一种基于半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种基于半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶的制备方法及其应用 (Preparation method and application of nano-enzyme based on cysteine-histidine dipeptide and copper ion compound ) 是由 齐崴 黄仁亮 王晶辉 苏荣欣 于 2019-05-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶(CH-Cu)的方法,包括：1)称取半胱氨酸-组氨酸二肽粉末20-120mg,溶解于0.5-6mL去离子水中,室温下超声10-60min；2)称取可溶性铜盐10-120mg,溶解于0.5-5mL去离子水中,室温下超声10-60min；3)将步骤1)得到的半胱氨酸-组氨酸二肽溶液与步骤2)得到的铜盐溶液与2-8mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合,超声10-60min；4)将步骤3)得到的混合溶液转移至耐压管或水热釜中,在80-140℃下反应2-8h,之后离心收集,用N,N-二甲基甲酰胺和去离子水分别清洗三次,得到粒径为30～200nm的半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶颗粒。本发明还公开了所制得的纳米酶在降解2,4-二氯苯酚、对苯二酚和肾上腺素方面的应用。(The invention discloses a method for preparing cysteine-histidine dipeptide and copper ion coordination complex nano enzyme (CH-Cu), which comprises the following steps: 1) weighing 20-120mg of cysteine-histidine dipeptide powder, dissolving in 0.5-6mL of deionized water, and performing ultrasonic treatment at room temperature for 10-60 min; 2) weighing 10-120mg of soluble copper salt, dissolving in 0.5-5mL of deionized water, and performing ultrasonic treatment at room temperature for 10-60 min; 3) mixing the cysteine-histidine dipeptide solution obtained in the step 1) and the copper salt solution obtained in the step 2) with 2-8mL of N, N-Dimethylformamide (DMF), and performing ultrasonic treatment for 10-60 min; 4) transferring the mixed solution obtained in the step 3) into a pressure-resistant pipe or a hydrothermal kettle, reacting for 2-8h at 80-140 ℃, then centrifugally collecting, and respectively washing with N, N-dimethylformamide and deionized water for three times to obtain the cysteine-histidine dipeptide and copper ion coordination complex nano-enzyme particles with the particle size of 30-200 nm. The invention also discloses application of the prepared nano enzyme in degrading 2, 4-dichlorophenol, hydroquinone and adrenalin.)
技术领域
本发明涉及纳米酶生物材料领域，特别是涉及一种基于半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶的制备方法及其应用。
背景技术
酚类物质在木材防腐、杀虫剂、消毒剂等领域的广泛应用使其成为普遍的环境污染物。酚类物质作为一种激素干扰物，具有致癌性和生殖、神经毒性等，严重威胁着人类的健康。
漆酶是一种以氧气为氧化剂氧化多种酚类或胺类有机物的多铜氧化酶，可以有效去除酚类污染物。由于该反应的最终产物为水，所以漆酶经常作为一种绿色催化剂用于水处理或土壤的生物修复等领域。然而，漆酶在复杂环境下的低稳定性和低重复利用性都限制了漆酶的实际应用。为了增强漆酶的催化稳定性和重复利用性，酶固定化技术被广泛地应用。尽管酶固定化技术的发展提高了酶的重复利用性，但是由于酶分子结构在复杂催化体系下的可变性，酶固定化技术并未从根本上解决酶催化稳定性较差的缺点。
纳米酶是一类具有酶催化活性的纳米材料，由于其具有低成本、高稳定性等优点而得到了广泛的研究。目前纳米酶主要基于贵金属、金属氧化物和碳等纳米材料，并被广泛应用于病毒检测、有机磷毒剂降解、杀菌等领域。相比于天然酶，由于纳米酶本身是一种纳米材料，在催化过程中具有更好的稳定性和耐久性。
为了得到高稳定性的生物催化剂，通过以金属离子与有机配体的配位作用形成的有机-无机复合物构建纳米酶具有合成方法灵活，尺度可控，生物相容性高等优点。但是由于漆酶催化中心的结构复杂性，具备漆酶活性的纳米酶鲜有报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)的制备方法，所制备的纳米酶具备高催化活性、重复利用性和催化稳定性。
本发明的另一目的是提供上述半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)在酚类污染物的降解去除方面的应用，能更好地降解氯酚和对苯二酚且便于检测。
为此，本发明的技术方案如下：
一种半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶(CH-Cu)的制备方法，通过水热合成方法制得有机-无机复合纳米颗粒，包括以下步骤：
1)称取半胱氨酸-组氨酸二肽粉末20-120mg，溶解于0.5-6mL去离子水中，室温下超声10-60min；
2)称取可溶性铜盐10-120mg，溶解于0.5-5mL去离子水中，室温下超声10-60min；
3)将步骤1)得到的半胱氨酸-组氨酸二肽溶液与步骤2)得到的铜盐溶液与2-8mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，超声10-60min；
4)将步骤3)得到的混合溶液转移至耐压管或水热釜中，在80-140℃下反应2-8h，之后离心收集，用N,N-二甲基甲酰胺和去离子水分别清洗三次，得到粒径为30～200nm的半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶颗粒。
其中，所述可溶性铜盐为氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的一种或其中任意比例的两种或三种。
上述步骤1)中，半胱氨酸-组氨酸二肽粉末的质量为62mg，溶解于2mL去离子水中。
上述步骤2)中，可溶性铜盐的质量为41mg，溶解于1mL去离子水中。
上述步骤3)中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为4mL。
上述步骤4)中的反应温度为140℃，反应时间为4.5h。
本发明还提供一种上述方法制备的半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物(CH-Cu)在酚类污染物的降解去除的应用，其中所述的酚类污染物为2,4-二氯苯酚和对苯二酚。
本发明还提供一种上述方法制备的半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物(CH-Cu)在肾上腺素的降解去除方面的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备的半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶(CH-Cu)与以往的纳米酶相比，所用材料天然无毒、绿色环保，制备工艺安全且条件温和。
(2)本发明制得的纳米酶(CH-Cu)具备高催化活性和重复利用性，在极端pH、高温、长时间储存和高盐分等条件下均体现出优秀的催化稳定性。
(3)相较于漆酶，本发明制备的纳米酶(CH-Cu)体现出更高的降解氯酚和对苯二酚的能力。
(4)相较于漆酶，本发明制备的纳米酶(CH-Cu)对于酚类物质(肾上腺素)的检测具备更低的检出限，可以更加精确地测定酚类物质(肾上腺素)的浓度。
附图说明
图1是实施例1制备的纳米酶(CH-Cu)的扫描电镜照片；
图2是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)在不同pH条件下的催化活性；
图3a是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)在不同pH下的催化稳定性数据；
图3b是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)在不同温度下的催化稳定性数据；
图3c是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)在不同储存时间下的催化稳定性数据；
图3d是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)在不同NaCl浓度下的催化稳定性数据；
图3e是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)在不同乙醇浓度条件下的催化稳定性数据；
图3f是实施例3制备的纳米酶(CH-Cu)的重复利用性数据；
图4是纳米酶(CH-Cu)智能手机便携式检测肾上腺素标准曲线及标准比色卡。
具体实施方式
实施例1
一种制备半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)的方法，包括以下步骤：
1)首先称取半胱氨酸-组氨酸二肽粉末20mg，溶解于0.5mL去离子水中，室温下超声30min。
2)称取可溶性铜盐10mg，溶解于0.5mL去离子水中，室温下超声30min。
3)将步骤1)得到的半胱氨酸-组氨酸二肽溶液与步骤2)得到的铜盐溶液与2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，超声15min。
4)将步骤3)得到的混合溶液转移至水热釜中80℃下反应2h。离心收集，分别用N,N-二甲基甲酰胺和去离子水洗三次，得到半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)。
称取2,4-二氯苯酚1mg溶于1mL水中得到2,4-二氯苯酚溶液。称取4-氨基安替比林1mg溶于1mL水中得到4-氨基安替比林溶液。取100μL上述2,4-二氯苯酚溶液和100μL上述4-氨基安替比林溶液与700μL 2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(30mM,pH＝6.8)混合，得到混合液。随后将CH-Cu的水分散液(1mg/mL,100μL)加入到上述混合液中，在25℃下反应1h。反应混合液离心(12000rpm,3min)后取上清液在510nm下检测吸光度，从而确定漆酶活性，计算出CH-Cu纳米酶的漆酶活性为0.009U/mg，说明本实施例制得的纳米酶的活性与漆酶相近。
实施例2
一种制备半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶(CH-Cu)的方法，包括以下步骤：
1)称取半胱氨酸-组氨酸二肽粉末120mg，溶解于6mL去离子水中，室温下超声30min。
2)称取可溶性铜盐120mg，溶解于5mL去离子水中，室温下超声30min。
3)将步骤1)得到的半胱氨酸-组氨酸二肽溶液与步骤2)得到的铜盐溶液与8mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，超声15min。
4)将步骤3)得到的混合溶液转移至耐压管中，在140℃下反应8h。离心收集，分别用N,N-二甲基甲酰胺和去离子水洗三次，得到半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)。
称取2,4-二氯苯酚1mg溶于1mL水中得到2,4-二氯苯酚溶液。将2,4-二氯苯酚溶液和MES缓冲溶液(30mM,pH＝6.8)混合，得到混合液。随后将CH-Cu水分散液(1mg/mL)加入到上述混合液中，通入氧气，在25℃下反应12h。离心后反应液用高效液相色谱(HPLC)分析检测，2,4-二氯苯酚降解率达到91.4％，而相同条件下，漆酶对2,4-二氯苯酚的降解率为68％，说明本实施例制得的纳米酶对2,4-二氯苯酚具有很好的降解效果。
实施例3
一种制备半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶(CH-Cu)的方法，包括以下步骤：
1)称取半胱氨酸-组氨酸二肽粉末70mg，溶解于3.2mL去离子水中，室温下超声30min。
2)称取可溶性铜盐65mg，溶解于2.7mL去离子水中，室温下超声30min。
3)将步骤1)得到的半胱氨酸-组氨酸二肽溶液与步骤2)得到的铜盐溶液与5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，超声15min。
4)将步骤3)得到的混合溶液转移至耐压管中，在110℃下反应5h。离心收集，分别用N,N-二甲基甲酰胺和去离子水洗三次，得到半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)。
本实施例制备的CH-Cu纳米酶的微观形貌如图1所示，为粒径在50-150nm的纳米颗粒。按照实例1、2、4中所述条件合成出的CH-Cu纳米酶与本实施例制得的CH-Cu纳米酶无明显形貌上的区别。
本实施例制备的CH-Cu纳米酶在不同pH下的反应活性如图2所示，表明CH-Cu纳米酶在pH＝6.8的条件下具备最佳的催化活性，所以，我们在pH＝6.8的最适条件下考察CH-Cu纳米酶降解2,4-二氯苯酚和对苯二酚的活性。
本实施例制备的CH-Cu纳米酶与漆酶在不同条件下的催化稳定性如图3a-f所示。
如图3a所示，CH-Cu在不同pH＝3-9条件下保存1h后，仍能体现较好的催化稳定性，而漆酶在极端pH条件下(pH＝3或pH＝9)保存1h后，催化活性有明显的降低，表明CH-Cu纳米酶具备良好的酸碱稳定性。
如图3b所示，CH-Cu纳米酶在30-90℃条件下保存45min后，催化活性没有明显降低，而漆酶在80-90℃条件下保存45min后，活性明显降低，表明CH-Cu纳米酶具备良好的温度稳定性。
如图3c所示CH-Cu纳米酶在水中储存长达12天后，活性为最初的74％，而漆酶在水中保存12天后基本丧失活性，表明CH-Cu纳米酶具备良好的储存稳定性。
如图3d所示，CH-Cu纳米酶在高浓度氯化钠存在下，活性没有降低，相反由于盐溶液对于底物的盐析作用，催化活性有明显的提升，而漆酶在高浓度氯化钠存在下，由于盐溶液对于蛋白质的盐析作用，催化活性大大降低，表明CH-Cu纳米酶具备优秀的离子强度稳定性。
如图3e所示，CH-Cu纳米酶与漆酶的催化活性随着乙醇含量的提升，活性均逐步下降，CH-Cu纳米酶相比漆酶，体现出更高的催化活性，说明CH-Cu纳米酶具备更好的有机溶剂稳定性。
如图3f所示，CH-Cu纳米酶在重复利用12次之后，还能具备82％的催化活性，而漆酶由于会溶解于水中，故不具备重复利用性。
综上所述，CH-Cu纳米酶相比漆酶具备良好的催化稳定性。
称取对苯二酚1mg溶于1mL水中得到对苯二酚溶液。将对苯二酚水溶液和MES缓冲溶液混合(30mM,pH＝6.8)。随后CH-Cu水分散液(1mg/mL)加入到上述混合液中，通入氧气在25℃下反应12h。反应混合液离心后(12000rpm,3min)上清液用高效液相色谱(HPLC)分析检测，对苯二酚降解率达到95.7％，而漆酶在相同活性下对苯二酚的降解率为74.9％，说明本实施例制得的纳米酶较漆酶对对苯二酚具有更好的降解效果。
实施例4
一种制备半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子配位复合物纳米酶(CH-Cu)的方法，包括以下步骤：
1)称取半胱氨酸-组氨酸二肽粉末100mg，溶解于5mL去离子水中，室温下超声30min。
2)称取可溶性铜盐90mg，溶解于4mL去离子水中，室温下超声30min。
3)将步骤1)得到的半胱氨酸-组氨酸二肽溶液与步骤2)得到的铜盐溶液与6.5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，超声15min。
4)将步骤3)得到的混合溶液转移至耐压管或水热釜中120℃下反应7h。离心收集，分别用N,N-二甲基甲酰胺和去离子水洗三次，得到半胱氨酸-组氨酸二肽与铜离子复合物纳米酶(CH-Cu)。
称取肾上腺素1mg溶于1mL水中得到肾上腺素水溶液。将肾上腺素水溶液和MES缓冲溶液(30mM,pH＝6.8)混合。随后将CH-Cu的水分散液(1mg/mL)加入到上述混合液中，在25℃下反应12h。通过分析检测，测得本实施例制得的CH-Cu纳米酶对于肾上腺素的降解率为89.3％，相同条件下漆酶对于肾上腺素的降解率为89.3％为47.1％，说明本发明制得的纳米酶对肾上腺素具有更好的降解性。
应用例
将不同浓度的肾上腺素(5,10,20,30,40,50μg/mL)分别与0.1mg/mL CH-Cu分散液、2-(N-吗啉)乙磺酸单水合物缓冲溶液(MES,30mM,pH＝6.8)混合，在室温下反应1h。随后用智能手机拍摄反应液的照片。采用手机APP(Color Picker Deluxe)来识别反应液照片中颜色的饱和度数值，将得到的平均饱和度数值带入到图4建立的标准曲线中，可以求得样品中含有的肾上腺素浓度，从而实现肾上腺素的快速便携检测。
虽然实施例1-4中在MES缓冲溶液(30mM,pH＝6.8)进行降解反应，在实际应用中，可以直接在水中进行降解反应，两种反应条件下，降解反应的效果基本相同。
本发明的制备方法以半胱氨酸-组氨酸二肽为有机配体，铜离子为无机节点制备有机-无机复合纳米材料，获取了具备高催化活性和重复利用性的纳米酶。该纳米酶可以绿色、高效地去除环境中的酚类污染物，并可用于裸眼检测水体中肾上腺素的浓度。发明中优化并确定了(CH-Cu)最佳合成条件，及催化最适条件，而且考察了纳米酶(CH-Cu)在极端pH，高温，长时间储存，高盐分等条件下的催化稳定性。本发明制备的纳米漆酶相较于天然漆酶在极端条件下具有更高的催化活性和催化稳定性，所使用的原料绿色，制备工艺条件温和，可应用于酚类污染物催化降解和肾上腺素的裸眼检测。