一种人工g四链体dna金属酶及其应用
阅读说明：本技术 一种人工g四链体dna金属酶及其应用 (Artificial G quadruplex DNA metalloenzyme and application thereof ) 是由 李�灿 郝静雅 苗文慧 于 2020-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人工G四链体DNA金属酶及其应用,所述金属酶由铁卟啉和人工G四链体DNA组成。在K～(+)存在条件下,将人工G四链体DNA和铁卟啉混合在缓冲溶液中,搅拌即可原位合成得到人工G四链体DNA金属酶。人工G四链体金属酶应用于烯烃不对称环丙烷化反应时,表现出较高的催化活性和较高的选择性。本发明中,不包含贵金属组分,显著降低了反应的成本,并且本发明的人工G四链体DNA金属酶使用条件温和,是一种绿色环保,活性高,选择性高且稳定性优异的新型人工酶。(The invention discloses an artificial G quadruplex DNA metalloenzyme and application thereof, wherein the metalloenzyme consists of ferriporphyrin and artificial G quadruplex DNA. At K + In the presence of the metal enzyme, the artificial G quadruplex DNA and the ferriporphyrin are mixed in a buffer solution and stirred to synthesize the artificial G quadruplex DNA metalloenzyme in situ. The artificial G quadruplex metalloenzyme shows higher catalytic activity and higher selectivity when being applied to the asymmetric cyclopropanation reaction of olefin. The artificial G quadruplex DNA metalloenzyme does not contain precious metal components, so that the reaction cost is obviously reduced, and the artificial G quadruplex DNA metalloenzyme has mild use conditions, is a novel artificial enzyme which is green and environment-friendly, and has high activity, high selectivity and excellent stability.)
技术领域
本发明涉及一种催化活性的人工DNA金属酶，具体为一种人工G四链体DNA金属酶，适用于催化烯烃不对称环丙烷化反应。
背景技术
：过渡金属催化的卡宾转移反应是功能化C＝C和C-H键强有力的一种方法。DNA基的催化是把金属化合物结合到DNA分子框架中，DNA提供一个第二配位环境，为反应底物提供手性环境，从而使得反应的选择性提高并同时加快反应速率。
传统的环丙烷化反应主要是通过Simmons-Smith反应实现的，但是这种方法通常需要使用有机溶剂，拆分的手性助剂或者手性添加物等缺点。
专利CN 110041361A中公开了一种光催化烯丙基化/环丙烷化串联反应合成1,1-二取代环丙烷的方法，但是没有提到反应的对映体选择性，并且在反应中使用了含有贵金属Ir的催化剂，价格比较高昂。
而酶催化则可以一定程度避免上述方法的一些缺点。2004年，Rudi Fasan组使用了肌红蛋白酶基的催化剂，通过改变蛋白框架近端残基的方法，得到了ee％可达99％以上的催化环丙烷化反应的催化剂。2013年，Frances H.Arnold组报道了P450酶的一系列突变体催化苯乙烯环丙烷化反应，对映体选择性也可以达到90％以上。2016年，Gerard Roelfes组使用DNA基的催化剂(鲑鱼睾丸DNA，一种双链DNA)催化对甲基苯乙烯的环丙烷化反应，但得到的ee％比较低，仅在50％左右。
本发明中采用铁卟啉与人工G四链体DNA原位合成的人工G四链体DNA金属酶进行烯烃不对称环丙烷化反应，对比Ir基光催化剂，人工G四链体DNA金属酶成本较低，并且使用量很少，对比蛋白质基的催化剂，人工G四链体DNA金属酶合成周期短，化学稳定性好。
发明内容
本发明的目的是提供一种烯烃不对称环丙烷化反应的人工G四链体DNA金属酶。本发明中人工G四链体DNA金属酶催化的环丙烷化反应经过铁卡宾中间体实现反应发生，脱氧核苷酸调控反应产物的手性选择性。
本发明的技术方案如下：一种人工G四链体DNA金属酶催化不对称的烯烃环丙烷化反应的方法。具体步骤如下：惰性气体氛围的保护下，向加有搅拌子的反应管中加入含有K+的缓冲溶液，在缓冲溶液中加入筛选得到的人工G四链体DNA和铁卟啉搅拌，人工G四链体DNA和铁卟啉通过非共价组装即可原位生成人工G四链体DNA金属酶，继续向上述人工G四链体DNA金属酶反应液中加入还原剂，烯烃和重氮试剂，1-5℃下搅拌反应2-12h，然后利用乙酸乙酯对反应液进行萃取，萃取得到的有机相经旋转蒸发后得到产物，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测。本发明中铁卟啉为FeTMPyP4、FeTMPyP3或FeTMPyP2中的一种，结构式如下：
人工G四链体DNA的序列为(5’-3’)：GGTTGGTGTGGTTGG(TBA)、TGGTCGGTGTGGTTGGT(TmC4T)、GGTTGGGGAGGTTGGC(mG7A9C)、GGTTGGTATGGTTGGA(mA9A)或GGTTGGTGAGGTTGG(mA9)中的一种；
人工G四链体DNA金属酶合成时，人工G四链体DNA和铁卟啉的添加比例范围0.25～3：1，优选添加比例范围1～3：1，最佳添加比例为1：1。
本发明中人工G四链体DNA金属酶催化的环丙烷化反应通式如下式：
人工G四链体DNA金属酶催化的烯烃不对称环丙烷化反应
人工G四链体DNA添加的浓度范围为10～50μM：铁卟啉添加的浓度范围为10～50μM；
所述缓冲溶液为磷酸钾缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种，优选缓冲溶液为磷酸钾缓冲溶液，缓冲溶液的浓度范围为10～100mM，其中HEPES缓冲溶液或MOPS缓冲溶液含有KCl 50～150mM；惰性气体为氩气。
所述的还原剂为连二亚硫酸钠或NADPH中的一种，还原剂的添加浓度范围为0.5～5mM。
所述烯烃为苯乙烯类似物中的一种或两种以上；浓度范围为20～50mM；重氮试剂为重氮乙酸乙酯和重氮乙酸叔丁酯中的一种，浓度为5～15mM。
所述苯乙烯类似物具体为苯乙烯以及苯环含取代基的苯乙烯衍生物中的一种或几种以上。
本发明的有益效果
本发明提供的一种用于烯烃不对称环丙烷化的人工G四链体DNA金属酶，在2小时的反应时间内对映体选择性可达80％。并且循环使用4次后，对映体选择性还可维持。
本发明首次应用人工G四链体DNA金属酶催化合成1,1-二取代环丙烷；具有反应效率高、对映体选择性好，底物普适性好、操作简便，以及反应条件温和等优点。
附图说明
图1人工G四链体DNA的NMR谱图
TBA、TmC4T、mG7A9C三条DNA序列在磷酸钾缓冲溶液(10mM，pH 7.0)中NMR谱图，说明形成右边所示的G四链体结构。
图2人工G四链体与铁卟啉组装前后的CD谱图；
TBA、TmC4T、mG7A9C三条DNA序列在磷酸钾缓冲溶液(10mM，pH 7.0)的CD谱图，以及与铁卟啉FeTMPyP4组装成人工G四链体金属酶后CD谱图，说明形成三条DNA序列均形成反平行的G四链体结构，且与铁卟啉组装后该结构保持。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
本发明所筛选使用的人工G四链体DNA，可以根据本发明提供的DNA序列经生工生物有限公司合成，或其他DNA合成公司购买得到。
本发明筛选得到的人工G四链体DNA序列具体信息如下：
(1)SEQ ID 1-5.的信息(参见序列表)
(a)序列特征：在K+条件下能够形成双层反平行G四链体结构
*长度：15～17bp
*类型：脱氧核酸
*链型：单链
*拓扑结构：G四链体
(b)分子类型：寡聚核苷酸链
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工合成。
序列表
SEQ ID NO.1
GGTTGGTGTGGTTGG
SEQ ID NO.2
TGGTCGGTGTGGTTGGT
SEQ ID NO.3
GGTTGGGGAGGTTGGC
SEQ ID NO.4
GGTTGGTATGGTTGGA
SEQ ID NO.5
GGTTGGTGAGGTTGG
实施例1：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(10mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：GGTTGGTGTGGTTGG(TBA)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP4(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶(具体表征可见图1和图2)，人工G四链体DNA和FeTMPyP4比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)和苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)-2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl 2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为48％。
产物分析
1:10),to afford the product as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.32-7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),7.13-7.11(m,2H),4.20(q,J＝4.0Hz,2H),2.58-2.53(m,1H),1.94-1.91(m,1H),1.63-1.61(m,1H),1.33-1.30(m,4H).HPLCanalysis condition:DaicelChiralcel-OJH,n-hexane,flow rate 1mL/min,λ＝225nm)，收率：44％。
实施例2：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(10mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：TGGTCGGTGTGGTTGGT(TmC4T)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP4(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶(具体表征可见图1和图2)，人工G四链体DNA和FeTMPyP4比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)-2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl 2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为-79％。
产物分析
1:10),to afford the product as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.32-7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),7.13-7.11(m,2H),4.20(q,J＝4.0Hz,2H),2.58-2.53(m,1H),1.94-1.91(m,1H),1.63-1.61(m,1H),1.33-1.30(m,4H).HPLCanalysis condition:DaicelChiralcel-OJH,n-hexane,flow rate 1mL/min,λ＝225nm)，收率：77％。
实施例3：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(10mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：TGGTCGGTGTGGTTGGT(TmC4T)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP4(25μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶，人工G四链体DNA和FeTMPyP4比例为1:2。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)-2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl 2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为-73％。
产物分析
Purified by column chromatography(SiO2,EtOAc:pentane＝1:10),to afford theproduct as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.32-7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),7.13-7.11(m,2H),4.20(q,J＝4.0Hz,2H),2.58-2.53(m,1H),1.94-1.91(m,1H),1.63-1.61(m,1H),1.33-1.30(m,4H).HPLC analysis condition:Daicel Chiralcel-OJH,n-hexane,flow rate 1mL/min,λ＝225nm)，收率：68％。
实施例4：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(10mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：TGGTCGGTGTGGTTGGT(TmC4T)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP4(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶，人工G四链体DNA和FeTMPyP4比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，4-氯苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)-2-(4-氯苯基)环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl 2-(4-chlorophenyl)cyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为-86％。
产物分析
CDCl3)δ＝7.21(d,J＝8.0Hz,2H),6.99(d,J＝8.0Hz,2H),4.15(c,J＝4.0Hz,2H),2.47-2.44(m,1H),2.02-1.82(m,1H),1.60-1.48(m,1H),1.27-1.21(m,4H).HPLCanalysiscondition:Daicel Chiralcel-OJH,n-hexane:ethanol＝98:2,flow rate 0.5mL/min,λ＝225nm)，收率74％。
实施例5：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入MOPS缓冲溶液(20mM，pH 7.0，KCl150mM)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：GGTTGGTGTGGTTGG(TBA)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP4(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶，人工G四链体DNA和FeTMPyP4比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)-2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为34％。
产物分析
1:10),to afford the product as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.32-7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),7.13-7.11(m,2H),4.20(q,J＝4.0Hz,2H),2.58-2.53(m,1H),1.94-1.91(m,1H),1.63-1.61(m,1H),1.33-1.30(m,4H).HPLCanalysis condition:DaicelChiralcel-OJH,n-hexane,flow rate 1mL/min,λ＝225nm)，收率：40％。
实施例6：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(10mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：GGTTGGGGAGGTTGGC(mG7A9C)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP4(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶(具体表征可见图1和图2)，人工G四链体DNA和FeTMPyP4比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，苯乙烯(30mM)和重氮乙酸叔丁酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)2-苯基环丙烷-1-羧酸叔丁酯[(1RS,2RS)-tert-Butyl 2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为81％。
产物分析
pentane＝1:30),to afford the product as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.20(m,2H),7.12(m,1H),7.02(m,2H),2.36(m,1H),1.76(m,1H),1.45(m,1H),1.40(s,9H),1.16(m,1H).HPLC analysis condition:Daicel Chiralcel-OJH,n-hexane,flow rate1mL/min,λ＝225nm)，收率69％。
实施例7：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(10mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：GGTTGGGGAGGTTGGA(mA9A)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP2(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶，人工G四链体DNA和FeTMPyP2比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物，(1RS，2RS)-2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl 2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为-46％。
产物分析
1:10),to afford the product as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.32-7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),7.13-7.11(m,2H),4.20(q,J＝4.0Hz,2H),2.58-2.53(m,1H),1.94-1.91(m,1H),1.63-1.61(m,1H),1.33-1.30(m,4H).HPLCanalysis condition:DaicelChiralcel-OJH,n-hexane,flow rate 1mL/min,λ＝225nm).收率：33％。
实施例8：
向加有搅拌子的10mL Schlenk管中加入磷酸钾(KPi)缓冲溶液(20mM，pH 7.0)，通氩气10min，加入DNA(12.5μM)：GGTTGGGGAGGTTGGA(mA9A)，在氩气保护下(鼓泡，通大气)，再加入FeTMPyP3(12.5μM)，搅拌10min原位生成人工G四链体DNA金属酶，人工G四链体DNA和FeTMPyP3比例为1:1。上述体系中加入连二亚硫酸钠(5mM)，苯乙烯(30mM)和重氮乙酸乙酯(10mM)，4℃下反应搅拌2h后结束反应，利用乙酸乙酯萃取，经旋转蒸发后得到产物(1RS，2RS)-2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯[(1RS,2RS)-Ethyl 2-phenylcyclopropane-1-carboxylate]，产物利用手性高效液相色谱进行分离检测，手性柱使用OJH柱。分析结果：对映体选择性为63％。
产物分析
1:10),to afford the product as a white solid.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.32-7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),7.13-7.11(m,2H),4.20(q,J＝4.0Hz,2H),2.58-2.53(m,1H),1.94-1.91(m,1H),1.63-1.61(m,1H),1.33-1.30(m,4H).HPLC analysis condition:Daicel Chiralcel-OJH,n-hexane,flow rate 1mL/min,λ＝225nm)，收率：59％。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种人工G四链体DNA金属酶及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtcggtgt ggttggt 17
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttggggag gttggc 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttggtatg gttgga 16
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttggtgag gttgg 15
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