG；所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝3.3。

5、将流穿液III透析到层析缓冲液(pH＝5.3)中，用阴离子交换层析进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝5.3，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.3，得TRF蛋白。

纯化后四种蛋白的纯度和收率结果如下表三，可以看出，利用本工艺方法，可以得到足以用于工业生产的高质量蛋白。

表三：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白收率及纯度

实施例4

阴离子交换层析所用填料为：DEAE-SepharoseF.F，阳离子交换层析所用填料为：Sepharose-SP。

1、将样本人血清透析到层析缓冲液(pH＝3.6)中，用阳离子交换层析对所述血清进行纯化。层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝3.6，用层析缓冲液平衡阳离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝3.6，收集流穿液I和洗脱液I；在pH＝3.6的条件下，流穿液I包含HP、TRF和AAT三种蛋白，洗脱液I包含AAG 蛋白。

2、进一步纯化AAG蛋白，将洗脱液I透析到层析缓冲液中(pH＝3.5)，用阴离子交换层析进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH3.5，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，收集AAG蛋白。

3、用20mM PBS平衡流穿液I，将平衡后的流穿液上样到HPT亲和层析填料中进行纯化，收集先流出的流穿液II，流穿液II含有TRF和AAT蛋白；加入pH＝2.7的甘氨酸缓冲液，洗脱亲和层析填料中附着的HP，收集HP。

4、用25mM Tris pH7.4缓冲液平衡，之后将流穿液II添加到AAT亲和层析填料，收集流穿液III，流穿液III含有TRF蛋白；加入25mM Tris pH7.4和2M的MgCl₂进行洗脱，得提纯的AAT蛋白。

5、将流穿液III透析到层析缓冲液(pH＝5.5)中，用阴离子交换层析进行纯化，层析缓冲液为：10-50mM醋酸钠缓冲液，pH＝5.5，用层析缓冲液平衡阴离子交换层析柱，接着用0-100％的洗脱试剂A梯度洗脱，所述0-100％的洗脱试剂A的pH＝5.5，得TRF蛋白。

纯化后四种蛋白的纯度和收率结果如下表四，可以看出，利用本工艺方法，可以得到足以用于工业生产的高质量蛋白。

表四：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白收率及纯度

实施例5HP、AAG、AAT、TRF的回收率实验

步骤如下：分别取纯化干燥过的四种蛋白0.5g加入1L人血中，采用实施例1中的工艺方法对加样的人血进行纯化，再计算四种蛋白回收率，回收率计算公式：加样后纯化得量-纯化得量)/加样量，实验结果如表五所示。

表五：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白的加样回收率

结果表明：加样回收率的范围在88％-105％之间，说明本发明工艺方法的重复性好。

实施例6HP、AAG、AAT、TRF的回收率实验

步骤如下：分别取纯化干燥过的四种蛋白0.5g加入1L人血中，采用实施例2中的工艺方法，计算四种蛋白回收率，实验结果如表六所示。

表六：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白的加样回收率

结果表明：加样回收率的范围在80％-120％之间，说明本发明工艺方法的重复性好。

实施例7HP、AAG、AAT、TRF的回收率实验

步骤如下：分别取纯化干燥过的四种蛋白0.5g加入1L人血中，采用实施例3中的工艺方法，计算四种蛋白回收率，实验结果如表七所示。

表七：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白的加样回收率

结果表明：加样回收率的范围在84％-103％之间，说明本发明工艺方法的重复性好。

实施例8HP、AAG、AAT、TRF的回收率实验

步骤如下：分别取纯化干燥过的四种蛋白0.5g加入1L人血中，采用实施例4中的工艺方法，计算四种蛋白回收率，实验结果如表八所示。

表八：α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、转铁蛋白的加样回收率

结果表明：加样回收率的范围在84％-110％之间，说明本发明工艺方法的重复性好。