阅读说明：本技术 成分 (Composition (I) ) 是由 M·崔斯特瑞姆 B·莫塞尔 P·斯卡尔斯休斯基 于 2019-02-27 设计创作，主要内容包括：本文提供了用于制备食品增稠组合物的基于多糖的成分及其制备方法,该基于多糖的成分包括已经过蛋白质水解步骤的基于多糖的源材料。还提供了能够增加食品黏度的稳定的液体组合物及其制备方法,该组合物包括一种或多种增稠剂和已经过蛋白质水解步骤的基于多糖的成分。(Polysaccharide-based ingredients for preparing food thickening compositions comprising a polysaccharide-based source material that has been subjected to a proteolytic step, and methods of making the same are provided herein. Also provided are stable liquid compositions capable of increasing the viscosity of a food product, the compositions comprising one or more thickening agents and a polysaccharide-based ingredient that has been subjected to a proteolytic step, and methods of making the same.)

成分

技术领域

本发明涉及一种成分。特别是，本发明涉及用于制备食品增稠组合物的基于多糖的成分及其制备方法。本发明还涉及用于增加液体或半液体食品的黏度的稳定的液体组合物及其使用方法，所述稳定的液体组合物含有基于多糖的成分和增稠剂。

背景技术

通常希望提供黏性的增稠的液体，特别是对于老年和康复市场而言。增稠的液体需要具有特定的、已知的且可重复的黏度，以适用于这些市场。

许多管理部门已经开发出来预定的液体黏度，该液体黏度被认为在“减慢”吞咽困难患者的吞咽方面具有临床上显著的益处，因此预防该障碍的常见合并症，例如吸入性肺炎。鉴于吞咽障碍的严重程度不同，通常在临床上遵循以下专业指南：轻度黏稠(花蜜稠度)；中度黏稠(蜂蜜稠度)；以及黏稠(布丁稠度)。这些指南通常分别与150、400和900mPa.s相关。

通常使用粉末状增稠剂来获得用于在公共机构和家庭中管理吞咽困难的增稠饮料，这种增稠剂已通过诸如团聚等物理改性“速溶化”。然而，这样的粉末可能具有局限性，例如不能根据需要将准确的体积剂量递送至食品，以及需要专门的混合设备以获得足够的剪切力来确保其充分分散。此外，粉末状增稠剂表现出其黏度所花费的时间通常不是瞬时的(即，＜30秒)，而是可能需要花费高达几分钟来使食品达到其最大或期望的黏度。通过在浓溶液中表现出增稠剂黏度并稀释回到所需浓度而起作用的市售液体增稠剂同样受到分散和表现出其黏度所需剪切量的限制。当在室温下储存时，这种液体增稠剂也不能在足够长的时间内稳定，从而导致其一种或多种组分的分离。

因此，仍然需要稳定的液体增稠剂组合物，其可用于例如患有咀嚼和/或吞咽障碍，例如吞咽困难的个体进食，并克服了市售液体和/或粉末状增稠剂组合物的一种或多种固有局限性。

发明内容

在第一方面，本发明提供了用于制备食品增稠组合物的基于多糖的成分，其包含：

基于多糖的源材料，其选自由以下组成的组：西部落叶松(Larix occidentalis)多糖提取物、美洲落叶松(Larix laricina)多糖提取物、金合欢树(Acacia tree)多糖提取物、欧洲落叶松(Larix decidua)多糖提取物、西伯利亚落叶松(Larix sibirica)多糖提取物及其任何组合；

其中所述基于多糖的源材料已经过蛋白质水解步骤。

在一些实施方案中，蛋白质水解步骤已经将所述基于多糖的源材料的初始蛋白质水平降低至第二蛋白质水平。

在一个实施方案中，所述基于多糖的源材料已进一步经过蛋白质提取步骤。

在第二方面，本发明提供了制备用于制备食品增稠组合物的基于多糖的成分的方法，包括以下步骤：

(i)提供选自由以下组成的组的基于多糖的源材料：西部落叶松多糖提取物、美洲落叶松多糖提取物、金合欢树多糖提取物、欧洲落叶松多糖提取物、西伯利亚落叶松多糖提取物及其任何组合；和

(ii)水解所述基于多糖的源材料的一部分蛋白质；

从而制备所述基于多糖的成分。

在一些实施方案中，步骤(ii)将所述基于多糖的源材料的初始蛋白质水平降低至第二蛋白质水平。

在一个实施方案中，本发明方面的方法还包括从(ii)的基于多糖的源材料中提取一部分水解的蛋白质的步骤。

关于前述方面，蛋白质水解步骤适当地包括热处理、蛋白酶处理、酸处理、碱处理、微波辐射处理和金属水合离子(metal aqua ion)处理中的一种或多种。更优选，蛋白质水解步骤包括热处理和/或酸处理。

在第一方面和第二方面的具体实施方案中，酸处理包括使基于多糖的源材料与选自由乳酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、甲酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、葡糖酸及其任意组合组成的组的食品级酸接触。优选，食品级酸是或包含葡糖酸，例如至少部分衍生自葡糖酸δ-内酯的葡糖酸。

参照上述方面，酸处理适当地在约3至约5的pH下进行。优选，酸处理在约4.0至4.5的pH下，更优选在约4.2至4.4的pH下进行。

在第一方面和第二方面的某些实施方案中，热处理在约55℃至约90℃的温度下进行。更优选，热处理在约65℃至约85℃，甚至更优选约70℃至约80℃的温度下进行。

适当地，第一方面和第二方面的蛋白质提取步骤包括重力分离、离心、尺寸排阻层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、自由流动电泳、金属结合、免疫亲和层析以及免疫沉淀中的一种或多种。

关于第一方面和第二方面，蛋白质水解步骤优选进行约15分钟至约30小时的时间,更优选约8小时至约20小时，甚至更优选约30分钟至约2小时。

在第三方面，本发明提供了通过第二方面的方法制备的基于多糖的成分。

在第四方面，本发明提供了黏度小于4000cP的稳定的液体组合物，其包含：

(i)一种或多种增稠剂；和

(ii)第一方面和第三方面的基于多糖的成分；

其中将该组合物添加到水性液体食品或水性液体-固体混合物食品中会增加所述食品的黏度。

适当地，增稠剂选自由以下组成的组：琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、黄芪胶、茄替胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基乙基纤维素、刺梧桐胶、黄原胶、槐豆胶、塔拉胶、车前籽胶、榅桲籽胶(quince seed gum)、果胶、叉红藻胶、结冷胶、魔芋、海藻酸钠及其任何组合。

在一个实施方案中，组合物的黏度小于2000cP。

在具体实施方案中，组合物的水活度大于95％。

在一个优选的实施方案中，组合物在室温下稳定至少六个月。

适当地，该组合物被配置为当添加到食品中时，基本上不改变食品的阻抗水平。在这方面，食品优选是或包含用于确定吞咽困难诊断和/或预后的介质。

在第五方面，本发明提供了增加水性液体食品或水性液体固体混合物食品黏度的方法，该方法包括以下步骤：

(a)向食品中添加第四方面的稳定的液体组合物；和

(b)混合所述食品和所述组合物，以通过该组合物促进所述食品的黏度增加。

适当地，混合步骤包括施加低剪切混合。为此，优选将低剪切混合施加约30秒或更短时间以实现食品的最大黏度。更优选，将低剪切混合施加约10秒至约30秒以实现食品的最大黏度。在具体实施方案中，低剪切混合包括以约10rpm至约40rpm的速度搅拌所述组合物。

在某些实施方案中，将食品的黏度适当地增加至大于95cP。

关于上述方面，黏度增加的食品适合患有咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状的个体进食。优选咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状是或包括吞咽困难。

在第六方面，本发明提供了产生稳定的液体组合物的方法，包括以下步骤：

(i)提供第一方面或第三方面的基于多糖的成分；

(ii)将一种或多种增稠剂添加到所述基于多糖的成分中；和

(iii)混合步骤(ii)的混合物，从而产生稳定的液体组合物。

适当地，稳定的液体组合物是第四方面的液体组合物。

除非上下文另外要求，否则，本文所用的术语“包含(comprise)”和该术语的变体，例如“包含/包括(comprising)”、“包含/包括(comprises)”和“包含/包括(comprised)”并非意图排除其他元素、组件，整数或步骤，而是可以包括一个或多个未叙述的其他元素、组件、整数或步骤。

应当理解，不定冠词“一(a)”和“一(an)”不应被理解为单数不定冠词，或排除多个或者不定冠词所指主题的多个主题。例如“一”多糖包括一种多糖、一种或多种多糖和多种多糖。

附图说明

为了帮助理解本发明并使本领域技术人员能够实施本发明，仅通过示例的方式参照附图来描述本发明的优选实施方案，其中：

图1提供了食品增稠组合物的制造方法的实施方案；

图2提供了图1的食品增稠组合物制造方法的每个阶段中滞留物的减少百分比；

图3展示了在用不同浓度的液体组合物增稠的四种稠度(未增稠、增稠至水平150、水平400和水平900)上的10mL诊断食团介质(diagnostic bolus medium)，所述液体组合物含有本发明的基于多糖的成分的实施方式；

图4提供了在加工过程中采集的样品的SDS PAGE。PM表示含有SeeBlue Plus2预染色蛋白质梯的泳道。泳道1：第一提取物(TSC 1)，泳道2：第二提取物(TSC 2)，泳道3：大量滞留物2(TSC 3)，泳道4：第三提取物(TSC 4)，泳道5：大量滞留物3(TSC 5)，泳道6：大量滞留物4(TSC 6)，泳道7：FG商业产品(TSC 7)和泳道8：大量滞留物1(TSC 8)。红色箭头表示已用于LC-MS分析的60、40和20kDa(从上至下)的蛋白质条带；

图5示出了样品TSC2-3的基础峰色谱图，其示出了丰富但未匹配的肽峰的m/z值。T表示来自胰蛋白酶自身的自溶肽；

图6展示了在最初的水胶体(大量滞留物1，图5A)和最终产物(大量滞留物5，图5B)中七个丰富不匹配肽的提取离子色谱图；

图7示出了来自样品TSC 1的凝胶条带的提取离子色谱图；图7A、7B和7C分别显示了在60kDa(TSC1-1)、40kDa(TSC1-2)和20kDa(TSC1-3)处的条带的肽；

图8示出了来自样品TSC 2的凝胶条带的提取离子色谱图；图8A、8B和8C分别显示了在60kDa(TSC2-1)、40kDa(TSC2-2)和20kDa(TSC2-3)处的条带的肽；

图9展示了来自样品TSC 3的凝胶条带的提取离子色谱图；图9A、9B和9C分别显示了在60kDa(TSC3-1)、40kDa(TSC3-2)和20kDa(TSC3-3)处的条带的肽；

图10展示了来自样品TSC 5的凝胶条带的提取离子色谱图；图10A和10B分别显示了40kDa(TSC5-1)和20kDa(TSC5-2)处的条带的肽；

图11示出了从样品TSC 5提取的凝胶条带的提取离子色谱图；图11A和11B分别显示了在40kDa(TSC8-2)和20kDa(TSC8-3)处的条带的肽。

具体实施方式

本发明有利地提供了用于制备液体食品增稠组合物的基于多糖的成分，该成分稳定(例如，在室温下长达六个月)，并且当分散在液体或半液体食品中时可以是控释的并表现出黏度的。由于当添加到食品中时液体食品增稠组合物几乎不改变或不改变该食品的阻抗水平的能力，因此用这种组合物增稠的食品，例如电解质溶液，也可以在诊断和/或预后设置方面表现出实用性。包含基于多糖的成分的液体食品增稠组合物在添加到食品中时也仅需要使用低剪切混合力(例如用勺子轻轻混合)，以便在其中快速表现其黏度(例如，<30秒)。

一方面，本发明提供了用于制备食品增稠组合物的基于多糖的成分，其包含：

基于多糖的源材料，其选自由以下组成的组：西部落叶松多糖提取物、美洲落叶松多糖提取物、金合欢树多糖提取物、欧洲落叶松多糖提取物、西伯利亚落叶松多糖提取物及其任意组合；

其中基于多糖的源材料已经过蛋白质水解步骤。

在一些实施方案中，蛋白质水解步骤已经将基于多糖的源材料的初始蛋白质水平降低至第二蛋白质水平。

在一个实施方案中，基于多糖的源材料已进一步经过蛋白质提取步骤。

在相关方面，本发明提供了制备用于制备食品增稠组合物的基于多糖的成分的方法，包括以下步骤：

(i)提供基于多糖的源材料，所述多糖源材料选自由以下组成的组：西部落叶松多糖提取物、美洲落叶松多糖提取物、金合欢树多糖提取物、欧洲落叶松多糖提取物、西伯利亚落叶松多糖提取物及其任意组合；和

(ii)水解所述基于多糖的源材料的一部分蛋白质；

从而制备所述基于多糖的成分。

在一些实施方案中，步骤(ii)将基于多糖的源材料的初始蛋白质水平降低至第二蛋白质水平。

在一个实施方案中，本方面的方法还包括从(ii)的基于多糖的源材料中提取一部分水解的蛋白质的步骤。

因此，基于多糖的成分是指经改性的基于多糖的源材料，例如植物胶，其已经过水解以降解蛋白质部分，以及在适当时或任选地，降解其多糖部分。

如本文所用，术语“多糖”通常是指由约10至超过100,000个糖单元通过半缩醛或糖苷键彼此连接而形成的聚合物。多糖可以是直链、单分支的或多分支的，其中每个分支可以具有其他二级分支，并且单糖可以分别是吡喃糖(6-元环)或呋喃糖(5元环)形式的D-或L-环糖，例如D-果糖和D-半乳糖。另外，它们可以是环状糖衍生物、脱氧糖、糖、糖酸或多衍生糖。如本领域技术人员应当理解的，多糖制品，特别是从自然界分离的多糖制品，通常包含分子量是非均相的分子。

术语“基于多糖的源材料”是指含有一种或多种多糖作为其主要成分的材料(例如，按基于多糖的源材料的重量计，基于多糖的源材料包含至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或其中的任何范围的多糖)。因此，基于多糖的源材料可以包括诸如蛋白质、脂质等其他成分，作为其次要成分。

如本文所述，基于多糖的源材料，例如本文所述的植物提取物或植物胶，还含有蛋白质部分作为其次要成分。在某些实施方案中，按基于多糖的源材料的总重量计，基于多糖的源材料的初始蛋白质含量或水平为约或小于约20wt％(例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5wt％以及其中的任何范围)，优选小于约10wt％，更优选小于约6wt％。这样，在一些实施方案中，在上文步骤(ii)中处理基于多糖的源材料后产生的第二蛋白质含量或水平小于约20wt％(例如，20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5wt％以及其中的任何范围)。

“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，如本领域众所周知的D-氨基酸或L-氨基酸。术语“蛋白质”包括并涵盖“肽”和“多肽”，肽通常用于描述具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质，“多肽”通常用于描述具有超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。

“蛋白质水解”或“水解蛋白质”是指使蛋白质材料结合在一起的化学键的裂解或断裂的过程，从而蛋白质水解或分解成分子量通常小于其原始(即未水解)状态的蛋白质的更小的肽或蛋白质片段。在一个实施方案中，本发明的方法部分水解木质纤维素材料。本文所用的“部分水解(Partial hydrolysis)”或“部分水解(partially hydrolyses)”及其任何语法变体是指水解反应，裂解或断裂少于100％的使蛋白质结合在一起的化学键。举例来说，可以使用热处理、酸、碱、一种或多种酶或这些中的任何的任意组合来水解蛋白质。

因此，在具体实施方案中，蛋白质水解步骤包括热处理、蛋白酶处理、酸处理、碱处理、微波辐射处理和金属水合离子处理中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，蛋白质水解步骤包括热处理和/或酸处理。在这方面，蛋白质水解步骤可以包括：(b)单独的酸处理；(b)单独的热处理；(c)依次用酸处理，然后用热处理；或(d)依次用热处理，然后用酸处理。

本文所用“处理(treating)”或“处理(treatment)”可以指例如接触、浸泡、蒸汽浸渍、喷雾、悬浮、浸入(immersing)、饱和、浸入(dipping)、润湿、漂洗、洗涤、浸入和/或其任何变化和/组合。

术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。术语“蛋白酶”可以包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其十三个亚类中的每一个)。EC编号是指NC-IUBMB,Academic Press,San Diego,California的Enzyme Nomenclature 1992(酶命名法1992)。应当理解，蛋白酶根据其催化机理被分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)和未知的或至今仍未分类的蛋白酶(U)。(参见例如Handbook ofProteolytic Enzymes(催化酶手册),A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds),Academic Press(1998))，

本文所用的蛋白酶可以来自例如水果、动物来源、细菌或真菌。蛋白酶可具有内活性和/或外活性或其任何组合。应当理解，用于本发明方法的合适的蛋白酶可从商业供应商获得，例如Novozymes、Genencor、AB-Enzymes和DSM Food Specialities Amano，尽管不限于此。示例性的蛋白酶是细菌或真菌来源的蛋白酶，例如来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformes)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶。

技术人员应当容易地理解，本文所用术语“酸”是指各种pH小于7、可与碱反应形成盐的水溶性化合物。酸的实例可以是单质子的或多质子的，并且可以包含一个、两个、三个或更多个酸官能团。酸的实例包括但不限于无机酸(mineral acid)、路易斯酸、酸性金属盐、有机酸、固体酸、无机酸(inorganic acid)或其任何组合。优选，酸处理包括使基于多糖的源材料与食品级酸接触，所述食品级酸例如乳酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸，甲酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、葡糖酸及其任意组合。优选，酸例如食品级酸的浓度为约0.1-5M，更优选约0.5M至约2M。

在一个具体实施方案中，食品级酸为或包含葡糖酸，例如至少部分衍生自葡糖酸δ-内酯的葡糖酸。在这方面，应当理解，葡糖酸δ-内酯通常在水溶液中水解，产生葡糖酸。

关于蛋白质水解步骤，酸处理适当地在约2.0至约6.0，优选约3.0至4.0或其中任何范围的pH下进行。在具体实施方案中，酸处理在约2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0及其任意范围的pH下进行。在某些优选的实施方案中，酸处理在约4.2-4.4的pH下进行。

如技术人员应当容易理解的，本文所用的“碱”是指各种pH大于7、可与酸反应以形成盐的水溶性化合物。举例来说，碱可包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化镁和碱金属盐，例如但不限于碳酸钠和碳酸钾。

在具体实施方案中，就蛋白质水解步骤而言，可以用一种或多种酸和/或碱处理基于多糖的源材料。例如，可以用1、2、3、4、5或更多种酸和/或碱处理基于多糖的源材料。

对于蛋白质水解步骤，按基于多糖的源材料的重量计，酸和/或碱的存在量可以为约0.1％至15％或其中的任何范围，例如但不限于约0.3％至约13％，或约1％至约10％。在本发明的具体实施方案中，按基于多糖的源材料的重量计，蛋白质水解步骤中存在的酸和/或碱的量为约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％、4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％、6％、6.25％、6.5％、6.75％、7％、7.25％、7.5％、7.75％、8％、8.25％、8.5％、8.75％、9％、9.25％、9.5％、9.75％、10％、10.25％、10.5％、10.75％、11％、11.25％、11.5％、11.75％、12％、12.25％、12.5％、12.75％、13％、13.25％、13.5％、13.75％、14％、14.25％、14.5％、14.75％、15％或其中的任何范围。在本发明的某些实施方案中，按基于多糖的源材料的重量计，蛋白质水解步骤中存在的酸和/或碱的量为约1％至约2％。

关于蛋白质水解步骤，热处理适当地在约40℃至99℃，优选约55℃至约90℃或其中的任何范围内的温度下进行，例如但不限于约65℃至约85℃或约45℃至约80℃。在具体实施方案中，热处理在约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃及其任何范围的温度下进行。在某些优选的实施方案中，热处理在约70℃至约80℃的温度下进行。

关于前述方面，蛋白质水解步骤是适当地进行约15分钟至约48小时，优选约20分钟至约12小时，更优选约30分钟至约2小时，以及其中的任何范围的时间。在具体实施方案中，蛋白质水解步骤进行约15分钟，20分钟、30min、40min、50min、1hr(小时)、1.25hr、1.5hr、1.75hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、7hr、8hr、9hr、10hr、11hr、12hr、13hr、14hr、15hr、16hr、17hr、18hr、19hr、20hr、21hr、22hr、23hr、24hr、25hr、26hr、27hr、28hr、29hr、30hr、31hr、32hr、33hr、34hr、35hr、36hr、37hr、38hr、39hr、40hr、41hr、42hr、43hr、44hr、45hr、46hr、47hr、48hr以及其中的任何范围的时间。

本文中通常所用的术语“蛋白质提取”是指至少部分地从基于多糖的源材料中分开、去除和/或分离蛋白质，更特别是水解的蛋白质，蛋白质提取可以通过本领域中已知的任何方法或方式进行。蛋白质提取的示例性方法包括重力分离、离心、尺寸排阻层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、自由流动电泳、金属结合、免疫亲和层析和免疫沉淀。

在一些实施方案中，蛋白质提取步骤产生的第二蛋白质水平比基于多糖的初始材料的初始蛋白质水平低至少约50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％。在具体实施方案中，蛋白质提取步骤产生的第二蛋白质水平比所述初始蛋白质水平低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％及其中的任何范围。

关于上述内容，可以通过本领域技术人员已知的任何方式来确定蛋白质的水解程度(参见例如Petersen et al.,Determination of the Degree of Hydrolysis(DH)basedon OPA Reaction(基于OPA反应确定水解程度(DH)),ED-9512723Novo Nordisk A/S,Dec.1995；Frister et al.,OPA method modified by use of N,N-dimethyl-2-mercaptoethylammonium chloride as thiol component(通过使用N,N-二甲基-2-巯基乙基氯化氨作为硫醇成分来改进的OPA方法),Fresenius J.Anal.Chem.330(1988)631)。

在另一方面，本发明提供了通过前述方面的方法制备的基于多糖的成分。

关于前述方面，基于多糖的成分优选地能够或适于调节和/或控制增稠剂例如下文所述的那些增稠剂的水结合能力。为此，基于多糖的成分优选地能够对包含基于多糖的成分和增稠剂的液体组合物例如本文提供的那些液体组合物产生特定程度的黏度抑制。另外，基于多糖的成分还可以控制稀释液体组合物时释放和/或逆转其黏度抑制的速率和程度。

因此，在另一方面，本发明提供了黏度小于4000cP的稳定的液体组合物，其包含：

(i)一种或多种增稠剂；和

(ii)上文所述的基于多糖的成分；

其中将组合物添加到水性液体食品或水性液体固体混合物食品中会增加所述食品的黏度。

本文所用的术语“增稠剂”是指本文提供的用于增加液体混合物和/或溶液的黏度的那些化合物，尤其是用于食品应用的那些化合物，包括食用胶、植物胶和食品级多糖。增稠剂的非限制性实例包括琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、黄芪胶、茄替胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基乙基纤维素、刺梧桐胶、黄原胶、槐豆胶、塔拉胶、车前籽胶、榅桲籽胶、果胶、叉红藻胶、结冷胶、魔芋、海藻酸钠及其任何组合。

用于增稠或增加食品黏度的液体组合物是本领域已知的。举例来说，US2004/0197456(以下称为“Holahan”)描述了旨在用于吞咽障碍者的液体增稠剂。然而，在Holahan中公开的发明描述了一种液体组合物，该液体组合物具有浓缩至其预期使用水平的几倍的增稠剂。与本文所述的控释技术不同，Holahan的液体增稠剂所包含的增稠剂已在其中充分表现出其黏度，因此，甚至在添加到食品中之前，它已完全水合，然后再以一定的体积简单地添加Holahan的液体增稠剂，从而使得现在稀释的液体增稠剂在食品中表现出所需的黏度。

在具体实施方案中，该组合物的水活度大于95％。应当容易理解的是，水活度或a_w定义为在相同温度下材料中水的分蒸气压与水的标准状态分蒸气压之比。另外，水通常从水活度高的区域迁移到水活度低的区域。例如，本文提供的液体组合物的水活度超过95％(例如，约或超过95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％和其中的任何范围)，然后通常需要保护其免受相对湿度小于95％的大气或环境的影响，以防止液体组合物在存储过程中以及在递送或分配之前变干，递送或分配可以通过本领域已知的例如泵分配器或另一种密封递送系统进行。

可以通过本领域已知的任何方式存储和/或递送上述方面的液体组合物。在具体实施方案中，液体组合物通过本领域中已知的容器和泵分配器装置来存储和/或递送(参见，例如，PCT/AU2017/050966，其通过引用并入本文)。在替代实施方案中，液体组合物通过小袋或诸如此类(例如本文所提供的)存储和/或递送。

适当地，当以期望的量添加至水性液体食品或水性液体固体混合物食品中时，本文所述的液体组合物不会改变其对消费者具有吸引力的特定的所需属性，例如食品的原始风味和/或颜色。就这一点而言，当以期望的量添加到所述食品中时，液体组合物优选对所述食品的风味和/或颜色几乎没有贡献，或没有贡献。另外，为了避免稀释食品的风味和/或颜色特性，优选要添加到食品中以达到所需黏度的液体组合物的量尽可能地少。

关于本发明，本文所述的液体组合物适当地是可流动的。为此，本发明液体组合物适当地具有小于4000cP的黏度，更优选为约2000cP至约4000cP的黏度。有利的是，具有这类黏度的液体组合物可以容易地从例如泵分配器或小袋中分配，并且当以期望的量添加到水性液体食品或水性液体固体混合物食品中时，能够分散而几乎没有搅拌或没有搅拌(即，低剪切混合力)。此外，本发明的液体组合物优选是浓缩的，并且可以容纳相对较高百分比的增稠剂而不损失组合物的流动性。这进一步使得能够容易且准确地将液体组合物分配到所选食品中。

在前述方面的某些实施方案中，液体组合物的黏度为约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000cP或其中的任何范围。优选地，液体组合物的黏度为约500cP至约1500cP。更优选地，液体组合物的黏度为约750cP至约1250cP。

液体组合物的黏度可以通过本领域已知的任何方法来测量。举例来说，可以使用Bostwick Consistometer(Bostwick稠度计)、Brookfield Viscometer(布鲁克菲尔德黏度计)、流变仪或类似装置来测量黏度。优选地，黏度以流变仪提供的绝对厘泊来测量，而不是以黏度计测量的相对厘泊来测量。本领域技术人员应当理解，流变仪测量代表确定食品黏度的最佳方法，且因此是标准方法。

适当的是，本文所述的液体组合物将水性液体食品或水性液体固体混合物食品的黏度增加至大于95cP。本方法的优点在于，通过将液体组合物温和地混合到液体或液体固体食品中，可以有效地解除由于基于多糖的成分而导致的对增稠剂黏度表达的抑制。由于控制释放基于多糖的成分对增稠剂的黏度抑制作用，这使得增稠剂能够快速表现其黏度，因此有助于其容易且快速地并入食品中。相对于在添加到食品中之前已经充分地水合，并因此可能难以以平滑且省时的方式并入食品中的增稠剂而言，例如Holahan中描述的增稠剂，这是一个优点。此外，当用液体或液体固体食品稀释时，完全水合的增稠剂完全表现黏度本身对容易且迅速地表现出黏度增加而言是一个障碍。

因此，应当清楚的是，在任何前述方面中，组合物中的增稠剂优选在添加到食品中之前不是完全水合的。

在某些实施方案中，在添加液体组合物后，所述食品的黏度增加至至少95、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、350,400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000cP，或其中的任何范围。

出于本发明的目的，按液体组合物的重量计，增稠剂的存在量可以为约3％至约30％或其中的任何范围，例如但不限于约5％至约15％，或约7％至约12％。在本发明的具体实施方案中，按液体组合物的重量计，增稠剂的存在量为约3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、13.0％、13.5％、14.0％、14.5％、15.0％、15.5％、16.0％、16.5％、17.0％、17.5％、18.0％、18.5％、19.0％、19.5％、20.0％、20.5％、21.0％、21.5％、22.0％、22.5％、23.0％、23.5％、24.0％、24.5％、25.0％、25.5％、26.0％、26.5％、27.0％、27.5％、28.0％、28.5％、29.0％、29.5％、30.0％、30.5％、31.0％、31.5％、32.0％、32.5％、33.0％、33.5％、34.0％、34.5％、35.0％、35.5％、36.0％、36.5％、37.0％、37.5％、38.0％、38.5％、39.0％、39.5％、40.0％或其中的任何范围。在本发明的某些实施方案中，按液体组合物的重量计，增稠剂的存在量为约3％至约20％。

对于本发明，基于多糖的成分合适地以不会明显有助于液体组合物黏度的足够高的浓度存在。为此，按液体组合物的重量计，本文所述的基于多糖的成分存在量可以为约3％至约30％或其中的任何范围，例如但不限于约5％至约20％，或约7.5％至约17.5％。

在本发明的具体实施方案中，按液体组合物的重量计，本文所述的基于多糖的成分的存在量为约3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、13.0％、13.5％、14.0％、14.5％、15.0％、15.5％、16.0％、16.5％、17.0％、17.5％、18.0％、18.5％、19.0％、19.5％、20.0％、20.5％、21.0％、21.5％、22.0％、22.5％、23.0％、23.5％、24.0％、24.5％、25.0％、25.5％、26.0％、26.5％、27.0％、27.5％、28.0％、28.5％、29.0％、29.5％、30.0％、30.5％、31.0％、31.5％、32.0％、32.5％、33.0％、33.5％、34.0％、34.5％、35.0％、35.5％、36.0％、36.5％、37.0％、37.5％、38.0％、38.5％、39.0％、39.5％、40.0％或其中的任何范围。在本发明的某些实施方案中，按液体组合物的重量计，本文所述的基于多糖的成分的存在量为约3％至约20％。如果基于多糖的成分的浓度低于该范围，则当添加增稠剂时，液体组合物通常形成黏性溶液并且丧失流动性。

优选地，所包括的基于多糖的成分的量使得稳定的液体组合物的黏度低于包含仅具有水或另一种合适的水溶液的增稠剂的液体组合物的黏度。更优选地，基于多糖的成分将稳定的液体组合物的黏度降低至包含仅具有水或另一种合适的水溶液的增稠剂的液体组合物的黏度的至少三分之一。在具体实施方案中，基于多糖的成分将稳定的液体组合物的黏度降低至包含仅具有水或另一种合适的水溶液的增稠剂的液体组合物黏度的至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％或其中的任何范围。

适当地，本文所指的组合物在室温下稳定至少六个月，并且高达至少两年。就此而言，发明人已经证明，本发明的包括基于多糖的成分的液体组合物在室温下保存6个月或更长时间后，其组成材料(例如，基于多糖的成分和增稠剂)之间几乎没有表现出分离或没有表现出分离。这与本领域已知的那些液体增稠剂相反。举例来说，美国专利6,455,090(在下文中称为“Uzahashi”)描述了产生液体增稠制剂的方法，当添加到液体中时，该液体增稠制剂可增稠，并且最初其形成黏性溶液或凝胶受到抑制。该发明人声称，该本发明可以适当地添加到用于患有咀嚼和吞咽困难的患者的液体或半液体食品中。

然而，Uzahashi公开的发明受到限制，因为其中所述的增稠剂既未显示出微生物稳定性也未显示出物理稳定性，而是迅速分离而形成层。另外，Uzahashi的增稠剂当添加到液体食品中时不能始终一致地且均匀地增稠液体食品。因此，Uzahashi的液体增稠剂在管理吞咽障碍(吞咽困难)以便预防或限制这种病状的常见合并症方面没有实际用途。这种实用性缺乏有两个方面。首先，缺乏物理稳定性以及由此导致的溶剂和胶凝剂之间的分离阻碍了Uzahashi液体增稠剂的准确计量。因此，所公开的本发明就所得增稠食品的预定黏度而言不能始终保证满足所需水平。其次，诸如本文所述的患者通常是易感人群。实际上，Uzahashi的液体增稠剂组合物在微生物学上不是稳定的，因此不应如所述在临床上将其施用给适应人群。相反，本文所述的包括基于多糖的成分的液体组合物通过不分离以形成层而成功地克服了现有技术的这种缺陷，并因此在添加至水性液体食品或水性液体固体混合物食品中时始终赋予其精确的预定黏度(参见例如，表3)。

因为本发明的组合物是稳定的，增稠剂的性能没有明显降低，所以黏度在商业上合理的时间内保持恒定。因此，制剂本身可以作为包装产品提供给最终用户，例如在计量泵分配器中或在小袋中。为此，最终用户可以可靠地计算出要添加到食品或饮料中以实现其所需最终黏度的本发明液体组合物的量。然后将本发明的液体组合物容易地分配并容易地混入食品中以得到所需的最终产品。

如前所述，以这种方式包装和使用液体组合物的能力是由于增稠剂和基于多糖的成分联合存在的结果，基于多糖的成分会抑制增稠剂的黏度表达，直至通过施加低剪切混合释放黏度，并且与传统的粉末状或凝胶状增稠剂小袋相比在使用时具有明显的优势，众所周知，所述小袋(当精确的包装尺寸不合适时)难以精确地配给并且难以混入液体食品中。

本发明液体组合物随时间的稳定性可以通过液体组合物的颜色保持(如果有的话)、风味(如果有的话)、分离(如果有的话)、微生物腐坏(如果有的话)、黏度和/或澄清度来表示。另外地或可替代地，液体组合物的稳定性可以由该组合物在添加到食品中时将黏度始终一致地且可重复地赋予预定水平的能力来确定。液体组合物的稳定性可以通过使用食品科学领域技术人员可以利用的任何技术来确定，包括微生物测试以测量微生物腐坏的程度和速率；目测物理变化，例如分离和/或沉淀；感官评估以确定颜色、风味和/或透明度的变化；使用Bostwick Consistometer、Brookfield Viscometer、流变仪或类似设备进行黏度测量。

就稳定性而言，本发明的液体组合物还可以包含食品级防腐剂，这是本领域众所周知的。合适的食品级防腐剂包括但不限于结冷胶、维生素E、山梨酸钾、苯甲酸钠、偏亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、EDTA、二氧化硫、乳链菌肽和丙酸。在一个优选的实施方案中，食品级防腐剂为或包含结冷胶。液体组合物中防腐剂的量可以为基于液体组合物的总重量的约0.001％至约0.1％。

同样，关于稳定性，本文所述液体组合物的pH适当地为约3.0至约7.5(例如3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5及其中的任何范围)。优选地，液体组合物的pH为约4-4.4。为此，可以通过本领域已知的任何手段，例如上文所述的手段实现液体组合物的酸性pH。

适当地，将本文所述的液体组合物添加至水性液体食品或水性液体固体混合物食品中，用于患有咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状的个体进食。优选地，咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状是或包括吞咽困难。因此，对于该用途，优选将液体组合物分离成适当的单独部分，例如小袋，或者是可泵分配的。

应当容易理解，吞咽困难是吞咽过程受损的病状。在进食期间，这可能导致液体或固体食品进入受害者的气管，随后进入受害者的肺部，可能导致吸入性肺炎。吞咽困难可在任何年龄发生，但在老年人中最为常见，尤其是如果他们患有中风或患有痴呆。吞咽困难受害者的一种管理策略是消费质地改性的食品(即增稠的食品和饮料)，所述食品减慢吞咽反射，并在食品通过之前给予气管关闭的时间，从而防止食品吸入。

适当地，将该组合物配置为当添加到食品中时，基本上不改变食品的阻抗水平。这样，当添加到食品中时，其导致具有已知电阻抗的介质，该介质可适合诊断和/或预后设置中的应用，所述设置例如高分辨率阻抗测压法(high resolution impedance manometry,HRIM)。因此，在具体实施方案中，食品是或包括用于确定患有咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状例如吞咽困难的个体的诊断和/或预后的介质。

通常是通过要求患者在X射线机前吞咽造影剂并对吞咽成像(视频荧光透视法)以对造影剂通过咽和食道的行程可视化来研究吞咽困难症状。此程序受到限制，因为它仅提供了患者如何吞咽的“快照”。此外，X射线评估是定性的，而视频荧光透视法无法评估咽和食道中肌肉的收缩或松弛强度，以及这些与吞咽内容(content)运动之间的关系。但是，可以使用称为测压法的技术来测量肌肉的收缩状态。最近，有一项能够以“高分辨率”(即HRIM)测量压力和所产生的内容流动(阻抗)的重要的进步。利用含有许多紧密间隔的压力传感器结合阻抗电极的导管，可将收缩压力和所产生的流动无缝地“映射”到空间和时间，并构建流量图，为患有吞咽困难的患者提供基于生物力学的吞咽评估方式。但是，此诊断能力需要将专门的食团介质增稠到一致的可重复预定水平，从而允许准确测量和分析压力(测压)和流动(阻抗)，但重要的是，不会明显影响诊断食团介质的阻抗水平。

用于阻抗研究的诊断介质，例如HRIM，通常包括电解质溶液。应当理解，这种诊断介质的电阻抗可以在很大程度上由固定的电荷密度以及因此其中的带电粒子的浓度决定。在增稠这种诊断介质中具有实际用途的液体组合物通常必须配置为，相对于已知具有临床功效的黏度和厚度范围(例如150-900cP),将其阻抗水平保持在已知的阻抗范围(例如150-200Ohm)内。

在不受任何理论束缚的情况下，据信从基于多糖的成分中去除蛋白质级分可消除、降低或控制液体组合物中带电蛋白质的浓度。因此，当添加到诊断介质例如电解质水溶液中时，所得诊断介质的阻抗显示出的阻抗变化很小或没有，因为其中带电颗粒的水平几乎没有增加或没有增加。

在又一方面，本发明提供了增加水性液体食品或水性液体固体混合物食品黏度的方法，该方法包括以下步骤：

(a)向食品中添加本文所述的稳定的液体组合物；和

(b)混合食品和组合物，以通过该组合物促进所述食品的黏度增加。

适当地，该方法还包括对食品和组合物施加低剪切混合的步骤，以通过该组合物促进所述食品的黏度增加。

本文通常使用的术语“低剪切混合”是指非湍流或最小湍流混合，例如温和混合或用勺子或诸如此类搅拌。应当理解，低剪切混合可以根据剪切速率来定义，并且通常是许多变量的函数，所述变量例如混合容器配置和混合装置速度。

应当认识到，低剪切混合的适当值足以促进物理除去所述基于多糖的成分，从其在一种或多种增稠剂上的抑制性相互作用位点除去，从而允许所述增稠剂发挥其增加相关液体或半液体食品黏度的预期效果。因此，在具体实施方案中，低剪切混合包括以约10rpm至约40rpm(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm或其中的任何范围)的速度搅拌。

适当地，将低剪切混合施加约60秒或更短时间，以实现食品黏度的最大或接近最大的增加。优选地，将低剪切混合施加约10秒至约40秒(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40秒或其中的任何范围)，以实现食品的最大黏度或接近最大黏度。

在某些实施方案中，将食品的黏度适当地增加至大于95cP。

关于上述方面，黏度增加的食品适合用于患有咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状的个体进食。优选地，咀嚼和/或吞咽疾病、障碍或病状是或包括吞咽困难。

还在另一方面，本发明提供了产生稳定的液体组合物的方法，包括以下步骤：

(i)提供上文所述的基于多糖的成分；

(ii)将一种或多种增稠剂添加到所述基于多糖的成分中；和

(iii)混合步骤(ii)的混合物，从而产生所述稳定的液体组合物。

适当地，稳定的液体组合物是上文所述的液体组合物。

本发明的稳定的液体组合物的制造可以包括以下步骤：例如在合适的液体载体例如水性载体中，加热基于多糖的成分和/或一种或多种增稠剂(如果存在)。然后可以将加热的组合物热填充包装，或在包装之前冷却。

本发明的方法可以包括制备基于多糖的成分的水溶液或悬浮液的步骤。就这一点而言，基于悬浮液的水溶液的总量，水溶液中基于多糖的成分的干质量含量可以为约0.1wt％至约60wt％。

同样地，本发明的方法可包括制备增稠剂的水溶液或悬浮液的步骤。就此而言，基于悬浮液的水溶液的总量，水溶液中增稠剂的干质量含量可以为约0.1至约60wt％。

当前方面的方法可以可选地包括将一种或多种赋形剂或添加剂添加到稳定的液体组合物中的步骤，例如颜料、风味剂、蛋白质(动物和植物)、膳食纤维、维生素和矿物质、保湿剂例如甘油和山梨糖醇、油脂、乳化剂、酸度调节剂、抗氧化剂、低卡路里膨胀剂、固化剂、增香剂、发泡剂、胶凝剂、防腐剂、螯合剂和稳定剂。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限制为任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员应当理解，根据本公开，可以对示例的具体实施方案进行各种修改和改变，而不脱离本发明的范围。

本文引用的所有计算机程序、算法、专利文献和科学文献均通过引用并入本文。

对本说明书中引用的出版物的任何引用都不是承认，这些公开在澳大利亚构成公知常识。

为了可以更容易地理解本发明并将其付诸实践，现在仅以举例的方式描述其一个或多个优选实施方案。

实施例1：制造基于多糖的成分的方法

本实施例的目的是，针对蛋白质含量和组成以及从基于多糖的成分去除的蛋白质级分，分析本发明的基于多糖的成分的实施方案。

方法

分析了图1详述的食品增稠组合物制造过程中各个阶段的八个样品。将每个样品的等分试样(15-20g)分别放入8个容器中，并运至梅西大学(Massey University)的营养实验室，以通过Dumas方法(凯氏定氮法的更新版本)(Leco,AOAC 968.06)测定总氮含量。

结果

质量平衡

表1总结了在图1中描述的过程中进入和离开系统的输入和输出的质量平衡。由于酸热水解，总共除去了43.9kg。

表1.食品增稠组合物制造过程中进入和离开系统的输入和输出的质量平衡

总氮分析

通过将分析获得的总氮(表2)乘以Jones转换因子6.25估算滞留物样品的蛋白质含量。(Jones,1931)。图2中显示了每个阶段滞留物蛋白质含量的减少百分比。样品中蛋白质含量的范围为0.0031g/g至0.0063g/g，其中样品4(第二收集提取物)含有的蛋白质含量最高，样品5(第二收集滞留物)含有的蛋白质含量最低。在酸和热水解的最初2小时步骤后，从基于多糖的成分(和/或其中间体)中提取了大部分蛋白质。去除大量蛋白质支持有利于食品增稠组合物的后续应用的技术。具体而言：稳定的水合黏度位点特异性抑制抑制了黄原胶溶液；并且如上所述，改变了电阻抗，有利于诊断应用。

表2.通过乘以分析获得的总氮粗估滞留物样品的蛋白质含量

参考文献

AOAC 968.06-1969,Protein(Crude)in animal feed(动物饲料中的蛋白质(粗)).Dumas method(Dumas法).

Jones,D.B.(1931).Factors for converting percentages of nitrogen infoods and fees into percentages of proteins(将食品和饲料中氮百分比转化为蛋白质百分比的因素).Circular No.183.US Department of Agriculture(美国农业部),Washington,DC.

实施例2：本发明增稠的诊断介质阻抗的评估

本实施例的目的是，评估添加本发明的具有基于多糖的成分的液体组合物的实施方案对诊断介质电阻抗的影响。从图3中可以看出，本研究在4种稠度(增稠、增稠至150水平、400水平和900水平)上比较了10mL的诊断食团介质，该稠度是用使用基于多糖的成分产生的各种浓度的液体组合物增稠的。受阻抗水平影响的参数(例如UES Opening(食道上***开放)；Bolus Presence Time(食团存在时间))在不同的稠度上非常稳定。

表3.根据语言病理学专业指南(Speech Pathology Profession Guidelines)，对于三种稠度水平，由所公开的发明增稠的液体的黏度目标范围，以毫帕斯卡秒(mPa.s)为单位

实施例3：从基于多糖的成分中提取的蛋白质的蛋白质分析数据

在本实施例中，利用SDS-PAGE和从凝胶中回收的条带的LC-MS分析，对在产生该成分的过程中采集的样品以及初始水胶体和最终产品的蛋白质/肽含量和谱图进行了分析。将获得的各个样品的结果与起始材料进行比较，以确定在加工过程中是否发生任何变化。

材料和方法

SDS-PAGE方案

从实施例1所述食品增稠产品的制造过程中的各个步骤中采集了八个样品。将每个样品的等分试样(约200mg)称入Eppendorf管中，并用水稀释至最终重量为1000mg。根据先前进行的总蛋白质测定，这应导致样品的蛋白质浓度在0.6-1mg/mL之间(见表1)。在进行SDS PAGE之前，将5μL样品与5μL LDS样品缓冲液、2μLβ-巯基乙醇和8μL水混合，最终体积为20μL。将这些溶液在70℃加热10分钟。将这些样品冷却后，将15μL各样品施加到预制NuPAGE凝胶的孔(NuPAGE,Bis-Tris,4-12％,1.0mm)中。电泳在室温下进行35分钟以上(起始电压：200V，起始电流：90mA)。该电源由Pharmacia biotech电泳电源组(EPS 600)提供。凝胶用考马斯蓝染色。添加了SeeBlue Plus2预染蛋白梯(Invitrogen)，作为分子量标准。

凝胶条带和溶液中肽的LC/MS分析

样品制备

将凝胶条带切成丁，并用乙腈：50mM碳酸氢铵(1:1)脱色，然后用乙腈脱水，然后浸入10mM二硫苏糖醇中。将两种溶液样品的5ul等分试样用45ul 50mM碳酸氢铵稀释，并添加DTT至终浓度10mM。将所有样品在56℃下加热15分钟。然后将凝胶条带上清液替换为50mM碘乙酰胺，同时将碘乙酰胺添加到溶液样品中，至最终浓度为50mM。将所有样品在黑暗中于室温孵育30分钟。将凝胶碎片用乙腈脱水、干燥并用12.5ng/μL测序级改性猪胰蛋白酶(Promega)再次溶胀，同时将1ug测序级改性猪胰蛋白酶添加到溶液样品中。将所有样品均在45℃的冷冻微波(CEM Discover)中使用15W功率消化60分钟。用1μL 50％甲酸酸化消化物。

将两种溶液的消化物脱盐并在10mg Oasis HLB SPE柱上纯化，用300ul 50％乙腈洗脱。将提取物在真空离心机中干燥至约20ul。将溶液提取物稀释20倍，并将凝胶条带消化物在0.1％的甲酸中稀释3倍，用于LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析

将每个稀释样品的2ul等分试样注入装有3um Reprosil C18介质(Dr Maisch)的0.3x10mm截留柱(trap column)上进行脱盐，然后在内部装有3um Reprosil C18介质的0.075x150mm PicoFrit柱(New Objective)上，使用30分钟0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸乙腈溶液的梯度以300nl/min分离。

将PicoFrit喷雾剂导入TripleTOF 6600四极杆飞行时间质谱仪(Sciex,Framingham,MA,USA)，从350-1600m/z扫描200ms，然后对35个最丰富的多电荷肽(m/z 100-1600)进行50ms MS/MS扫描，动态排阻时间为12秒。质谱仪和HPLC系统受Analyst TF 1.7软件包(Sciex)控制。使用ProteinPilot版本5.0(Sciex)，使用以下参数，在上述蛋白质序列数据库中检索来自每个库(pool)的所得数据：样品类型(Sample Type)，鉴别(Identification)；检索努力(Search Effort),完全(Thorough)；Cys烷基化(CysAlkylation),碘乙酰胺；消化,胰蛋白酶；ID聚焦(ID Focus),生物学修饰和氨基酸取代(每条肽序列，允许取代高达两个氨基酸)。对上面未匹配的七个高强度MS/MS谱进行了手动从头测序。使用PeakView 2.2(AB Sciex)创建了这些肽(+/-0.015Da)的提取离子色谱图。

图7-11总结了为从图4的SDS PAGE提取的条带生成的提取离子色谱图。

水胶体中蛋白质/肽谱的测定

使用SDS-PAGE测定蛋白质/肽谱

研究了来自该过程各个步骤的八个样品(请参见表4)。首先，通过测定样品1中的总氮含量并将该值乘以Jones转换因子(JF＝6.25)2来粗估样品的总蛋白质含量。表4中总结的结果表明，样品含有3.1-6.3mg蛋白质/g样品。

蛋白质含量是在梅西大学营养实验室(Massey University NutritionLaboratory)根据Dumas方法测定的总氮含量计算得出的。

表4：水胶体样品中的蛋白质含量

*根据图1概述的工艺步骤

在该过程中，与从相同过程阶段获取的截留物(例如,大量截留物2和第一提取物，请参阅表4)相比，含量较高的提取物的总蛋白质含量略有增加。

就此而言，我们强调了从最初未处理的水胶体到第一提取物和在向处理过程中添加树胶(例如黄原胶)之前蛋白质减少。我们进一步注意到，由于添加黄原胶，因此在处理过程中增加了蛋白质，第三和第四滞留物(即样品6和8)的蛋白质水平升高。

对于SDS PAGE分析，制备每个样品的约200mg/g的水溶液。基于先前进行的总蛋白质测定，这应导致蛋白质浓度介于0.6-1mg/mL样品之间。样品CI-TSC 4、6和7没有产生透明的溶液，但是形成了固体异质凝胶，使样品的移液和进一步加工具有挑战性。根据Laemmli对样品进行处理并进行SDS PAGE。所得的凝胶如图4所示。

在起始材料(泳道8道，TSC 8)中，可以看到前两个提取物(泳道1，TSC1和泳道2，TSC 2道)和大量滞留物2即20kDa处的强条带，以及40kDa和60kDa处的两条微弱条带。相反，对于大量滞留物3(泳道5，TSC 5)仅观察到非常微弱的染色，并且在第三提取物(泳道4，TSC4)、大量滞留物4(泳道6，TSC 6)和商业产品(泳道7，TSC 7)中未检测到蛋白质。就此而言，我们强调了在初始热处理和蛋白质提取步骤后，第三截留物中60kDa蛋白质的损失。假定去除该分子量较大的蛋白质级分积极地影响了本发明的基于多糖的成分的稳定性。

根据较早的结果，这些后面的样品含有0.44％至0.56％的蛋白质(参见表4)，并且应提供足够的蛋白质，以便在所用电泳条件下可在凝胶上检测到。但是，如上所述，这些样品与水混合时形成非常黏的凝胶。这使得样品的加工以及向凝胶的转移具有挑战性，并且可能导致未将足够的蛋白质加载到凝胶上。

蛋白质/肽的LC/MS分析

蛋白质/肽的LC/MS分析由新西兰奥克兰大学生物科学学院基因组和蛋白质组学中心(Centre for Genomics and Proteomics at the School of Biological Sciencesat the University of Auckland,New Zealand)进行。使用ProteinPilot在蛋白质序列数据库中检索每个库的生成的数据(请参见上面的材料和方法部分)。

为了进行分析，使用手术刀，将染色后在SDS PAGE凝胶上可见的条带(参见图4中的红色箭头)小心地切开，并分别置于标记的Eppendorf小瓶中。总体而言，如表5所示，采集了13个样品。

根据上面详细概述的标准方案，对样品进行处理和分析。将所得的肽与蛋白质序列数据库进行比较，使用样品中可能存在的物种的序列条目(entry)以及可能的污染物(例如人角蛋白)条目。

表5：从SDS PAGE凝胶提取的用于LC/MS分析的凝胶带

数据库检索产生了许多与人角蛋白、猪胰蛋白酶(用于处理样品)和某些植物衍生蛋白的匹配(表6)。然而，观察到不能自动鉴定出强度更高的肽(见表6)。甚至对包括其他植物的数据库(包含350万个条目)进行更广泛的检索都没有产生匹配。

表6：通过ProteinPilot鉴定的凝胶条带样品TSC2-3的蛋白质列表。

*未使用的得分是每种蛋白质独特肽证据的量度。β-半乳糖苷酶用于校准质谱仪。

对7种强度更高的肽进行手动测序，产生了表7中总结的建议的肽序列。这些序列用于检索所有植物物种的数据库。尽管产生了一些部分匹配，但没有明确表明所有这些肽的来源的具体植物蛋白质，这表明该蛋白质序列远不同于目前公众可用的任何蛋白质序列。

除此之外，上述处理过程导致了基于多糖的成分证明的新的蛋白质级分。此外，我们假定最终的滞留物中(以及从第三滞留物开始)去除原始的60kDa蛋白质级分导致产品稳定性得以提高，尤其是在分离方面。

表7：用于丰富的不匹配肽的建议的人工衍生的从头序列

*由于含糊不清I未完全测序，碎片离子谱的低质量部分

表8：通过ProteinPilot鉴定的凝胶带样品TSC8 OR的蛋白质列表

*未使用分数是每种蛋白质独特肽证据的量度。β-半乳糖苷酶用于校准质谱仪。

总体而言，在所有样品中，七条主要肽的相对丰度和这些肽的总体一致出现已证实，这些样品中存在的主要(未鉴定的)蛋白质将在所有13种制品中均发现，但是可观察到来自较低蛋白质分子量凝胶条带的一条肽的丰度显著降低，这与可能预期的亲本蛋白质的特定区域的丧失相一致(参见图7-11中的离子色谱图)。如上所述，我们假定，这种特定蛋白质级分的去除赋予了应用稳定性。

结论

在处理过程中采集的样品的LC/MS分析生成了含有七条主要肽的谱图。对已知植物蛋白数据库进行广泛检索未导致这些肽的匹配。

实施例4：Uzuhashi实施方案与本发明的稳定性比较

本实施例涉及美国专利6,455,090(以下称为“Uzuhashi”)的优选实施方案的具体实施方式(第4栏第26行)中描述的第二种方法，并将其与本发明提供的增稠剂和黏度抑制性多糖的酸化和防腐溶液的上述实施例1制剂进行比较。

Uzahashi描述了产生液体增稠剂的方法，该增稠剂在添加到液体中时会增稠，并且最初其形成黏性溶液或凝胶受到抑制。该发明人声称，该发明可以适当地添加到用于患有咀嚼和吞咽困难的患者的液体或半液体食品中。

微生物稳定性

表1.*发展微生物生长证据的时间(以周为单位)

Uzuhashi的实施方案 实施例1的实施方案

小于1 在25C时大于52

(在25C约2天)

首先通过微生物发酵的存在来检测微生物生长的发展*，微生物发酵可由产生的气体(例如，CO₂)的出现和溶液中“异味”的发展来证明。

物理稳定性

通过将增稠剂与黏度抑制性多糖分离，证明了各自制剂的物理稳定性。为此，从容器底部取20g液体增稠剂样品的黏度(在流动30秒后用Bostwick Consistometer测量)，并混入100ml水中(注意：Bostwick读数增加表明黏度降低(变稀))。

表2.随时间变化的物理稳定性

*稀薄流体的Bostwick Consistometer读数限度为24cms。

4周后，尽管Bostwick读数没有变化，Uzuhashi的实施方案仍继续产生更稀薄的黏度。8周后，Uzuhashi实施方案底部的分离层仅含有透明的黏度抑制性多糖层，并且没有增稠剂，而实施例1的制剂在物理上保持稳定超过52周。

因此，Uzahashi公开的发明受到限制，因为其中描述的增稠剂既未表现出微生物稳定性，也未表现出物理稳定性。因此，Uzahashi的液体增稠剂在管理吞咽障碍(吞咽困难)从而预防或限制这种疾状的常见合并症方面没有实际用途。缺乏实用性有两个方面。首先，缺乏物理稳定性和由此导致的溶剂与胶凝剂的分离抑制了Uzahashi液体增稠剂的准确计量。除了上述之外，与实施例1的液体增稠剂相比，Uzahashi的液体增稠剂还表现出出始终一致地且均匀地增稠液体或液体-固体食品的能力降低。

鉴于上述情况，Uzahashi公开的发明就所得增稠食品的预定黏度而言不能始终保证满足所需水平。其次，诸如本文所述的患者通常是易感人群。因此，它们受诸如NSW FoodAuthority-Guidelines for food service to vulnerable persons(NSW食品管理局-向易感人群提供食物服务的准则)等法律文书的约束。Uzahashi的液体增稠剂组合物在微生物学上不是稳定的，因此不能如所述在临床上施用于适应人群。