一种非转基因棉花育种方法
阅读说明：本技术 一种非转基因棉花育种方法 (Non-transgenic cotton breeding method ) 是由 刘艳珍 单莹 沈丹 李瑞春 王子胜 汪岐禹 于 2021-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于棉花育种技术领域,具体涉及一种非转基因棉花育种方法。将筛选获得本地非转基因棉花品种作为母本,外引的非转基因棉花品种作为父本,于非转基因棉花育种试验田进行杂交,得到F-(0)代杂交铃；将F-(0)代杂交铃在非转基因棉花育种试验田连续自交2次,而后选择F-(2)代单株在非转基因棉花育种试验田自交获得F-(3)代株行,再将F-(3)代株行于非转基因棉花育种试验田自交获得F-(4)代株系,利用其鉴定筛选后获得非转基因棉花的株系。本发明育种方法,单独建立了非转基因棉花育种试验田,并与转基因棉花试验田之间有100-200m的隔离带,从空间上保证了非转基因棉花种植的纯度。(The invention belongs to the technical field of cotton breeding, and particularly relates to a non-transgenic cotton breeding method. Crossing the local non-transgenic cotton variety obtained by screening as female parent and the externally introduced non-transgenic cotton variety as male parent in a non-transgenic cotton breeding test field to obtain F 0 Generation hybrid bells; f is to be 0 The generation hybrid bolls are continuously selfed for 2 times in a non-transgenic cotton breeding test field, and then F is selected 2 Inbreeding generation individual plant in non-transgenic cotton breeding test field to obtain F 3 Planting and transplanting F 3 The generation plants are planted in a non-transgenic cotton breeding test field for selfing to obtain F 4 And (4) generating strains, and obtaining the strains of the non-transgenic cotton after identification and screening by using the generation strains. The breeding method of the invention separately establishes the non-transgenic cotton breeding test field, and has a 100-200m isolation zone with the transgenic cotton test field, thereby ensuring the purity of the non-transgenic cotton in space.)
技术领域
本发明属于棉花育种
技术领域
，具体涉及一种非转基因棉花育种方法。背景技术
棉花是我国的主要经济作物。我国的棉花单产和总产均居世界第一位。近年我国棉花面积在5000万亩以上。新疆光热水土资源丰富，宜棉区域广阔，近年新疆棉花种植面积均在3000万亩以上，其单产、总产均居全国植棉省(自治区)之首。新疆也是我国最具发展潜力的优质棉主产区，其中北疆早熟植棉区约有棉田800万亩左右，是新疆重要植棉区之一，也是种植优质陆地棉得天独厚的生态区，该生态区生产的优质原棉占全国出口棉的80％以上，是我国和新疆最主要的出口棉基地。随着棉田连作年限延长，棉花枯黄萎病也迅速蔓延，已成为棉花继续高产、稳产的主要障碍。目前全疆80％以上的棉田受枯黄萎病危害。枯黄萎病已是制约新疆棉花生产发展的主要因素之一。新疆需要早熟、抗病、高产(衣分40％以上、叶片中等大小、株型适中)、优质的棉花新品种。根据辽棉品种早熟性好，抗病性突出的特点，在北疆乌苏、奎屯、沙湾、石河子、玛纳斯等生育期125天左右的区域，试验示范和推广早熟抗病高产优质辽棉品种具有广阔的前景。
目前，新疆是国家限定的非转基因棉花种植区，参加新疆自治区棉花品种区域试验的品种主要是非转基因棉花品种。但现阶段种植的非转基因棉花品种还存在抗病性较差、晚熟的缺陷，所以本申请培育抗病性好、早熟、丰产、优质的非转基因棉花品种方法具有重要的意义。
发明内容
为解决目前大部分棉花品种都是转基因抗虫棉品种，而难获得非转基因棉花新品种的问题，并且培育适宜北疆种植的非转基因棉花品种，本发明提供了一种非转基因棉花育种方法。
为实现上述目的，本发明提供的方法具体包括以下步骤：
一种非转基因棉花育种方法，将筛选获得本地非转基因棉花品种作为母本，外引的非转基因棉花品种作为父本，于非转基因棉花育种试验田进行杂交，得到F0代杂交铃；将F0代杂交铃在非转基因棉花育种试验田连续自交2次，而后选择F2代单株在非转基因棉花育种试验田自交获得F3代株行，再将F3代株行于非转基因棉花育种试验田自交获得F4代株系，利用其鉴定筛选后获得非转基因棉花的株系。
进一步的说，将F0代杂交铃在非转基因棉花育种试验田连续鉴定筛选4年，获得较稳定的符合育种目标(生育期≤125天、5米行长子棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)的F4代株系，将获得的F4代株系种子委托《农业农村部植物生态环境安全监督检验测试中心》进行检测，检测其为合格,即获得非转基因棉花的株系。
对检测合格(即非转基因)的F4株系下一年(F5代)进行品系比较试验，并进行枯黄萎病调查鉴定。选择优良的F5代品系(生育期≤125天、皮棉产量比新疆(辽宁)区域试验对照品种增产≥7％、枯萎病指≤10，黄萎病指≤20、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)下一年(F6代品系)进行异地多点品比试验，然后进入法定试验(即辽宁省棉花品种区域试验或新疆自治区棉花品种区域试验)，通过法定试验(辽宁省或新疆自治区棉花品种区域试验和生产试验)，并获得(辽宁省或新疆自治区农作物品种审定委员会)审定后，得到非转基因棉花新品种。
所述该品种技术指标：
(1)生育期指标：辽宁等特早熟棉区≤125天；
(2)纤维品质指标：Ⅰ型：纤维上半部平均长度≥31mm，断裂比强度≥32cN/tex，马克隆值3.7-4.2；Ⅱ型：纤维上半部平均长度≥29mm，断裂比强度≥30cN/tex，马克隆值3.5-5.0；Ⅲ型：纤维上半部平均长度≥27mm，断裂比强度≥28cN/tex，马克隆值3.5-5.5。
(3)产量指标：Ⅰ型：皮棉产量比新疆(辽宁)区域试验对照品种增产≥0.0％；Ⅱ型：皮棉产量比新疆(辽宁)区域试验对照品种增产≥7.0％；Ⅲ型：皮棉产量比新疆(辽宁)区域试验对照品种增产≥10.0％。衣分达到40％以上；霜前花率≥85％。
(4)抗病性指标：枯萎病指≤15，黄萎病指≤35。
所述母本和父本筛选为首先将非转基因的本地棉花品种和外引的棉花资源种子经转Bt基因试纸条进行非转基因检测，试纸条显示检测线的种子为含有转Bt基因的棉花种子，试纸条不显示检测线的种子为不含有转Bt基因的棉花种子，即非转基因棉花种子，作为杂交母本和父本。
所述筛选后母本和父本种子分别单独种植于非转基因棉花育种试验田，并在苗期(2-4片真叶)喷施硫酸卡那霉素水溶液，保留叶片变黄色的棉苗(即，非转基因棉苗)；拔出未变色(即绿色)的棉苗。保留的非转基因棉苗生长发育，开花结铃，秋天收获种子待用。
所述硫酸卡那霉素水溶液中含硫酸卡那霉素浓度3000mg/kg。
将在实验室检测后获得的非转基因棉花种子，将其种植在非转基因棉花育种试验田，并且在苗期反复经含硫酸卡那霉素的水溶液鉴定，而后保留子叶或真叶变黄的较大棉苗，拔出未变黄(即是绿色)的和变黄的较小棉苗，保留的较大的变黄棉苗生长发育，开花结铃，秋天收获的种子作为育种的亲本。
所述筛选后母本和父本杂交，是指在棉花盛花期(即7月19-24日)，选择晴朗天气，于当天下午2-4时，将母本的花苞剥去雄蕊，保留柱头(即雌蕊)；再于第二天上午9-11时，摘取父本的花朵，用父本花朵雄蕊的花粉涂抹在母本花朵的柱头上，授粉成功发育结成的棉铃即获得F0代杂交铃。
所述将F0代杂交铃在非转基因棉花育种试验田种植获得F1代自交组合，选择生育期≤125天、5米行长籽棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0的优良F1代组合；将优良的F1代组合下一年在非转基因棉花育种试验田种植，获得F2代自交组合，秋季选择优良的F2代单株(生育期≤125天、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)；第三年，将所选择的优良的F2代单株种植在非转基因棉花育种试验田，获得F3代株行，秋季选择优良的F3代株行(生育期≤125天、5米行长籽棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)；第四年，将所选择的F3代株行种植在非转基因棉花育种试验田，获得F4代株系(即多行F4代)，秋季选择优良的F4代株系(生育期≤125天、5米行长籽棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)。
所述本地棉花品种是辽棉18号、辽棉25号和辽棉16号三个品种；外引的棉花资源有新陆早10号、新陆早17号、新陆早61号、新陆早62号。
实验室筛选非转基因本地棉花品种和外引资源：首先将非转基因的本地棉花品种和外引的棉花资源种子在实验室用转Bt基因试纸条进行非转基因检测，试纸条显示检测线的种子为含有转Bt基因的棉花种子，试纸条不显示检测线的种子为不含有转Bt基因的棉花种子，即非转基因棉花种子。其中，转Bt基因试纸条为金标Bt-CryIAb/Ac试纸条(检测精度0.125％)，种子的稀释比例为1:20。
所述非转基因棉花育种试验田：建立单独的非转基因棉花育种试验田，与转基因棉花试验田设置100-200m的隔离带。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明育种方法，首先利用0.125％检测精度的转Bt基因试纸条检测非转基因棉花种子，从第一步就达到了严格筛选的目的。本步骤凸显了本申请具有意想不到的效果。
2、本发明育种方法，单独建立了非转基因棉花育种试验田，并与转基因棉花试验田之间有100-200m的隔离带(本单位的隔离带还有树木与房屋)，从空间上保证了非转基因棉花种植的纯度。本步骤也凸显了本发明的创新点，因为在棉花育种上，一般是单独建立转基因棉花育种试验田。
3、本发明育种方法，在苗期利用硫酸卡那霉素对亲本及4代杂交后代进行连续鉴定，进一步保证了非转基因棉花品种的纯度。本步骤也具有创新性，因为苗期利用硫酸卡那霉素鉴定，主要是鉴定转基因棉花的方法。
4、本发明育种方法，亲本材料和杂交后代苗头品系都委托国家权威机构进行非转基因检测，从而全面保证了所选育的非转基因棉花品种的纯度。本步骤亲本材料委托国家权威机构进行非转基因检测也是具有独家创新性的，一般都是对苗头品系委托国家权威机构进行非转基因检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的非转基因棉花育种方法路线图。
图2为本发明实施例提供的实验室用转Bt基因试纸条检测非转基因棉花种子图片；其中，左检测杯中为转Bt基因棉花种子液，试纸条下面出现黑色检测线；右检测杯中为非转Bt基因棉花种子液，试纸条下面不出现黑色检测线。
图3为本发明实施例提供的非转基因棉苗喷施硫酸卡那霉素后，叶片变黄色图片。注：图中叶片变黄色棉苗为非转基因棉苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
辽棉18号：记载于“特早熟抗病优质棉花新品种—辽棉18号.刘艳珍，顾恒琴，胡玉枢等.中国棉花，2003，(10)：33-34”一文。
新陆早17号：记载于“新陆早17号的品种特性及栽培技术.郭江平，李雪源，谢迪佳等.新疆农业科技，2004年第06期11页”一文。
辽棉16号：记载于“棉花新品种—辽棉16号.王德生.中国农技推广，2000年05期”。
辽棉25号：记载于“特早熟抗病棉花新品种辽棉25号.王子胜，高艳平，王巍等.新农业，2012年(000卷)004期”。
新陆早10号：记载于“抗病特早熟棉花品种新陆早19号.郑之龙，欧阳本廉，袁家昌等.新疆农业科技，2003年(000卷)001期14页”。
新陆早61号：记载于“新陆早61号滴灌棉田不同时期土壤水分和养分变化研究.赵海，张雁，王刚等.棉花科学，2017年(039卷)003期”共4页。
新陆早62号：记载于“早熟陆地棉新品种新陆早62号选育及栽培技术.秦江鸿，杨永林，万英等.作物杂志，2014年1期”。
辽棉34：记载于：“特早熟高产优质棉花新品种辽棉34选育及栽培技术.刘艳珍，曹桂艳，单莹等.中国棉花，2017年第44卷第10期：22-23”一文。
本发明非转基因棉花育种方法(图1)，包括：
1、实验室筛选非转基因本地棉花品种和外引资源
利用金标Bt-CryIAb/Ac试纸条(检测精度0.125％)对非转基因本地棉花品种和外引棉花资源进行检测。用粉碎机将种子打成粉，种子用蒸馏水稀释比例为1:20(0.1ml/2ml)，将试纸条插入液体杯中，不出现检测线的棉花种子为非转基因种子。
2、单建非转基因棉花育种试验田
与转基因棉花试验田设置100-200m的隔离带，单独建立非转基因棉花育种试验田，从空间上保证了非转基因棉花育种的纯度。
3、苗期硫酸卡那霉素鉴定
在非转基因棉花育种试验田种植从试验室检测出的非转基因本地棉花品种和外引资源,在棉苗发出2-4片真叶期，选择高温晴朗天气，喷施硫酸卡那霉素溶液，浓度是3000mg/kg水，7-10天后调查。棉苗真叶及子叶变黄色的为非转基因棉苗；棉苗不变黄色(即仍是绿色)的为转Bt基因抗虫棉，须全部拔出。然后再将剩余的变黄色(非转基因)棉苗进行定苗(即每穴保留1棵大苗、壮苗)。
4、国家有资质中心检测
秋季，将收获的非转基因本地棉花品种和外引资源种子，委托《农业农村部植物生态环境安全监督检验测试中心》进行检测，进一步鉴定所收获的非转基因种子的可靠性。
5、杂交育种
将经过《农业农村部植物生态环境安全监督检验测试中心》检测合格的非转基因本地棉花品种和外引资源继续种植在非转基因棉花育种试验田，苗期继续重复做步骤3的硫酸卡那霉素鉴定。在盛花期，根据性状互补原则，以本地棉花品种作母本，以外引资源作父本，配制杂交组合，连续鉴定筛选4代，将筛选出的符合育种目标(生育期≤125天、5米行长子棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)的F4代株系种子委托《农业农村部植物生态环境安全监督检验测试中心》进行检测。对检测合格的株系下一年(F5代)进行品系比较试验，并进行枯黄萎病调查鉴定。选择优良的F5代品系(生育期≤125天、皮棉产量比新疆(辽宁)区域试验对照品种增产≥7％、枯萎病指≤10，黄萎病指≤20、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)，下一年(F6代品系)进行异地多点品比试验，选择综合性状优良的品系进入法定试验，得到非转基因棉花新品种。
实施例特早熟优质抗病高产棉花新品种辽棉34的选育
特早熟优质抗病高产棉花新品种辽棉34植株塔型，株高80.8cm左右，第一果枝着生部位5-6节，着生高度29.4cm左右。单株平均结铃10.2个，铃重6.4g，衣分41.2％。生育期124d左右。霜前花率95.0％。纤维主体长度30.1mm，整齐度指数83.7％，比强度31.3cN/tex，马克隆值4.6，伸长率6.3％。枯萎病指4.4，高抗枯萎病；黄萎病指19.4，抗黄萎病。
2014～2015年参加辽宁省棉花品种区域试验，11点次增产，1点次减产，增产点比率91.7％。两年平均籽棉、皮棉每公顷产量分别是4120.4kg和1687.8kg，比对照辽棉19号分别增产13.7％和14.1％；霜前花率95.0％；霜前皮棉每公顷产量1610.1kg，比对照增产14.7％；增产显著。2016年参加生产试验，平均籽棉、皮棉每公顷产量分别是2988.1kg和1211.0kg，比对照辽棉19号分别增产6.1％和6.1％；霜前花率96.2％；霜前皮棉每公顷产量1164.6kg，比对照增产5.7％，增产点比率80％。
该品种表现早熟、优质、高产、稳产、抗病、适合机械采收等特点。2017年通过辽宁省农作物品种审定委员会审定，命名为辽棉34(审定编号：辽审棉2017001)。
特早熟优质抗病高产棉花新品种辽棉34是按照如下步骤选育的：
1、2006年在实验室用金标Bt-CryIAb/Ac试纸条(检测精度0.125％)对非转基因本地棉花品种辽棉16号和新疆引进的棉花资源97-3155(即新陆早17号选系)进行检测。用粉碎机将种子打成粉，将种子用蒸馏水稀释比例为1:20，将试纸条插入液体杯中，辽棉16号和97-3155(即新陆早17号选系)种子没有出现检测线，为非转基因种子。
2、单建非转基因棉花育种试验田
与转基因棉花试验田设置100-200m的隔离带(本单位隔离带还有树木与房屋)，单独建立非转基因棉花育种试验田，辽棉16号和新陆早17号选系种子种植在非转基因棉花育种试验田。
3、苗期硫酸卡那霉素鉴定
在棉苗发出2-4片真叶期，选择高温晴朗天气，喷施硫酸卡那霉素水溶液，浓度是3000mg/kg，7-10天后调查。棉苗真叶及子叶变黄色的为非转基因棉苗；棉苗不变黄色(即仍是绿色)的为转Bt基因抗虫棉，须全部拔出。然后再将剩余的变黄色(非转基因)棉苗进行定苗(即每穴保留1棵大苗、壮苗)。保留的棉苗继续生长发育，开花结铃，秋季收获籽棉。
4、国家有资质中心检测
10月份，将收获的非转基因辽棉16号和新陆早17号选系籽棉轧花获得种子，再将这两个品种(系)的种子各500克委托《农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心》(即现在的《农业农村部植物生态环境安全监督检验测试中心》)进行检测，得到“未检测出转Bt基因”的检测报告。
5、杂交育种
2007年将经过《农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心》检测合格的非转基因辽棉16号和新陆早17号选系种子分别种植在非转基因棉花育种试验田，苗期继续重复做步骤3的硫酸卡那霉素鉴定。在盛花期(即7月19-24日)，以特早熟、抗病、丰产、耐低温的棉花品种辽棉16号为母本，以优质、高衣分新陆早17号选系为父本，配制杂交组合，即选择晴朗天气，于当天下午2-4时，将母本的花苞剥去雄蕊，保留柱头(即雌蕊)；再于第二天上午9-11时，摘取父本的花朵，用父本花朵雄蕊的花粉涂抹在母本花朵的柱头上。授粉成功发育结成的棉铃即获得F0代杂交铃。2008年，将F0代杂交铃种植在非转基因棉花育种试验田，获得F1代自交组合，选择生育期≤125天、5米行长籽棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0的优良F1代组合。2009年将所选择的优良F1代组合种植在非转基因棉花育种试验田，获得F2代自交组合，秋季选择优良的F2代单株(生育期≤125天、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)。2010年，将所选择的优良的F2代单株种植在非转基因棉花育种试验田，获得F3代株行，秋季选择优良的F3代株行(生育期≤125天、5米行长子棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)。2011年，将所选择的F3代株行种植在非转基因棉花育种试验田，获得F4代株系(即多行F4代)，秋季选择优良的F4代株系(生育期≤125天、5米行长子棉产量≥0.9kg、纤维上半部平均长度≥29.0mm，断裂比强度≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)。
将筛选出的符合育种目标(生育期≤125天、5米行长子棉产量≥0.9kg、绒长≥29.0mm，比强≥30.0cN/tex，马克隆值3.5-5.0)的F4代株系辽6245种子委托《农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心》进行检测，经检测，得到“未检测出转Bt基因”的检测报告。合格。
将上述获得的F4代辽6245株系种子2012-2013年(F5-F6代品系)进行品系比较试验及异地多点试验，并进行枯黄萎病调查鉴定。获得优良的F6代品系(生育期125天；皮棉产量比辽棉19号增产31.9％；枯萎病指2.3，黄萎病指18.1；纤维上半部平均长度30.1mm，断裂比强度31.3cN/tex，马克隆值4.6)。2014-2015年辽6245参加辽宁省棉花品种区域试验，11点次增产，1点次减产，增产点比率91.7％。两年平均籽棉、皮棉每公顷产量分别是4120.4kg和1687.8kg，比对照辽棉19号分别增产13.7％和14.1％；霜前花率95.0％；霜前皮棉每公顷产量1610.1kg，比对照增产14.7％；增产显著。2016年参辽宁省棉花品种生产试验，平均籽棉、皮棉每公顷产量分别是2988.1kg和1211.0kg，比对照辽棉19号分别增产6.1％和6.1％；霜前花率96.2％；霜前皮棉每公顷产量1164.6kg，比对照增产5.7％，增产点比率80％。
该品种表现早熟、优质、高产、稳产、抗病、适合机械采收等特点。2017年通过辽宁省农作物品种审定委员会审定，命名为辽棉34(审定编号：辽审棉2017001)。
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