阅读说明：本技术 一种i型胶原蛋白的提取方法及其应用 (Extraction method and application of type I collagen ) 是由 刘晓华 于 2020-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于软骨的技术领域,具体涉及一种I型胶原蛋白的提取方法及其应用,其中,一种I型胶原蛋白的提取方法包括：将动物骨脱脂、脱钙后,进行蛋白酶酶解,得到酶解液；提取所述酶解液后,加入蛋白变性溶液,得到胶原蛋白沉淀；溶解所述胶原蛋白沉淀后,盐析溶解后的胶原蛋白,得到胶原蛋白粗产物；纯化所述胶原蛋白粗产物,得到I型胶原蛋白。将I型胶原蛋白应用在实际中。本发明能够从动物硬质骨中提取I型胶原蛋白,大大提升了可食性骨的综合利用价值。本发明提供的I型胶原蛋白的提取方法的应用,其交联度适宜,具有良好的生物活性,且性质稳定,不易降解,具备新型软骨替代物生成纤维软骨的潜在应用。(The invention belongs to the technical field of cartilage, and particularly relates to an extraction method and application of type I collagen, wherein the extraction method of the type I collagen comprises the following steps: degreasing and decalcifying animal bones, and performing protease enzymolysis to obtain an enzymolysis liquid; after extracting the enzymolysis liquid, adding a protein denaturation solution to obtain collagen precipitation; dissolving the collagen precipitate, and salting out the dissolved collagen to obtain a crude collagen product; and purifying the crude collagen product to obtain the type I collagen. Type I collagen is used in practice. The invention can extract type I collagen from animal hard bones, and greatly improves the comprehensive utilization value of edible bones. The extraction method of the type I collagen provided by the invention has the advantages of proper crosslinking degree, good biological activity, stable property and difficult degradation, and has the potential application of generating fibrocartilage by using a novel cartilage substitute.)

一种I型胶原蛋白的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于软骨的技术领域，具体涉及一种I型胶原蛋白的提取方法及其应用。

背景技术

I型胶原蛋白(COL)，由两条α1链和一条α2链构成的异源三聚体，每条肽链均含有多个(Gly-Xaa-Yaa)n的重复序列，其中Gly为甘氨酸，X与Y常分别为脯氨酸及羟脯氨酸，这种结构有助于形成稳定三螺旋链结构，再成为原胶原并切除氨基端和羧基端，成为Ⅰ型胶原。I型胶原蛋白是人体内所含的各种胶原蛋白中最丰富的一种，存在于肌肉、皮肤、动脉壁、纤维软骨中，可以从动物组织中提取，具有优良的生物学性质，如低抗原性、凝血作用以及可调节细胞的粘附、增殖、分化等行为，其在生物相容性方面是最好的替代材料，且有利于细胞长入及软组织愈合。

人体拥有大量软骨，在软骨出现问题时，常常需要对应的软骨替代物来进行对应的治疗，由于I型胶原蛋白其在生物相容性方面是最好的替代材料，因此，一种各方面性能良好的I型胶原蛋白就显得尤为重要。

为了解决上述问题，本发明提供一种I型胶原蛋白的提取方法及其应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种I型胶原蛋白的提取方法，其能够从动物硬质骨中提取I型胶原蛋白，大大提升了可食性骨的综合利用价值。

本发明还有一个目的是提供了一种I型胶原蛋白的提取方法的应用，其交联度适宜，具有良好的生物活性，且性质稳定，不易降解，具备新型软骨替代物生成纤维软骨的潜在应用。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了一种I型胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：

将动物骨脱脂、脱钙后，进行蛋白酶酶解，得到酶解液；

提取所述酶解液后，加入蛋白变性溶液，得到胶原蛋白沉淀；

溶解所述胶原蛋白沉淀后，盐析溶解后的胶原蛋白，得到胶原蛋白粗产物；

纯化所述胶原蛋白粗产物，得到I型胶原蛋白。

优选的是，所述将动物骨脱脂、脱钙后，进行蛋白酶酶解，得到酶解液包括：

将动物骨破碎、水洗后，用浓度为0.5-0.8mol/L的氢氧化钠或者体积分数为70-75％乙醇溶液进行脱脂；

用浓度为0.01-0.02mol/L的盐酸对脱脂后的动物骨进行脱钙；

向脱钙后的物料里加入蛋白酶，进行酶解，得到酶解液。

优选的是，所述进行蛋白酶酶解，得到酶解液包括：

向脱钙后的物料中加入第一蛋白酶，在温度为50-55℃，pH＝5-7条件下，酶解20-40min，得到第一酶解液；

向第一酶解液中加入第二蛋白酶，在温度为50-55℃，pH＝5-7条件下酶解，得到酶解液；

其中，所述第一蛋白酶的质量分数为0.2～0.5‰，所述第一蛋白酶和所述第二蛋白酶的质量分数总和为3～5‰，两次酶解时间总和为5～7h。

优选的是，所述提取所述酶解液后，加入蛋白变性溶液，得到胶原蛋白沉淀包括：

提取酶解液，对酶解液进行缓慢搅拌、离心，得到上清液；

向所述上清液中加入氢氧化钠溶液，搅拌、调节pH后，得到去处蛋白酶的胶原蛋白沉淀。

优选的是，所述溶解所述胶原蛋白沉淀后，盐析溶解后的胶原蛋白，得到胶原蛋白粗产物包括：

将含有过氧乙酸的磷酸氢二钠溶液加入所述胶原蛋白沉淀中，待所述胶原蛋白沉淀溶解后，静置盐析、过滤、清洗，得到胶原蛋白粗产物。

优选的是，所述纯化所述胶原蛋白粗产物，得到I型胶原蛋白包括：

将含过氧乙酸的醋酸溶液加入所述胶原蛋白粗产物中，得到1g/L的胶原蛋白溶液；

将所述胶原蛋白溶液进行超滤纯化柱层析分离，经纳滤膜浓缩系统进入到双效降膜真空浓缩器，得到未消毒的I型胶原蛋白；

用钴60-γ射线辐照所述I型胶原蛋白，得到I型胶原蛋白。

优选的是，所述动物骨为牛跟腱或者牛骨。

一种所述提取方法提取的I型胶原蛋白在生成软骨替代物，并根据所述软骨替代物生成纤维软骨的应用。

优选的是，所述I型胶原蛋白的胶原分子间通过赖氨酸氧化酶形成赖氨酸-羟赖氨酸共价交联，形成致密的胶原纤维，生成软骨替代物，并根据所述软骨替代物生成纤维软骨。

本发明的有益效果

1、本发明提供的I型胶原蛋白的提取方法，其能够从动物硬质骨中提取I型胶原蛋白，大大提升了可食性骨的综合利用价值；

2、本发明提供的I型胶原蛋白的提取方法，其本发明的制备方法简单、生产效率高、经济效益突出；

3、本发明提供的I型胶原蛋白的提取方法，其工艺中采用膜法与真空降膜梯度浓缩水解胶原蛋白，节能效果明显；

4、本发明提供的I型胶原蛋白的提取方法，其提取过程含过氧乙酸，可以保证生产过程的无菌操作环境，同时，结合后续步骤用钴60-γ射线辐照，前后两个步骤的配合，能够使得提取的全程消毒无菌。

5、本发明提供的I型胶原蛋白的应用，其采用I型胶原蛋白，交联度适宜，具有良好的生物活性，且性质稳定，不易降解，具备新型软骨替代物生成纤维软骨的潜在应用。

附图说明

图1为一实施例提供的提取I型胶原蛋白的方法流程示意图；

图2为一实施例提供的I型胶原蛋白板软骨细胞甲苯胺染色示意图；

图3为一实施例提供的I型胶原蛋白纤维的显微镜成像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它组合的存在或添加。

本发明提供了一种I型胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将动物骨脱脂、脱钙后，进行蛋白酶酶解，得到酶解液；

具体的，将动物骨破碎、水洗后，用浓度为0.5-0.8mol/L的氢氧化钠或者体积分数为70-75％乙醇溶液进行脱脂；

具体的，用浓度为0.01-0.02mol/L的盐酸对脱脂后的动物骨进行脱钙；

具体的，向脱钙后的物料中加入第一蛋白酶，在温度为50-55℃，pH＝5-7条件下，酶解20-40min，得到第一酶解液；

具体的，向第一酶解液中加入第二蛋白酶，在温度为50-55℃，pH＝5-7条件下酶解，得到酶解液；

其中，所述第一蛋白酶的质量分数为0.2-0.5‰，所述第一蛋白酶和所述第二蛋白酶的质量分数总和为3-5‰，两次酶解时间总和为5-7h。

步骤2，提取所述酶解液后，加入蛋白变性溶液，得到胶原蛋白沉淀；

具体的，提取酶解液，对酶解液进行缓慢搅拌、离心，收集得到上清液；

具体的，向所述上清液中加入一定浓度的氢氧化钠溶液，并进行缓慢搅拌、调节pH后，得到去处蛋白酶的胶原蛋白沉淀。

步骤3，溶解所述胶原蛋白沉淀后，盐析溶解后的胶原蛋白，得到胶原蛋白粗产物；

具体的，将胶原蛋白溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置一段时间、过滤、用蒸馏水快速清洗数次，得到胶原蛋白粗产物。

步骤4，纯化所述胶原蛋白粗产物，得到I型胶原蛋白。

具体的，将上述胶原蛋白粗产物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)，得到1g/L的胶原蛋白溶液；

将所述胶原蛋白溶液(不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH接近5时，获取高纯度胶原)进行超滤纯化柱层析分离后进入到纳滤膜浓缩系统，随后进入到双效降膜真空浓缩器，得到未消毒的I型胶原蛋白；

用钴60-γ射线辐照所述I型胶原蛋白，得到I型胶原蛋白。

其中，具体的，所述动物骨为牛跟腱或者牛骨。

一种所述提取方法提取的I型胶原蛋白在生成软骨替代物，并根据所述软骨替代物生成纤维软骨的应用。

具体的，所述I型胶原蛋白的胶原分子间通过赖氨酸氧化酶形成赖氨酸-羟赖氨酸共价交联，形成致密的胶原纤维，生成软骨替代物，并根据所述软骨替代物生成纤维软骨。

本发明提供了下列实施例，来具体说明本发明的方法和应用。

实施例1

一种I型胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤：

将500g牛跟腱冷冻切片，用体积分数75％乙醇溶液浸泡6h脱脂消毒，用水冲洗干净，粉碎，按固液比1∶60(g/mL)分散于0.5mol/L醋酸-胃蛋白酶溶液中〔m(牛跟腱)∶m(胃蛋白酶)＝1∶0.03〕，使用冷循环装置在10℃以下进行酶解提取，提取过程中缓慢搅拌。7h后，提取液于4℃左右8000r/min离心5min，收集上清液，进入纯化阶段。首先，采用等电点沉淀法去除胃蛋白酶：往上清液中缓慢加入0.5mol/L氢氧化钠溶液，缓慢搅拌，调节溶液的pH至5.8-7.0，可观察到胶原蛋白沉淀析出。将沉淀溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置2分钟，过滤，纯水快速清洗胶原蛋白沉淀物3-4次，即得Ⅰ型胶原蛋白粗提取物。将粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析分离，其中，纯化层析柱截留相对分子质量为100kDa，超滤纯化过程中压力保持在0.8MPa以下。为保证胶原蛋白的稳定性，尽量使用温度保持4℃的冷循环装置。纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。

经检测，本申请实施例1中I型胶原蛋白的提取产率达到78.1％。但未经钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌，产品合格率降低。

根据上述记载，还包括对纯化过程中胃蛋白酶的残余检测，具体地，蛋白质属于两性物质，当其pH处于等电点时，分子表面净电荷为零，蛋白分子间的静电排斥作用减弱，吸引力增大，蛋白分子聚集发生沉淀。采用等电点沉淀法进行测试，蛋白质的回收率较高，并可有效清除中性脂肪。

胃蛋白酶可切除胶原蛋白非螺旋结构区域的过敏端肽，不破坏三螺旋结构。若将残留有胃蛋白酶的胶原蛋白制成产品容易出现颜色发黄等现象，并伴有刺激等不良反应，应尽量清除胶原蛋白中的胃蛋白酶。多次预实验发现，调节溶液的pH在5.8以上，接近胶原蛋白等电点时，胶原蛋白即絮凝沉淀。

由于胃蛋白酶亲水性较强，在水中的溶解度较大，根据溶解度的差异，多次快速水洗可除去胃蛋白酶。胃蛋白酶与鞣酸结合会出现白色沉淀，根据这一性质，可以判断胃蛋白酶是否残留。使用0.5mol/L氢氧化钠溶液，调节pH到胶原蛋白的等电点时，胶原蛋白析出，取滤液加入50g/L鞣酸溶液，出现大量白色浑浊，说明胶原蛋白沉淀后的滤液中含有较高浓度的胃蛋白酶；第1次和第2次水洗胶原蛋白后的滤液加入50g/L鞣酸溶液后，白色沉淀逐渐减少，第3次水洗胶原蛋白后，水洗滤液与鞣酸反应后，已观察不到絮状沉淀，肉眼判断如纯净水清澈。所以，经3次清洗可基本除去胃蛋白酶。

在此实施例中，Ⅰ型胶原蛋白不溶于水，但可溶于稀醋酸溶液，故采用酸酶结合提取法较为适用。由于胶原蛋白在38℃以上容易变性，因而提取操作尽量低温。胃蛋白酶蛋白相对分子质量大小在35-55kDa，会刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，是一种过敏源，纯化胶原蛋白的过程中需将其清除。胃蛋白酶与胶原蛋白长期作用，会导致胶原蛋白裂解为胶原蛋白肽甚至小分子质量的氨基酸。为消除胃蛋白酶的影响，通常通过盐析或加热失活胃蛋白酶。但盐析会引入氯离子，增加后期纯化胶原蛋白的困难，加热操作步骤会加大胶原蛋白变性的风险，进而破坏了胶原蛋白的结构及功效。

Ⅰ型胶原蛋白的相对分子质量约为300kDa，可被半透膜截留，一些小分子杂质可以从半透膜穿过从而达到分离纯化效果。但这一纯化过程周期长，需7d左右，容易滋生微生物，不利于工业化生产。本专利方法采用等电点沉淀法，可以快速有效清除胶原蛋白溶液中的蛋白酶；将胶原蛋白溶于磷酸氢二钠，盐析胶原蛋白，静置过滤，清洗胶原蛋白粗产物；使用超滤纯化技术，可得到高纯度的Ⅰ型胶原蛋白。

实施例2

从牛骨中提取I型胶原蛋白，包括以下步骤：

选取-18℃冷冻骨原料10公斤，首先用清水将其杂质冲洗干净后，通过硬质骨破碎机破碎将经过粉碎，粉碎粒度控制在10mm；

将粉碎后的骨使用清水冲洗、清理去杂、去除附着物；

在清洗后的碎骨采用NaOH溶液浓度为0.5mol/L，浸泡时间为6h，浸泡过程中搅拌转速为12rpm进行脱脂；

采用HCl溶液浓度为0.01mol/L，浸泡时间为10h，浸泡过程中搅拌转速为12rpm进行脱钙处理；

将前步骤处理后的物料进行蒸煮，蒸煮温度90℃，2h，蒸煮过程中搅拌转速为12rpm；

所使用的酶为胃蛋白酶，添加量为0.3‰，酶解温度为50℃，酶解时间5h，保持在pH5，酶解过程中搅拌转速为12rpm；

将上述酶解后物料首先通过固液分离，通过过滤的方式进行固液分离；液油分离采用碟片离心机对其进行处理，重相(酶解液)与轻相(骨油)通过高速离心进行分离；

往酶解液中缓慢加入0.5mol/L氢氧化钠溶液，并进行缓慢搅拌，调节pH，得胶原蛋白沉淀并去除蛋白酶；

将胶原蛋白溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置2分钟后过滤，蒸馏水清洗胶原蛋白粗产物5次；

将粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析分离，纯化层析柱截留相对分子质量为100kDa，超滤纯化过程中压力保持在0.8MPa以下。为保证胶原蛋白的稳定性，尽量使用温度保持4℃的冷循环装置。纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。

胶原蛋白液进入到纳滤膜浓缩系统，纳滤膜孔径1nm，浓缩到浓度Brix10°；随后进入到双效降膜真空浓缩器，浓缩到浓度为Brix40°，体积缩小为原体积的31.4％；将高纯度胶原蛋白浓缩液置于冷冻干燥机中，-50℃下冷冻干燥48h，节约能耗约69％。取出后真空封装，产品用钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌。

经检测，本申请实施例2中I型胶原蛋白的提取产率达到81.7％，且计算I型胶原蛋白得率(％)＝冻干I型胶原蛋白粗品质量/提取用原料骨质量×100％，其得率为3.53％。

实施例3

从牛跟腱中提取I型胶原蛋白，包括：

将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。

称取100g跟腱片于75％乙醇：正己烷＝3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液温度15-25℃，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗5次。

用0.05mol/L碳酸钠溶液浸泡24h，溶液温度15-25℃，机械搅拌，间隔8h更换一次碳酸钠溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗数次至跟腱片表面为中性(pH值为7)。

将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的75％(体积分数)乙酸溶液，溶液温度15-25℃，采用匀浆机对其匀浆破碎5次，每次匀浆5min。

将匀浆液至于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL75％(体积分数)的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶浓度为100mg/L，15-25℃下搅拌消化24h，离心15-30min。取上清液备用。

往上清液中缓慢加入0.5mol/L氢氧化钠溶液，并进行缓慢搅拌，调节pH，得胶原蛋白沉淀并去除蛋白酶；

将胶原蛋白溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置2分钟后过滤，蒸馏水清洗胶原蛋白粗产物4次；

将粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析分离，纯化层析柱截留相对分子质量为100kDa，超滤纯化过程中压力保持在0.8MPa以下。为保证胶原蛋白的稳定性，尽量使用温度保持4℃的冷循环装置。纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。

将高纯度胶原蛋白原液置于冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48h，取出后真空封装。产品用钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌。

经检测，本申请实施例3中I型胶原蛋白的提取产率达到78.6％。

实施例4

从牛跟腱中提取I型胶原蛋白，包括：

将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。

称取100g跟腱片于70％乙醇：正己烷＝3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液温度15-25℃，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗5次。

用0.04mol/L碳酸钠溶液浸泡24h，溶液温度15-25℃，机械搅拌，间隔8h更换一次碳酸钠溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗数次至跟腱片表面为中性(pH值为7)。

将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的72％(体积分数)乙酸溶液，溶液温度15-25℃，采用匀浆机对其匀浆破碎5次，每次匀浆5min。

将匀浆液至于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL72％(体积分数)的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶浓度为80mg/L，15-25℃下搅拌消化24h，离心15-30min。取上清液备用。

使用0.6mol/L氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠至氯化钠浓度为2mol/L，搅拌盐析12h，离心15-30min。将沉淀溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置5分钟后过滤，蒸馏水清洗胶原蛋白粗产物3次；

将粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析分离，纯化层析柱截留相对分子质量为100kDa，超滤纯化过程中压力保持在0.8MPa以下。为保证胶原蛋白的稳定性，尽量使用温度保持4℃的冷循环装置。纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。将高纯度胶原蛋白原液置于冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48h，取出后真空封装。产品用钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌。

经检测，本实施例4中I型胶原蛋白的提取产率达到79.1％。

实施例5

在本申请的另一个实施例中，从牛跟腱中提取I型胶原蛋白，包括：

将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。

称取100g跟腱片于73％乙醇：正己烷＝3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液温度15-25℃，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗5次。

用0.06mol/L碳酸钠溶液浸泡24h，溶液温度15-25℃，机械搅拌，间隔8h更换一次碳酸钠溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗数次至跟腱片表面为中性(pH值为7)。

将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的70％(体积分数)乙酸溶液，溶液温度15-25℃，采用匀浆机对其匀浆破碎5次，每次匀浆5min。

将匀浆液至于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL70％(体积分数)的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶浓度为80mg/L，15-25℃下搅拌消化24h，离心15-30min。取上清液备用。

使用0.6mol/L氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠至氯化钠浓度为2mol/L，搅拌盐析12h，离心15-30min。将沉淀溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置5分钟后过滤，蒸馏水清洗胶原蛋白粗产物3次；

粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，首先经过由活性炭填充的过滤脱色柱以5倍外水体积流过，随后以串联方式，经过脱色的液体再以8倍外水体积流速进入到填充阴阳离子树脂的树脂柱；

经过脱色脱盐处理后的液体离心后进入到纳滤膜浓缩系统，纳滤膜孔径1nm，浓缩到浓度Brix10°；随后进入到双效降膜真空浓缩器，浓缩到浓度为Brix40°，体积缩小为原体积的30.9％；将高纯度胶原蛋白浓缩液置于冷冻干燥机中，-50℃下冷冻干燥48h，节约能耗约69％。取出后真空封装，产品用钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌。

经检测，本申请实施例6中I型胶原蛋白的提取产率达到63.7％，且计算I型胶原蛋白得率(％)＝冻干I型胶原蛋白粗品质量/提取用原料骨质量×100％，其得率为2.08％。通过对酶溶性I型胶原蛋白(PSC)的分析，其具有完整的3股螺旋结构，保持了较好的网状结构，蛋白结构未被破坏。

实施例6

从牛骨中提取I型胶原蛋白，包括：

选取-18℃冷冻骨原料20公斤，首先用清水将其杂质冲洗干净后，通过硬质骨破碎机破碎将经过粉碎，粉碎粒度控制在10mm；

将粉碎后的骨使用清水冲洗、清理去杂、去除附着物；

在清洗后的碎骨采用NaOH溶液浓度为0.8mol/L，浸泡时间为6h，浸泡过程中搅拌转速为12rpm进行脱脂；

采用HCl溶液浓度为0.02mol/L，浸泡时间为10h，浸泡过程中搅拌转速为12rpm进行脱钙处理；

将前步骤处理后的物料进行蒸煮，蒸煮温度90℃，2h，蒸煮过程中搅拌转速为12rpm；

蛋白酶分两次加入，第一次加入蛋白酶，添加量为0.5‰，酶解温度为50℃，保持在pH5，酶解时间为20min；之后再第二次加入蛋白酶，酶解温度为50℃，保持在pH5，两次加入蛋白酶的添加量合计为4‰，两次酶解时间合计为5h，酶解过程中搅拌转速为12rpm；

将上述酶解后物料首先通过固液分离，通过过滤的方式进行固液分离；液油分离采用碟片离心机对其进行处理，重相(酶解液)与轻相(骨油)通过高速离心进行分离；

往酶解液中缓慢加入0.5mol/L氢氧化钠溶液，并进行缓慢搅拌，调节pH，得胶原蛋白沉淀并去除蛋白酶；

将胶原蛋白溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置2分钟后过滤，蒸馏水清洗胶原蛋白粗产物5次；

将粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析分离，纯化层析柱截留相对分子质量为100kDa，超滤纯化过程中压力保持在0.8MPa以下。为保证胶原蛋白的稳定性，尽量使用温度保持4℃的冷循环装置。纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。

胶原蛋白液进入到纳滤膜浓缩系统，纳滤膜孔径1nm，浓缩到浓度Brix10°；随后进入到双效降膜真空浓缩器，浓缩到浓度为Brix40°，体积缩小为原体积的30.9％；将高纯度胶原蛋白浓缩液置于冷冻干燥机中，-50℃下冷冻干燥48h，节约能耗约70％。取出后真空封装，产品用钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌。

经检测，本申请实施例6中I型胶原蛋白的提取产率达到82.6％，且计算I型胶原蛋白得率(％)＝冻干I型胶原蛋白粗品质量/提取用原料骨质量×100％，其得率为3.69％。通过对酶溶性I型胶原蛋白(PSC)的分析，其具有完整的3股螺旋结构，保持了较好的网状结构，蛋白结构未被破坏。

实施例7

在本申请的另一个实施例中，从牛骨中提取I型胶原蛋白，包括：

使用-18℃的冷冻牛骨，通过破碎机破碎将经过粉碎，粉碎粒度控制在20mm；

在清洗后的碎骨采用NaOH溶液浓度为0.6mol/L，浸泡时间为7h，浸泡过程中搅拌转速为24rpm进行脱脂；

采用HCl溶液浓度为0.015mol/L，浸泡时间为12h，浸泡过程中搅拌转速为24rpm进行脱钙处理；

将前步骤处理后的物料进行蒸煮，蒸煮温度95℃，3h，蒸煮过程中搅拌转速为24rpm；

蛋白酶分两次加入，第一次加入蛋白酶，添加量为0.5‰，酶解温度为55℃，保持在pH7，酶解时间为40min；之后再第二次加入蛋白酶，酶解温度为55℃，保持在pH7，两次加入蛋白酶的添加量合计为5‰，两次酶解时间合计为7h，酶解过程中搅拌转速为24rpm；

将上述酶解后物料首先通过固液分离，针对牛骨采用卧螺离心机进行固液分离方式进行固液分离；液油分离采用碟片离心机对其进行处理，重相(酶解液)与轻相(骨油)通过高速离心进行分离；

往酶解液中缓慢加入0.4mol/L氢氧化钠溶液，并进行缓慢搅拌，调节pH，得胶原蛋白沉淀并去除蛋白酶；

将胶原蛋白溶于含有低浓度过氧乙酸的磷酸氢二钠(0.02mol/L)，盐析胶原蛋白，静置2分钟后过滤，蒸馏水清洗胶原蛋白粗产物5次；

将粗提物溶于0.5mol/L醋酸(含过氧乙酸)配制成1g/L胶原蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析分离，纯化层析柱截留相对分子质量为100kDa，超滤纯化过程中压力保持在0.8MPa以下。为保证胶原蛋白的稳定性，尽量使用温度保持4℃的冷循环装置。纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原蛋白液pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。

胶原蛋白液进入到纳滤膜浓缩系统，纳滤膜孔径1nm，浓缩到浓度Brix10°；随后进入到双效降膜真空浓缩器，浓缩到浓度为Brix40°，体积缩小为原体积的31.1％；将高纯度胶原蛋白浓缩液置于冷冻干燥机中，-50℃下冷冻干燥48h，节约能耗约69％。取出后真空封装，产品用钴60-γ射线辐照法进行消毒杀菌。

经检测，本申请实施例7中I型胶原蛋白的提取产率达到82.3％，且计算I型胶原蛋白得率(％)＝冻干I型胶原蛋白粗品质量/提取用原料骨质量×100％，其得率为3.74％。通过对酶溶性I型胶原蛋白(PSC)的分析，其具有完整的3股螺旋结构，保持了较好的网状结构，蛋白结构未被破坏。

由于本发明实施例中融入了对比试验，现做说明：实例1是仅生产出胶原蛋白并做了结构分析，没有后续消杀产品化过程，其产率仅为78.1％，虽然提取过程含过氧乙酸，可以保证生产过程的无菌操作环境，但是没有后续步骤用钴60-γ射线辐照的协同配合，保证全程提取的消毒无菌，所以，产品合格率受到影响，故而降低了产率；

实施例2、实施例6和实施例7则加入膜分离浓缩法和消杀产品过程，此两个步骤可以提高得率，提取产率分别为81.7％、82.6％、82.3％，同时便于下一步的干燥，有节能的有益效果；

实施例3和实施例4可操作，但是未经过浓缩，结果提取产率分别为78.6％、79.1％，所以浓缩步骤也是非常重要，提高提取产率必不可少的；

实施例5则是省略了非常重要的一个步骤-超滤纯化，故产率降低很多69.7％，说明超滤纯化步骤是本实施例的提高提取率份重要步骤，不可缺少。

综上所述，本发明提供的一种提取I型胶原蛋白的方法提高了I型胶原蛋白的提取产率，且胶原蛋白中杂蛋白的含量较少。本发明提取的I型胶原蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，还能够促进上皮细胞的增生和胶原酶的生成，满足临床生物医学工程领域和化妆品行业的需求。本发明的制备工艺简单、可实现大规模生产，是一种经济有效的提取方法。通过I型胶原蛋白形成软骨替代物，能够利用I型胶原蛋白为骨矿化提供基本结构场所、保证了骨骼的韧性，还在骨细胞的发育、分化和活性调节等方面起重要作用，胶原结构和数量的改变可致骨细胞发育、分化和功能的异常，进而改变骨的结构和性能。

胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，结构高度复杂，从分子结构、超分子结构，再到组织分布和功能，具有显著的多样性。尽管如此，胶原蛋白的基本组成却是大同小异，在氨基酸序列上都含有(Gly-X-Y)n重复序列，这些重复序列是构成三聚体的结构基础，其中X通常为Pro，Y通常为Hy-Pm或Hy-Lys。Ⅰ型原胶原蛋白，即Ⅰ型胶原蛋白的前体，比Ⅰ型胶原蛋白在结构上多2个末端前肽结构(C-前肽与N-前肽)。Ⅰ型原胶原蛋白具有胶原蛋白家族中所有原胶原蛋白的典型特征:首先含有一段具有(Gly-X-Y)n重复序列的三聚体结构，在N端与C端的2个前肽形成非螺旋的结构域(NC结构域)，位于(Gly-X-Y)n重复序列两侧，NC结构域再进一步形成球状结构。折叠好的Ⅰ型原胶原蛋白是异源三聚体的结构，即由2条α1链与1条α2链交互缠绕所形成，胶原三聚体有很高的抗拉强度。Ⅰ型原胶原蛋白分泌到胞外基质中后，经过蛋白酶的剪切除去C-前肽与N-前肽，就形成了成熟的胶原蛋白。成熟的胶原蛋白能自我组装成高度有序的结构，即胶原蛋白纤维。

本发明还提供一种应用如上述型胶原蛋白的方法制备处的I型胶原蛋白，包括：应用所述I型胶原蛋白生成新型软骨替代物，并根据所述软骨替代物生成纤维软骨；其中，所述I型胶原蛋白的胶原分子间通过赖氨酸氧化酶形成赖氨酸-羟赖氨酸共价交联，成为排列规律的致密胶原纤维。通过甲苯胺蓝染色测定软骨细胞分泌的糖胺多糖GAG，I型板中软骨细胞异染现象明显，如图2所示,表明第三代软骨细胞分泌糖胺多糖GAG明显减少，I型胶原能促进软骨细胞分泌糖胺多糖GAG。通过将新型软骨替代物生成纤维软骨，可以为骨矿化提供基本结构场所、保证了骨骼的韧性，还在骨细胞的发育、分化和活性调节等方面起重要作用，并且可以改变可致骨细胞发育、分化和功能的异常，进而改变骨的结构和性能。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。