一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法
阅读说明：本技术 一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法 (Preparation method of temperature-sensitive hydrogel drug-loaded microspheres based on PNIPAAm modified nanocellulose ) 是由 周益明 孟育 李特 夏新兴 李新平 张宇 戴磊 詹卫民 童树华 于 2021-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法,该方法包括(1)配制一定浓度的PCNCs悬浮液,所用溶剂为去离子水；(2)取悬浮液为溶剂配制SA溶液,搅拌形成混合液；(3)将混合液在室温下搅拌均匀脱气后,利用微量注射泵,采用机械滴制法以固定速率滴入CaCl-(2)溶液中,搅拌交联,用去离子水洗涤水凝胶表面残留CaCl-(2),然后烘干或冻干,得到PCNCs/SA水凝胶微球。采用本发明制备得到的复合水凝胶具有显著的温度敏感性,提高在人体温度37～(o)C的条件下的溶胀率,对药物的缓释作用更明显；同时,该缓释体系制备过程简单,试剂少,且生产过程温和,无剧烈反应,为新型温敏水凝胶载药微球的应用提供技术支持。(The invention relates to a preparation method of temperature-sensitive hydrogel drug-loaded microspheres based on PNIPAAm modified nanocellulose, which comprises the following steps of (1) preparing PCNCs suspension with a certain concentration, wherein the used solvent is deionized water; (2) taking the suspension as a solvent to prepare an SA solution, and stirring to form a mixed solution; (3) stirring the mixed solution at room temperature, degassing, and dripping CaCl at constant rate by mechanical dripping method using a micro-injection pump 2 Stirring for crosslinking in the solution, washing residual CaCl on the surface of the hydrogel by deionized water 2 Then drying or freeze-drying to obtainTo PCNCs/SA hydrogel microspheres. The composite hydrogel prepared by the method has obvious temperature sensitivity, and the temperature of the composite hydrogel is increased to 37 ℃ at the temperature of a human body o The swelling rate under the condition of C is more obvious in the slow release effect of the medicine; meanwhile, the preparation process of the slow release system is simple, the reagent is less, the production process is mild, no violent reaction exists, and the technical support is provided for the application of the novel temperature-sensitive hydrogel drug-loaded microspheres.)
技术领域
本发明属于温敏复合水凝胶
技术领域
，具体涉及一种PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法。背景技术
纳米微晶纤维素（CNCs）作为一种来源丰富且环境友好型的纳米材料，具有高结晶度、高杨氏模量、高强度和较低的热膨胀系数等特性。因其粒径小、比表面积大，理论上可以应用于绝大多数的高分子聚合物中，并显著改善聚合物的力学性能。此外，CNCs具有良好的生物相容性和生物可降解性等性能，预期在医药，食品，日化等领域将具有广泛的应用前景。
聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）是一种典型的温度敏感性高分子聚合材料，可以通过N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）上的不饱和碳碳双键发生开环聚合反应制备得到。PNIPAAm在32°C～34°C附近会发生分子构象改变而产生相转变行为，该温度被称为最低临界相转变温度（LCST）。
NIPAAm可以通过接枝共聚等方法与其它高分子材料复合得到功能性温敏水凝胶材料。PNIPAAm型温敏水凝胶具有智能温敏响应行为，随着环境温度的刺激变化，温敏聚合物链在舒展和缩紧状态之间转变，使整体凝胶网络发生收缩与溶胀的体积相转变，并伴随有溶胀性、力学性能和其他性能的变化。PNIPAAm型温敏水凝胶已广泛应用于药物控释、细胞支架、传感分析和物质分离等领域。
传统的PNIPAAm型温敏水凝胶主要采用自由基共聚法将单体NIPAAm接枝共聚到高分子聚合物基体表面。制备得到的温敏水凝胶在高于LCST的情况下，水凝胶中PNIPAAm聚合物分子链以疏水作用而相互聚集，并挤出其中的水分，表现为收缩状态。如果将该温敏型水凝胶应用于药物释放过程中，则会出现在人体温度37oC左右，即高于LCST情况下，凝胶结构收缩导致其中负载的药物无法得到释放的现象。这个致命缺陷大大限制了PNIPAAm型温敏水凝胶在适合于人体温度37oC情况下药物释放的应用，而需要寻求其他价格昂贵的原材料或更为复杂的化学或物理改性技术。
本发明改变温敏单体NIPAAm与水凝胶基体的结合机制，将单体NIPAAm接枝聚合到CNCs表面，将温敏聚合物借助CNCs以物理分散形式引入到水凝胶基体内，在赋予水凝胶以特殊温敏响应性能的同时，也增强了水凝胶原有的力学性能和稳定性，为PNIPAAm型温敏水凝胶材料的制备和研究提供了一个新的思路，对温敏水凝胶的研究与发展有着重大的意义。
发明内容
本发明的目的是克服当前水凝胶药物缓释载体不足，提供制备得到的复合水凝胶具有显著的温度敏感性，提高在人体温度37oC（>LCST）的条件下的溶胀率 ，对药物的缓释作用更明显的一种PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法。
本发明采取的技术方案是：一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）配制一定浓度的PCNCs悬浮液，所用溶剂为去离子水；
（2）取步骤（1）中的悬浮液为溶剂配制SA溶液，搅拌形成混合液；
（3）将步骤（2）混合液在室温下搅拌均匀脱气后，利用微量注射泵，采用机械滴制法以固定速率滴入CaCl2溶液中，搅拌交联30～80 min，用去离子水洗涤水凝胶表面残留CaCl2，然后在20～30oC烘干或在-50～70°C冻干，得到PCNCs/SA水凝胶微球。
所述的一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法，其特征在于PCNCs悬浮液浓度为0～1.0 wt%。
所述的一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法，其特征在于SA溶液和CaCl2溶液的浓度分别为4 wt%、0.2 wt%，SA溶液与CaCl2溶液的体积比为1:5。
所述的一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法，其特征在于在步骤（1）的PCNCs悬浮液中加入药物，其余步骤不变，制得载药水凝胶。
所述的一种基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶载药微球的制备方法，其特征在于药物为茶碱，PCNCs悬浮液中茶碱的浓度为0.5～1 .5mg/mL。
采用本发明，加入了PNIPAAm改性纳米纤维素后，制备得到的复合水凝胶具有显著的温度敏感性，提高在人体温度37oC的条件下的溶胀率，对药物的缓释作用更明显；在pH=2的模拟胃液中，该复合凝胶微球对药物缓释量提高了16.8%；在pH=7.4的模拟肠液中，药物缓释量提高了7.4%。同时，该缓释体系制备过程简单，试剂少，且生产过程温和，无剧烈反应，为新型温敏水凝胶载药微球的应用提供技术支持。
附图说明
图1为本发明载药水凝胶微球的制备流程图。
图2为PNIPAAm改性CNCs（PCNCs）的制备流程图。
图3为PCNCs悬浮液的TEM表征图。
图4为PCNCs悬浮液的流变性能图。
图5为PCNCs/SA水凝胶的外部形貌图，包括新鲜制备图和干燥后图。
图6为PCNCs/SA和CNCs/SA水凝胶的FTIR谱图。
图7为PCNCs/SA水凝胶的SEM全貌图。
图8为PCNCs/SA水凝胶的SEM截面图。
图9为PCNCs/SA水凝胶在去离子水中在不同温度下的溶胀率图。
图10为PCNCs/SA水凝胶载药微球在pH=2时的累积释药量图。
图11为PCNCs/SA水凝胶载药微球在pH=7.4时的累积释药量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表达的范围。本发明所采用的主要材料：海藻酸钠Sodium alginate（SA）采自阿拉丁试剂公司，所用水均为去离子水，其它试剂均为常规试剂。
一、基于PNIPAAm改性的纳米纤维素（PCNCs）的制备，它包括如下步骤。
1、取60 ml 1.2 wt% CNCs悬浮液，利用丙酮作为置换剂，采用溶剂置换法，将CNCs从水溶液置换到120 ml无水四氢呋喃溶液中，得到混合液A，无水四氢呋喃自制。
2、将1.87 g的三乙胺、2.26 g的2-二甲氨基吡啶和2.84 g的2-溴异丁酰溴先后加入到30 mL无水四氢呋喃中，室温下搅拌均匀，得到混合液B。
3、将混合液B置于恒压漏斗中，逐滴滴加至混合液A，搅拌上述混合液，在室温下在氮气氛围中反应24 h；随后用无水四氢呋喃，1:1体积比的无水四氢呋喃和无水乙醇混合液，丙酮先后洗涤上述混合液各2次，最后将沉淀物用去离子水离心洗涤3次，最终得到溴化CNCs悬浮液；（4）将0.6 wt%的溴化CNCs悬浮液加入到含有0.25 g溴化亚铜的甲醇溶液中，将三口烧瓶密封，经抽真空充氮气后，加入11.3 g的NIPAAm；采用冷冻-抽真空-解冻法，循环3次，去除溶液中残余氧气；随后加入0.173 g的N, N, N' ,N', N''-五甲基二乙基三胺，烧瓶保持密封状态，25oC磁力搅拌反应24 h；所得产物用去离子水多次离心洗涤，透析后得到PNIPAAm改性CNCs，即PCNCs。
二、 实施例一。
该基于PNIPAAm改性纳米纤维素的温敏水凝胶微球的制备，它包括如下步骤。
1、取0.1 g的PCNCs装于20 mL去离子水的烧杯中，超声分散至PCNCs完全分散，配成0.5 wt%的PCNCs悬浮液。
2、在该悬浮液中加入0.4 g的SA，室温下搅拌至溶解，配成2 wt% SA溶液。
3、将上述的混合液用真空泵脱气至无气泡后，采用机械滴制法，利用微量注射泵（雷弗 TYD-01），以固定速率1 mL/min滴入100 mL 0.2 wt%的CaCl2溶液中；滴加完毕后，室温下磁力搅拌交联60 min，随后将凝胶微球取出，用去离子水洗涤凝胶表面残留CaCl2，最后将凝胶微球置于-60°C的冻干机中冻干，得到冷冻干燥后含有25 wt% PCNCs（PCNCs:SA质量百分比）的PCNCs/SA复合水凝胶微球。
三、实施例二。
根据实施例一的制备方法，将实施例一中的PCNCs更换为未改性CNCs，制备冷冻干燥后含有25 wt% CNCs的CNCs/SA复合水凝胶微球。
四、实施例三。
该基于PNIPAAm改性纳米纤维素温敏水凝胶微球的制备，它包括如下步骤。
1、取0.1 g茶碱，用去离子水定容至100 mL，配制1 mg/mL的茶碱溶液。
2、移取20 mL茶碱溶液，加入0.1 g PCNCs，超声分散至PCNCs完全
分散，配成0.5 wt%的PCNCs悬浮液。
3、在该悬浮液中加入0.4 g的SA，室温下搅拌至溶解，配成2 wt% SA溶液。
4、将上述的混合液用真空泵脱气至无气泡后，采用机械滴制法，利用微量注射泵（雷弗 TYD-01），以固定速率1 mL/min滴入100 mL 0.2 wt%的CaCl2溶液中；滴加完毕后，室温下磁力搅拌交联60 min，随后将凝胶微球取出，用去离子水洗涤凝胶表面残留CaCl2最后将水凝胶置于25oC烘箱中烘干至恒重，得到负载茶碱的含有25 wt% PCNCs的PCNCs/SA复合水凝胶微球。
五、实施例四。
根据实施例三的制备方法，将PCNCs更换为未改性CNCs，制备烘干的负载茶碱的含有25 wt% CNCs的CNCs/SA复合水凝胶微球。
六、测试实验。
1、测试一。
用透射电镜对实施例一中自制的PCNCs形貌进行观察，取1~2滴0.01 w%的PCNCs滴加在铜网上并室温风干。随后滴加1~2滴0.2 wt%的醋酸铀对CNCs进行避光染色，彻底风干后观察。结果如图3所示，PCNCs保持原有的微晶棒状结构，接枝PNIPAAm支链后长度稍变长，直径增大。
2、测试二。
用旋转流变仪对实施例一中自制的PCNCs的流变行为进行测定，测试温度为25oC和37oC。结果如图4所示，PCNCs在37oC时的粘度远高于在25oC时的粘度，表明升温时PCNCs由亲水到疏水的转变。
3、测试三。
用红外光谱仪对实施例一和实施例二中PCNCs/SA、CNCs/SA复合凝胶微球进行分子结构测定，扫描波数为4000～500cm-1。结果如图6所示，两种凝胶的分子结构没有明显的差异，添加PCNCs的复合凝胶未出现新的特征峰，表明PCNCs与SA基体没有形成化学键结合，PCNCs只是物理分散于水凝胶中。
4、测试四。
用扫描电镜对实施例一中PCNCs/SA复合凝胶微球在不同温度下的外观和横截面形貌进行观察。将分别在25°C和37°C条件下溶胀平衡的凝胶微球迅速放入-196oC的液氮中冷冻，随后置于-60°C冷干机中冻干，横截面的观察需脆断。图7的外观图表明环境温度升高使凝胶微球外观呈现微膨胀。从图8的横截面图可以看出，随着温度升高，凝胶内部的孔径变大。说明制备的复合凝胶，在高于LCST条件下，温度响应表现为正溶胀状态。
5、测试五。
对实施例一的PCNCs/SA复合凝胶微球在不同温度下进行溶胀率测定。取一定量实施例一制备的烘干的水凝胶，放入100 mL去离子水中，分别在不同温度下（25°C和37°C）置于50 rpm的恒温振荡器中，待2 h溶胀平衡后取出凝胶微球，用滤纸拭去表面多余水分，称重后测定溶胀率。
结果如图9所示，PCNCs/SA复合凝胶在35oC-40oC范围内有明显的体积相转变点（LCST），高于LCST情况下，凝胶微球溶胀率提高。
6、测试六。
对实施例三和实施例四中的载药凝胶微球在pH=2情况下进行累计释药量曲线测定。取一定量烘干的载茶碱水凝胶微球放入100 mL模拟胃液（SGF）中，在37°C，50 rpm的恒温振荡器中进行试验，按设定时间取样1mL，同时补充1 mL原SGF溶液，取出的样品于270 nm波长下进行紫外检测。根据标准曲线计算茶碱含量，得到累积释放量曲线。
结果如图10所示，在pH=2时，强酸性环境使SA分子中羧基基团质子化，减弱分子间排斥力，使得凝胶结构收缩从而包覆药物分子，导致两种复合凝胶药物的释放量都低。但依旧可以看出，PCNCs/SA复合凝胶的药物释放量明显高于CNCs/SA，提高了16.8%。结果表明在37°C（≥LCST）时，制备的复合凝胶温敏表现为正溶胀状态，凝胶结构舒展促进负载药物的释放。
7、测试七。
对实施例三中和实施例四的载药凝胶微球在pH=7.4情况下进行累计释药量曲线测定。取一定量烘干的载茶碱水凝胶微球放入100 mL模拟肠液（SIF）中，在37°C，50 rpm的恒温振荡器中进行试验，按设定时间取样1mL，同时补充1mL原SIF溶液，取出的样品于270nm波长下进行紫外检测。根据标准曲线计算茶碱含量，得到累积释放量曲线。
结果如图11所示，在pH=7.4时，PCNCs/SA复合凝胶的药物释放量高于CNCs/SA，提高了7.4%。图9和10均表明制备的PCNCs/SA复合凝胶温度响应效应明显，在人体温度37oC环境中（≥LCST），制备的PCNCs/SA复合凝胶温敏表现为正溶胀状态，对药物茶碱分子有很好的缓释效果。
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