阅读说明：本技术 一种菌株的应用及菌株转化粗甘油生产乙醇的方法 (Application of strain and method for producing ethanol by converting crude glycerol with strain ) 是由 姜莉莉 朱宝伟 刘凤翊 李昌丽 杨薇 修志龙 陈彦昊 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明适用于生物化学技术领域,提供了一种菌株的应用及菌株转化粗甘油生产乙醇的方法,该菌株为肺炎克雷伯菌E1,其16S rDNA核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；利用该菌株转化粗甘油生产乙醇的方法包括以下步骤：将肺炎克雷伯菌E1进行活化后,再接入种子培养基中进行培养,得到种子培养液；以粗甘油为底物,将上述种子培养液接种到含有粗甘油的发酵培养基中进行发酵培养。该菌株对生物柴油副产物粗甘油的高附加值转化利用,以及提高生物乙醇的市场竞争力均具有重要的应用价值。其中,在批次流加发酵实验中,与纯甘油相比当以粗甘油为底物时,该菌株更有利于乙醇的发酵生产,从而可以降低生物乙醇的生产成本。(The invention is suitable for the technical field of biochemistry, and provides an application of a strain and a method for producing ethanol by converting crude glycerol with the strain, wherein the strain is Klebsiella pneumoniae E1, and the 16S rDNA nucleotide sequence of the strain is shown in a sequence table SEQ ID NO. 1; the method for producing ethanol by converting crude glycerol by using the strain comprises the following steps: activating klebsiella pneumoniae E1, and inoculating into a seed culture medium for culture to obtain a seed culture solution; inoculating the seed culture solution into a fermentation culture medium containing crude glycerol to perform fermentation culture by using the crude glycerol as a substrate. The strain has important application values for high added value conversion and utilization of biodiesel byproduct crude glycerol and improvement of market competitiveness of bioethanol. In batch fed-batch fermentation experiments, compared with pure glycerol, when crude glycerol is used as a substrate, the strain is more beneficial to fermentation production of ethanol, so that the production cost of bioethanol can be reduced.)

一种菌株的应用及菌株转化粗甘油生产乙醇的方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种菌株的应用及菌株转化粗甘油生产乙醇的方法。

背景技术

人类对化石能源的过度依赖造成能源供需矛盾加剧、全球持续变暖、能源开支负担加重等一系列问题，全球对生物燃料的需求不断增加。目前，生物能源如生物乙醇和生物柴油占全球能源供应总量的10％，并预计在2050年作为交通运输燃料将从现在的2％的市场占有率增加到27％。近年来，燃料乙醇因具有能量密度高、易于运输、可再生性好等特点已成为全世界最主要的生物能源之一。全球燃料乙醇产量和消费量快速增长，目前有超过40个国家和地区推广生物燃料乙醇和车用乙醇汽油，年消费乙醇汽油约6亿吨，占全球汽油消费总量的60％左右。生物乙醇生产的主要原料包括：第一类是含糖作物，如甘蔗、甜菜、甜高粱等；第二类是淀粉质作物，如玉米、小麦、高粱、木薯、红薯、马铃薯及菊芋等；第三类是木质纤维质原料，如秸秆、木屑、农作物壳皮及城乡固体垃圾等。目前生物乙醇的生产存在与人争粮、生产成本高等问题，为拓展原料来源、保护环境，进一步提高生物乙醇的市场竞争力，人们不断尝试利用其它原料来降低生物乙醇的生产成本。

近年来，生物柴油产量呈指数级增长。根据欧洲的生物柴油委员会报道2014年在欧洲生物柴油的产量2.3千万吨，大约产生了260万吨的甘油，预测到2020年全球甘油的产量将达到419亿吨。虽然生物柴油产业刚刚起步，但其所产生的副产物粗甘油过剩问题，不仅导致了精制甘油市场价格的大幅度下降，也对环境造成了污染和负担，因此合理的利用粗甘油将其转化为高附加值产品对生物柴油产业的可持续发展具有十分重要的意义。

为了利用粗甘油并降低生物乙醇的生产成本，现有技术中虽然有利用微生物转化甘油生产乙醇，但是，现有报道的用于转化甘油生产乙醇的微生物存在乙醇产量较低等问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种菌株在转化粗甘油中的应用，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种菌株在转化粗甘油中的应用，所述菌株为肺炎克雷伯菌E1，其16S rDNA核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种菌株转化粗甘油生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

将16S rDNA核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示的肺炎克雷伯菌E1进行活化后，再接入种子培养基中进行培养，得到种子培养液；

以粗甘油为底物，将上述种子培养液接种到含有粗甘油的发酵培养基中进行发酵培养，得到含有乙醇的发酵液。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述步骤中，发酵培养的方式为批次流加发酵法，具体包括以下步骤：

在发酵培养过程中通过补加粗甘油，使发酵培养过程中粗甘油的浓度维持在15～25g/L。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，种子培养液的接种量为8％～12％。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述种子培养基包括以下组分：粗甘油15～25g、KH₂PO₄ 1～1.5g、K₂HPO₄·7H₂O 4～5g、(NH₄)₂SO₄ 1.5～2.5g、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3g、CaCO₃ 1.5～2.5g、Fe²⁺溶液0.5～1.5mL、CaCl₂溶液0.5～1.5mL、酵母粉0.8～1.2g、微量元素A溶液1.5～2.5mL，余量为水。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述Fe²⁺溶液包括以下组分：饱和盐酸3～5mL、FeSO₄·7H₂O 4～6g，余量为水；所述CaCl₂溶液的质量浓度为15～25g/L。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述微量元素A溶液包括以下组分：饱和盐酸0.8～1mL、CuCl₂·2H₂O 15～25mg、ZnCl₂ 60～80mg、MnCl₂·4H₂O 80～120mg、H₃BO₃50～70mg、CaCl₂·6H₂O 180～220mg、NiCl₂·6H₂O 20～30mg、NaMoO₄·2H₂O 30～40mg，余量为水。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述发酵培养基包括以下组分：粗甘油35～45g、KH₂PO₄ 1～1.5g、(NH₄)₂SO₄ 6～7g、MgCl₂·6H₂O 0.2～0.3g、CaCl₂ 0.2～0.4g、柠檬酸0.3～0.5g、酵母粉1～3g、微量元素B溶液4～6mL，余量为水。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述微量元素B溶液包括以下组分：ZnCl₂ 0.6～0.8g、MnCl₂·4H₂O 0.1～0.3g、H₃BO₃ 50～70mg、CuCl₂·2H₂O 0.4～0.6g、NaMoO₄·2H₂O 4～6mg、FeCl₂·4H₂O 3～5g、CoCl₂·6H₂O 0.4～0.6g、饱和盐酸8～12mL，余量为水。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述粗甘油中的甘油含量为80％～85％，灰分含量为3％～4％，水分含量为10％～15％。

本发明实施例提供的一种菌株在转化粗甘油中的应用，该菌株为肺炎克雷伯菌E1(Klebsiella pneumoniae E1)，其对生物柴油副产物粗甘油的高附加值转化利用，以及提高生物乙醇的市场竞争力均具有重要的应用价值。在批次流加发酵实验中，与纯甘油相比当以粗甘油为底物时，该菌株更有利于乙醇的发酵生产，从而可以降低生物乙醇的生产成本。

附图说明

图1为间歇发酵中甘油浓度对单菌E1生长的影响曲线图。

图2为间歇发酵中甘油浓度对甘油消耗时间的影响曲线图。

图3为实施例4的发酵培养过程中单菌E1代谢曲线图。

图4为对比例1的发酵培养过程中单菌E1代谢曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种菌株，属于K.pneumoniae，命名为肺炎克雷伯菌E1(Klebsiella pneumoniae E1)，其16S rDNA序列在NCBI数据库的序列号为K R259313，具体如序列表SEQ ID NO:1所示。该菌株，也叫肺炎克雷伯氏菌Y5，可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)中获得，其保藏号为CGMCC NO.10438。也可通过以下方法进行筛选得到：

S1、采集大连潮间带污泥样品(N38.87，E121.5)，置于-20℃的冰箱中进行保存，备用。

S2、以粗甘油(四川天宇油脂化学有限公司)作为碳源，将上述潮间带污泥样品进行活化处理后，按照10％的接种量接种于种子培养基中，并置于于37℃、200r/min的条件下进行培养12h，得到种子培养液。其中，每升种子培养基包括以下组分：粗甘油20g、KH₂PO₄1.3g、K₂HPO₄·7H₂O 4.454g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgS O₄·7H₂O 0.2g、CaCO₃ 2g、Fe²⁺溶液1mL、20g/L的CaCl₂溶液1mL、酵母粉1g、微量元素A溶液2mL，余量为水；每升Fe²⁺溶液包括以下组分：饱和盐酸4mL、FeSO₄·7H₂O 5g，余量为水；每升微量元素A溶液包括以下组分：饱和盐酸0.9mL、CuCl₂·2H₂O 20mg、ZnCl₂ 70mg、MnCl₂·4H₂O 100mg、H₃BO₃ 60mg、CaCl₂·6H₂O 200mg、NiCl₂·6H₂O 25mg、NaMoO₄·2H₂O 35mg，余量为水；粗甘油的成分包括：81.24％的甘油、3.42％灰分、11.92％水分、余量为盐分。

S3、将上述种子培养液按照10％的接种量接种含有2L的发酵培养基的发酵罐中，并置于37℃、250r/min的条件下进行批次流加发酵培养，发酵培养过程中，通过补加粗甘油使发酵过程中粗甘油浓度维持在20g/L左右，并利用5M的NaOH维持发酵液的pH＝7，以及通入0.1vvm氮气维持发酵罐中厌氧环境，得到发酵液。其中，每升发酵培养基包括以下组分：粗甘油40g、KH₂PO₄ 1.36g、(NH₄)₂SO₄ 6.61g、MgCl₂·6H₂O 0.26g、CaCl₂ 0.29g、柠檬酸0.42g、酵母粉2g、微量元素B溶液5mL，余量为水；每升微量元素B溶液包括以下组分：ZnCl₂0.68g、MnCl₂·4H₂O 0.17g、H₃BO₃ 60mg、CuCl₂·2H₂O 0.47g、NaMoO₄·2H₂O 5mg、FeCl₂·4H₂O 3.97g、CoCl₂·6H₂O 0.47g、饱和盐酸10mL，余量为水；粗甘油成分与上述相同。

S4、采用高效液相色谱定性和定量分析上述发酵液中的各种有机酸、糖类和醇类等代谢产物，从中筛选出乙醇产量最高的菌株，并对筛选的菌株的16S rDNA进行扩增和测序，具体可采用如序列表SEQ ID NO:2～3所示的引物7F:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和1540R:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由上海生工生物技术有限公司对筛选的菌株扩增的序列进行测序，并将获得的序列在NCBI中进行BLAST同源性比较，发现该菌株与数据库中Klebsiella pneumoniae的同源性最高，为99％，因此，判定该菌株属于K.pneumoniae。另外，将该菌株的16S rDNA序列提交到NCBI数据库中，获得其序列号为KR25931，具体如序列表SEQ ID NO:1所示。

实施例2

该实施例提供了一种菌株转化粗甘油生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

S1、将上述肺炎克雷伯菌E1进行活化后，再按照10％的接种量接种于种子培养基中，并置于于37℃、200r/min的条件下进行培养12h，得到种子培养液。其中，每升种子培养基包括以下组分：粗甘油15g、KH₂PO₄ 1g、K₂HPO₄·7H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O0.1g、CaCO₃ 1.5g、Fe²⁺溶液0.5mL、15g/L的CaCl₂溶液0.5mL、酵母粉0.8g、微量元素A溶液1.5mL，余量为水；每升Fe²⁺溶液包括以下组分：饱和盐酸3mL、FeSO₄·7H₂O 4g，余量为水；每升微量元素A溶液包括以下组分：饱和盐酸0.8mL、CuCl₂·2H₂O 15mg、ZnCl₂ 60mg、MnCl₂·4H₂O 80mg、H₃BO₃ 50mg、CaCl₂·6H₂O 180mg、NiCl₂·6H₂O 20mg、NaMoO₄·2H₂O 30mg，余量为水；粗甘油的成分包括：80％的甘油、4％灰分、15％水分、余量为盐分。

S2、以粗甘油为底物，将上述种子培养液按照8％的接种量接种含有2L的发酵培养基的发酵罐中，并置于37℃、250r/min的条件下进行批次流加发酵培养，发酵培养过程中，通过补加粗甘油使发酵过程中粗甘油浓度维持在15g/L左右，并利用5M的NaOH维持发酵液的pH＝7，以及通入0.1vvm氮气维持发酵罐中厌氧环境，即可得到含有乙醇的发酵液。其中，每升发酵培养基包括以下组分：粗甘油35g、KH₂PO₄ 1g、(NH₄)₂SO₄ 6g、MgCl₂·6H₂O 0.2g、CaCl₂ 0.2g、柠檬酸0.3g、酵母粉1g、微量元素B溶液4mL，余量为水；每升微量元素B溶液包括以下组分：ZnCl₂ 0.6g、MnCl₂·4H₂O 0.1g、H₃BO₃ 50mg、CuCl₂·2H₂O 0.4g、NaMoO₄·2H₂O4mg、FeCl₂·4H₂O 3g、CoCl₂·6H₂O 0.4g、饱和盐酸8mL，余量为水；粗甘油成分与上述相同。

实施例3

该实施例提供了一种菌株转化粗甘油生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

S1、将上述肺炎克雷伯菌E1进行活化后，再按照10％的接种量接种于种子培养基中，并置于于37℃、200r/min的条件下进行培养12h，得到种子培养液。其中，每升种子培养基包括以下组分：粗甘油25g、KH₂PO₄ 1.5g、K₂HPO₄·7H₂O 5g、(NH₄)₂SO₄ 2.5g、MgSO₄·7H₂O0.3g、CaCO₃ 2.5g、Fe²⁺溶液1.5mL、25g/L的CaCl₂溶液1.5mL、酵母粉1.2g、微量元素A溶液2.5mL，余量为水；每升Fe²⁺溶液包括以下组分：饱和盐酸5mL、FeSO₄·7H₂O 6g，余量为水；每升微量元素A溶液包括以下组分：饱和盐酸1mL、CuCl₂·2H₂O 25mg、ZnCl₂ 80mg、MnCl₂·4H₂O120mg、H₃BO₃ 70mg、CaCl₂·6H₂O 220mg、NiCl₂·6H₂O 30mg、NaMoO₄·2H₂O 40mg，余量为水；粗甘油的成分包括：85％的甘油、3％灰分、10％水分、余量为盐分。

S3、以粗甘油为底物，将上述种子培养液按照12％的接种量接种含有2L的发酵培养基的发酵罐中，并置于37℃、250r/min的条件下进行批次流加发酵培养，发酵培养过程中，通过补加粗甘油使发酵过程中粗甘油浓度维持在25g/L左右，并利用5M的NaOH维持发酵液的pH＝7，以及通入0.1vvm氮气维持发酵罐中厌氧环境，即可得到含有乙醇的发酵液。其中，每升发酵培养基包括以下组分：粗甘油45g、KH₂PO₄ 1.5g、(NH₄)₂SO₄ 7g、MgCl₂·6H₂O0.3g、CaCl₂ 0.4g、柠檬酸0.5g、酵母粉3g、微量元素B溶液6mL，余量为水；每升微量元素B溶液包括以下组分：ZnCl₂ 0.8g、MnCl₂·4H₂O 0.3g、H₃BO₃ 70mg、CuCl₂·2H₂O 0.6g、NaMoO₄·2H₂O 6mg、FeCl₂·4H₂O 5g、CoCl₂·6H₂O 0.6g、饱和盐酸12mL，余量为水；粗甘油成分与上述相同。

实施例4

该实施例提供了一种菌株转化粗甘油生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

S1、将上述肺炎克雷伯菌E1进行活化后，再按照10％的接种量接种于种子培养基中，并置于于37℃、200r/min的条件下进行培养12h，得到种子培养液。其中，每升种子培养基包括以下组分：粗甘油20g、KH₂PO₄ 1.3g、K₂HPO₄·7H₂O 4.454g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCO₃ 2g、Fe²⁺溶液1mL、20g/L的CaCl₂溶液1mL、酵母粉1g、微量元素A溶液2mL，余量为水；每升Fe²⁺溶液包括以下组分：饱和盐酸4mL、FeSO₄·7H₂O 5g，余量为水；每升微量元素A溶液包括以下组分：饱和盐酸0.9mL、CuCl₂·2H₂O 20mg、ZnCl₂ 70mg、MnCl₂·4H₂O100mg、H₃BO₃ 60mg、CaCl₂·6H₂O 200mg、NiCl₂·6H₂O 25mg、NaMoO₄·2H₂O 35mg，余量为水；粗甘油的成分包括：81.24％的甘油、3.42％灰分、11.92％水分、余量为盐分。

S3、以粗甘油为底物，将上述种子培养液按照8％～12％的接种量接种含有2L的发酵培养基的发酵罐中，并置于37℃、250r/min的条件下进行批次流加发酵培养，发酵培养过程中，通过补加粗甘油使发酵过程中粗甘油浓度维持在15-25g/L左右，并利用5M的NaOH维持发酵液的pH＝7，以及通入0.1vvm氮气维持发酵罐中厌氧环境，即可得到含有乙醇的发酵液。其中，每升发酵培养基包括以下组分：粗甘油40g、KH₂PO₄ 1.36g、(NH₄)₂SO₄ 6.61g、MgCl₂·6H₂O 0.26g、CaCl₂ 0.29g、柠檬酸0.42g、酵母粉2g、微量元素B溶液5mL，余量为水；每升微量元素B溶液包括以下组分：ZnCl₂ 0.68g、MnCl₂·4H₂O 0.17g、H₃BO₃ 60mg、CuCl₂·2H₂O 0.47g、NaMoO₄·2H₂O 5mg、FeCl₂·4H₂O 3.97g、CoCl₂·6H₂O 0.47g、饱和盐酸10mL，余量为水；粗甘油成分与上述相同。

对比例1

该对比例提供了一种菌株转化纯甘油生产乙醇的方法，其与实施例4的唯一区别在于，将底物粗甘油替换成了纯甘油。

实验例：

1、采用与上述实施例4相同的菌株、种子培养基、发酵培养基、底物以及发酵条件，将批次流加发酵培养方式替换成间歇发酵培养方式；在整个间歇发酵培养过程中，底物浓度对单菌E1生长的影响如附图1所示，从中可以看出，随着底物浓度的增加，单菌的生长受到了抑制。另外，底物浓度对底物消耗时间的影响如附图2所示，从中可以看出，随着甘油浓度的增加，甘油消耗时间延长。其中，单菌E1的最高甘油耐受浓度为100g/L，当继续提高底物浓度时甘油几乎不再消耗。由表1可见，随着甘油浓度的增加，单菌E1生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的产量也在逐渐增加。除了甘油浓度为60g/L外，当底物浓度增加时1,3-PD的转化率有所降低。间歇发酵实验中除了甘油浓度为60g/L外，随着甘油浓度的增加乙醇产量也在逐渐增加。乙醇的转化率随着甘油浓度的增加而逐渐降低，当甘油浓度为20g/L时乙醇的转化率最大为0.56mol/mol。具体的，间歇发酵实验中各产物的浓度、转化率(Y)以及生产强度(Q)的实验结果如表1所示。

表1

表1的实验结果表明当底物甘油的浓度较低时利于乙醇的生产。随着甘油浓度的增加，副产物中琥珀酸和乳酸的产量也在逐渐增加，并且乳酸的增加量显著。

2、对上述实施例4(底物为粗甘油)和对比例1(底物为纯甘油)的发酵培养过程中单菌E1代谢情况进行检测，其检测结果分别如附图3和4所示。从图中可以看出，在发酵前期以1,3-PD的生产为主，在发酵中后期乙醇的生产速度快于1,3-PD的生产速度，并且发酵结束时乙醇的产量明显高于1,3-PD的产量。另外，上述实施例4和对比例1的发酵培养过程中各产物的浓度、转化率(Y)以及生产强度(Q)如表2所示。

表2

从表2中可以看出，当以粗甘油为底物时乙醇的产量较高(35.04g/L)，乙醇的转化率和生产强度也最高，分别可达到0.50mol/mol，0.97g/(L·h)，因此单菌E1表现出对粗甘油很好适应性和转化率。另外，批次流加发酵实验中主要副产物为乳酸，可达21.53g/L，其余副产物的含量较低。由于单菌E1转化甘油的主要产物为乙醇、1,3-PD和乳酸，因此可以考虑利用单菌E1实现三者联产。

3、将上述实施例4提供的方法与现有文献报道的方法进行对比，其对比结果如表3所示。(其中，Klebsiella pneumoniaeY1菌株的来源详见中国申请号为201510212125.5的专利，其他菌株均在现有报道的文献中有记载)

表3

从表3可以看出，本发明实施例提供的生成乙醇的方法在粗甘油的利用方面具有一定的优势，其乙醇产量和生产强度均较高，具有潜在的应用价值。

需要说明的是，上述实验的分析方法如下：

(1)采用高效液相色谱定性和定量分析发酵液中的各种有机酸、糖类和醇类等代谢产物。

具体的，发酵液样品预处理：将发酵液利用小型离心机10000rpm离心10分钟，取上清液，将上清液与氯仿1:1混合，10000rpm再离心10分钟，再取上清，用高纯水稀释至合适的范围，即为液相色谱样。

仪器参数：液相色谱柱为A minex HPX-87H柱，柱温65℃，流动相为5mmol/L H₂SO₄，流速为0.6mL/min；检测器为CTO-10vp型折光示差检测器，进样量为20μL。

发酵液各组分含量通过标准曲线计算得到。

(2)甘油含量的测定：采用高碘酸钠氧化法。向1mL的发酵液中加入10mL水，滴加2～3滴酚酞指示剂，加入1M NaOH至粉红色，加入10mL高碘酸钠，于避光环境中反应5min后加入5mL乙二醇终止反应，滴加NaOH至变回原来的粉红色，记录NaOH的用量，据此计算甘油的浓度。

(3)菌体浓度测定：分光光度法测定650nm下的光密度，以浊度表征细胞浓度。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 营口理工学院

<120> 一种菌株的应用及菌株转化粗甘油生产乙醇的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 1

acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtag cacagagagc ttgctctcgg 60

gtgacgagcg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag ggggataact 120

actggaaacg gtagctaata ccgcataatg tcgcaagacc aaagtggggg accttcgggc 180

ctcatgccat cagatgtgcc cagatgggat tagctagtag gtggggtaac ggctcaccta 240

ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc 300

cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag 360

ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg gggaggaagg 420

cgataaggtt aataaccttg tcgattgacg ttacccgcag aagaagcacc ggctaactcc 480

gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa 540

gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc 600

attcgaaact ggcaggctag agtcttgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga 660

aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac aaagactgac 720

gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatgtcg atttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta acgcgttaaa 840

tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggtcttga 960

catccacaga acttrscaga gatgstttgg tgccttcggg aactgtgaga caggtgctgc 1020

atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ttatcctttg ttgccagcgg ttcggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gaccagggct acacacgtgc 1200

tacaatggca tatacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc ataaagtatg 1260

tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgt 1320

agatcagaat gctacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380

gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt 1440

gattcatgac tggg 1454

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagagtttga tcctggct 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggaggtgat ccagccgca 19