具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 缓慢释放细胞因子和抗体的可注射功能化微球的制备

图1为本发明可注射功能化微球构建原理图。

（1）多孔微球的制备

以混入 1% 光引发剂（PI）的浓度为7.5%的 GelMA 溶液作为分散相，肉豆蔻酸异丙酯作为连续相，通过微量注射推进泵分别以不同速度注入两相液体，在剪切力的作用下，分散相形成单个连续液体，不同速度差下形成的液滴尺寸不同，将收集的液滴经6.9 mWcm-2UV 交联 1min，经乙醇和ddH₂O 清洗后，冷冻干燥形成多孔 GelMA水凝胶微球。

（2）纳米粒子的制备

采用脱溶技术制备 BSA 纳米粒子，将 50.0 mg 的BSA 溶于 5 mL的ddH₂O 中，在磁力搅拌器持续搅拌作用下通过微量注射泵以2 mL/min速度泵入20 mL无水乙醇，随后持续搅拌过夜；利用微量注射泵以 2 mL/min的速度泵入 20 mL 壳聚糖溶液（1 mg/mL，1%乙酸溶液配置），紧接着以 0.5 mL 每min的速度泵入 5mL无水乙醇。搅拌10小时后，即可得到壳聚糖稳定的 BSA 纳米粒子； 利用高速离心机以 12000r/min的速度离心 20min收集，收集得到的纳米粒子用50 %的乙醇溶液清洗 2-3 遍；IL-7 和 IL-15 均以 20 ng/μL 的浓度放置-80 ℃冰箱保存，制备包载因子的纳米粒子时，在5 mL 10 mg/mL的BSA 溶液中各加100 μL。

（3）纳米粒子的接枝

配置MES buffer（3.904 g MES；5.209 g NaCl；200 mL H2O），取20 mg羧基修饰微球分散到MES buffer 中，连续加入80 mg EDC和120 mg NHS，超声15秒后放入37℃恒温摇床反应 15 min；取20 mg表面氨基修饰的纳米粒子分散在10 mL PBS溶液中；将反应后的微球快速离心弃上清，将含有纳米粒子的 PBS 加入微球的管内，快速超声30秒后过夜反应，之后离心洗涤即可得到纳米粒子微球复合物。

（4）抗体的接枝

配置多巴胺盐酸盐溶液（用10 mM 的Tris 缓冲液配置2 mg/mL的多巴胺盐酸盐溶液，PH=8.5）。将微球浸泡在多巴胺盐酸盐溶液中室温放置24h，然后用灭菌的ddH₂O 清洗 5次，将FITC 标记的αCD3 和αCD28 稀释50 倍，把微球放入抗体溶液中4℃反应24小时，即包被成功。

实施例2 微球体系相关材料的表征

（1）多孔微球的粒径分布

分析分散相/连续相为10/200 μL每分钟、10/100 μL每分钟和10/60 μL每分钟条件下形成的微球的粒径大小（图1A），可以观察到在不同速度差下形成的微球均是高度分散且具有同质性，伴随着速度差增大，形成的微球直径也明显变小。此外，通过ImageJ计算每组图片上各个微球的直径数值并绘制粒径分布图（图1B），分别统计100个微球直径，得到的平均直径依次为214.46854 μm、324.80079 μm和507.61048 μm。在保证其可注射性的前提下，尽可能选择表面积更大的微球方便携带因子以及细胞生存，因此后续实验选用直径在200 μm左右的微球进一步实验。

（2）多孔微球的孔径分布及强度

将得到的微球经无水乙醇和去离子水清洗后进行冷冻干燥，最终得到GelMA水凝胶多孔微球，为了观察它的表面形态，通过离子溅射仪对微球表面喷金处理，随后放置SEM下观察，可见微球表面孔隙分布均匀（图2A），多孔结构大大增加了微球的表面积，为纳米粒子的接载、抗体的包被以及细胞的生存提供了更多的空间，同样也对细胞间的营养代谢以及因子的扩散交流提供便利。经ImageJ统计微球表面孔径大小，绘制孔径分布图，统计了100个孔径数值，平均孔径为24.35569 μm（图2B）。经AFM分析获得微球的应力应变曲线（图2C），通过Hertz接触力学理论获得的弹性模量为9.76±2.04 kPa，表明水凝胶微球具有足够的硬度，可以承受注射过程中的剪切力或应用过程中的其他机械应力。

（3）BSA纳米粒子的表征

脱溶技术制备BSA纳米粒子，经50%乙醇清洗三遍后取一部分冷冻干燥处理，利用离子溅射仪对BSA纳米粒子喷金后放置SEM下进行观察（图3A），另一部分直接放置在铜网上烘干后通过TEM进行观察（图3B），结果显示纳米粒子呈分散状，尺寸均一。将BSA纳米粒子分撒于去离子水溶液中，利用LDS对其粒径进行检测，BSA纳米粒子的平均直径为190.1 nm（图3C）。

（4）BSA纳米粒子的释放曲线

为了探究BSA纳米粒子包载细胞因子后的释放曲线，选用IL-7为代表，收集包载200 ng的IL-7的BSA纳米粒子特定时间段的释放上清，利用Elisa试剂盒进行检测（图4），结果显示BSA纳米粒子包载的IL-7释放时间长达28天，达到了对IL-7的缓释作用。

（5）BSA纳米粒子成功接枝到微球表面

将活化羧基的微球与活化氨基的BSA纳米粒子反应过夜后冷冻干燥处理，得到的纳米粒子微球复合体经离子溅射仪喷金，然后通过SEM放大400倍和8000倍进行观察（图5）。结果可以发现BSA纳米粒子通过酰胺键成功的结合到微球表面。

（6）微球包被αCD3和αCD28

将FITC标记的αCD3在多巴胺作用下包被到微球表面，利用倒置荧光显微镜观察（图6A）。由此证明αCD3成功包被到微球表面，同样的，将FITC标记的αCD28在多巴胺作用下包被到微球表面，利用激光共聚焦显微镜（CLSM）观察（图6B），由此证明αCD28成功包被到微球表面。

实施例3激活内源性T细胞抗肿瘤效应的可注射功能化微球用于骨肉瘤治疗的研究

（1）实验动物

研究中所有雌性6周龄BALB/c小鼠购买于北京斯贝福生物技术有限公司（生产许可证编号：SCXK（京）2019-0010）。动物研究通过苏州大学实验动物伦理委员会审查（审查编号：202102A153）。实验中对动物处置和手术操作遵循科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》。

（2）实验方法

a. IL-7联合IL-15对CD3+T细胞增殖的影响

用无水二甲基亚砜配置CFSE至10 mM浓度储存，PBS洗涤分离得到的CD3⁺T细胞两次，减少血清存在会导致的影响；使用预热的PBS重悬，5×10⁶ cells/mL；添加等体积CFSE，至终浓度为5 μM；混匀后，避光室温孵育10分钟；加入4-5倍体积含血清培养基终止，1500转每分钟的速度离心5分钟；得到的细胞沉淀完全培养基洗三遍后重悬为1×10⁶ cells/mL，我们将得到的细胞悬液分为IL-2（10 ng/mL）和IL-7（10 ng/mL）+ IL-15（10 ng/mL）两组；1mL每孔种植在预先用αCD3（5 μg/mL）和αCD28（5 μg/mL）包被的24孔板中，每2天更换培养基。分别在48，72和96小时通过流式细胞仪检测增殖情况。

b. 骨肉瘤皮下荷瘤小鼠

动物实验遵循动物管理条例规定并得到苏州大学实验动物委员会的批准，从苏州大学实验动物中心购入5周龄的BALB/c雌性小鼠。正常饲养动物一周，用75 %酒精消毒液擦拭小鼠右侧腋下后，用1 mL注射器腋下皮下注射事先用无菌PBS溶液混匀的1×10⁷ cells/mL的K7M2细胞悬液100 μL，每天观察小鼠肿瘤生长情况。

c. 实验分组

当BALB/c骨肉瘤造模小鼠肿瘤体积达到40mm³左右时，随机进行实验分组，分为对照组（Control）12只（100 μL无菌PBS溶液）、空白微球治疗组12只、游离给药组（IL-7：1 mg/kg、IL-15：1 mg/kg、αCD3：5 mg/kg、αCD28：5 mg/kg）12只、可注射功能化微球组12只。自治疗开始后每隔3天称重，游标卡尺测量小鼠原位肿瘤的长（a）和宽（b），肿瘤体积的计算公式为：V=a×b³×0.52

d. 实验取材

当治疗21天时，随机选取每组6只实验小鼠，眼球取血后实施安乐死，取出肿瘤，淋巴结，脾脏，肾脏，肝脏，肺以及右腿。首先，肉眼观察肿瘤以及其他脏器是否有显著性差异，其次，游标卡尺测量肿瘤体积大小，接着，取淋巴结通过流式分析Ｔ细胞亚群的变化；肿瘤包埋后做组织形态学分析；肝脏、肾脏和肺部做H＆E染色观察生物安全性；右腿用来做Micro-CT扫描分析骨量变化。

（3）实验结果

a. IL-7联合IL-15相较于IL-2更能促进CD3⁺T细胞的增殖

通过CFSE法比较IL-2（10 ng/mL）与IL-7(10 ng/mL)+ IL-15(10 ng/mL)两种条件下CD3⁺T细胞的增殖情况。分别在48小时、72小时和96小时三个时间段收集细胞，流式细胞术检测结果表明，IL-7联合IL-15对CD3⁺T细胞的增殖效果更加明显（图7A）。并且定量结果显示两组细胞间增殖效果有差异（P＜0.05），IL-7联合IL-15相较于IL-2更能促进CD3⁺T细胞的增殖（图7B）。

b. 动物实验流程图

5周龄的BALB/c雌鼠作为本次体内实验的实验动物，动物适应性饲养7天后开始皮下荷瘤小鼠造模，每只老鼠在皮下注射100 μL K7M2细胞悬液（1×10⁷/mL）。大约28天时小鼠肿瘤体积基本达到40 mm³左右，随机进行动物实验分组，治疗21天后每组随机抽取一半（6只）实验小鼠取材进一步分析，对每组剩余小鼠二次给药继续观察，四周后统计生存曲线，安乐死处理剩余小鼠（图8）。

c. 可注射功能化微球作用原理图

当功能化微球注射到肿瘤局部后，微球体系表面的αCD3和αCD8抗体在靶向募集肿瘤浸润性T细胞，同时为它们的活化提供第一、第二信号，微球体系表面的BSA纳米粒子缓释IL-7和IL-15，促进肿瘤浸润性T细胞的增殖和分化，从而达到一个“局部训练”的效果。“训练”后的肿瘤浸润性T细胞发挥抗肿瘤的作用，通过释放颗粒酶B和IFN-γ来杀伤肿瘤细胞（图9）。

（4）可注射功能化微球对骨肉瘤小鼠生命体征的影响

a. 各组小鼠体重变化情况

将皮下荷瘤小鼠分为四组，分别是对照组（Control），每只肿瘤局部注射100 μL无菌PBS溶液；游离给药组（Free），每只肿瘤局部注射包含1 μg IL-7、1 μg IL-15，5 μg αCD3和5 μg αCD28的100 μL PBS溶液；MS组；每只肿瘤局部注射混匀500μg微球的100 μL PBS溶液；MS-np组，每只局部注射混匀500 μg可注射功能化微球（负载了1 μg IL-7和1 μg IL-15的BSA纳米粒子以及通过多巴胺作用包被的5 μg αCD3和5 μg αCD28）的100 μL PBS溶液。记录自给药第一天起至21天取材期间小鼠的体重变化情况（图10），可以看到，由于是皮下荷瘤小鼠的缘故，体重均有所下降，相比之下，Free组小鼠体重下降更为严重。

b. 各组小鼠肿瘤体积的变化

在皮下荷瘤小鼠体积达到40 mm³左右时随机进行实验分组，此时不同组之间小鼠原位肿瘤的大小并没有统计学差异，治疗后每隔3天记录实验小鼠的肿瘤体积（图11C）。可以看到，在第三天时不同组之间实验小鼠的肿瘤体积已经产生差异。治疗21天后取出每组实验小鼠的原位肿瘤，大体观如图11A所示，游离给药组（Free）与MS-np组的原位肿瘤体积显著小于对照组和MS组，MS-np组的原位肿瘤也明显小于游离给药组，由此可见可注射功能化微球对肿瘤的消退作用。对各组小鼠肿瘤体积定量分析结果显示MS-np组相较于其他组均有差异（图11B）。观察并记录各组实验小鼠的生存情况，绘制生存曲线（图11D）。

（5）可注射功能化微球对骨肉瘤小鼠淋巴结T细胞亚群的影响

a. 不同实验组淋巴结内CD8+T细胞/CD4+T细胞比例的变化

将各组小鼠淋巴结制备成单细胞悬液，加入CD3、CD4和CD8单克隆抗体进行流式抗体染色，通过流式细胞仪分析各组淋巴结内CD8⁺T细胞/CD4⁺T细胞的比例（图12A），相较于对照组（Control）、MS组和游离给药组（Free），MS-np组的CD8⁺T细胞/CD4⁺T细胞的比例明显增高，差异有统计学意义（图12B）。由此可见可注射功能化微球能够很好的维持T细胞的扩增，尤其是增加了CD8⁺T细胞的比例，对外周淋巴器官也能产生影响。

b. 不同实验组淋巴结内CD4+CD69+T细胞比例的变化

将各组小鼠淋巴结制备成单细胞悬液，加入CD4和CD69单克隆抗体进行流式抗体染色，通过流式细胞仪分析各个实验组淋巴结内CD4⁺CD69⁺细胞比例（图13A），相较于对照组（Control）和MS组，游离给药组（Free）和MS-np组的CD4⁺CD69⁺细胞比例都显著增加，说明IL-7和IL-15的联合作用下，促进了淋巴结内CD4⁺T细胞的成熟，MS-np组的CD4⁺CD69⁺T细胞的比例又明显高于游离给药组，说明可注射功能化微球通过缓释达到IL-7和IL-15的长久发挥作用。图13B是定量结果，差异有统计学意义。

c. 不同实验组淋巴结内Treg细胞比例的变化

将各组小鼠淋巴结制备成单细胞悬液，加入CD4、CD25和Foxp3单克隆抗体进行流式抗体染色，通过流式细胞仪分析各组淋巴结内Treg细胞的比例（图14A），结果表明四个组淋巴结的Treg细胞表达相差不大，差异无统计学意义（14B），正如文献报道所说，IL-7和IL-15没有抑制Treg细胞比例的现象，但他们会够抑制甚至废除Treg细胞的免疫抑制功能，恢复CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的抗肿瘤功能，从另一方面在肿瘤治疗上发挥作用。

d. 不同实验组淋巴结内记忆性T细胞比例的变化

将各组小鼠淋巴结制备成单细胞悬液，加入CD4、CD8、CD44和CD62L单克隆抗体进行流式抗体染色，通过流式细胞仪分析各组淋巴结内CD44⁺CD62L⁺细胞的比例（图15A），相较于对照组（Control）、MS组和游离给药组（Free），MS-np组的CD44⁺CD62L⁺比例显著增加，说明在可注射功能化微球的作用下，促进了淋巴结内记忆性T细胞的表达，增加了机体抗肿瘤的能力。图15B是定量结果，差异有统计学意义。

（6）肿瘤局部组织形态学分析及荧光染色

a. 肿瘤组织局部H&E染色

如图16所示，分别为对照组（Control），MS组，游离给药组（Free）和MS-np组在治疗21d后肿瘤局部的H&E染色结果，在游离给药组和MS-np组都能见到明显的斑片状坏死区域，此外，在MS-np组肿瘤局部，可见微球附近有细胞聚集。体现了可注射功能化微球良好的治疗效果。

b. 肿瘤局部组织荧光染色

为了评估肿瘤局部肿瘤浸润性T细胞的浸润情况以及肿瘤局部细胞凋亡和增殖的趋势，我们对冰冻切片得到的肿瘤组织切片分别进行了CD8和CD4的免疫荧光检测以及TUNEL染色和Ki67染色。

CD8⁺T细胞浸润情况分析:

图17A所示是四组肿瘤组织CD8抗体免疫荧光染色的结果，相较于对照组（Control）和MS组，游离给药组（Free）和MS-np组有更多的CD8⁺T细胞浸润，其中MS-np组的CD8⁺T细胞浸润数量明显高于游离给药组，由此可见可注射功能化微球能够有效增加肿瘤局部CD8⁺T细胞的浸润。图17B是定量结果，差异有统计学意义。

CD4⁺T细胞浸润情况分析:

图18A所示是四组肿瘤组织CD4抗体免疫荧光染色的结果，相较于对照（Control）和MS组，游离给药组（Free）和MS-np组有更多的CD4⁺T细胞浸润，其中MS-np组的CD4⁺T细胞浸润数量明显高于游离给药组，由此可见可注射功能化微球能够有效增加肿瘤局部CD4⁺T细胞的浸润。图18B是定量结果，差异有统计学意义。

c. TUNEL凋亡检测

基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，为了探究可注射功能化微球造成的肿瘤细胞的凋亡情况，利用TUNEL凋亡检测试剂盒对四组皮下荷瘤小鼠的原位肿瘤冰冻切片进行检测，结果表明游离给药组（Free）和MS-np组都有明显的导致肿瘤细胞凋亡的现象，其中MS-np组更加明显（图19A）。图19B是定量结果，差异有统计学意义。

d. Ki67增殖检测

Ki67 是一种标记细胞增殖状态的核抗原，主要表达于G1 期、S 期、G2 期及有丝分裂间期的细胞，但在G0 期的细胞中不表达，因此常用来评价细胞增殖情况。为了探究可注射肿瘤功能化微球对肿瘤细胞增殖的抑制情况，利用Ki67细胞增殖检测试剂盒对四组皮下荷瘤小鼠的原位肿瘤冰冻切片进行检测，结果表明游离给药组（Free）和MS-np组都有明显的抑制肿瘤细胞增殖的表现，其中MS-np组更加明显（图20A）。图20B是定量结果，差异有统计学意义。

（7）Micro-CT分析结果

治疗21天后，安乐死各组实验小鼠并取出股骨，通过Micro-CT分析检测骨骼状况。首先比较各组实验小鼠Micro-CT扫描得到的股骨的二维和三维重建图像，相比于MS-np组和游离给药组（Free），对照组（Control）和MS组的骨量下降的更为明显，其中游离给药组的骨丢失现象比MS-np组要更严重（图21A）。其次，在感兴趣部位定量分析相同体积股骨的骨密度，MS-np组和游离给药组的BMD显著高于对照组和MS组，MS-np组又显著高于Free组（图21B）。最后，在其他骨形态学相关指标方面，相较于MS-np组，游离给药组、对照组和MS组在BV/TV和Tb.N参数方面显著下降（图21C，D），Tb.Sp参数显著提高（图21E），差异有统计学意义。骨肉瘤能够引起小鼠的骨丢失，在可注射功能化微球的治疗下，不仅能够造成肿瘤的消退，还能够缓解肿瘤引起的骨丢失现象。

（8）其他脏器H&E染色结果

为了进一步评估可注射功能化微球在生物医学应用的潜力，我们测试了该体系生物安全性，分别对肾脏，肝脏和肺的组织切片进行H&E染色，结果如图22所示，未见明显异常，由此可见，可注射功能化微球在发挥抗肿瘤作用的时候并不会对机体产生毒性。

本发明通过原位注射功能化微球对骨肉瘤皮下荷瘤小鼠进行治疗，实验结果展现了良好的治疗效果，增加肿瘤浸润性T细胞的数量（图17,18），促进杀伤性T细胞和记忆性T细胞的表达（图12,15，同时也影响了外周免疫器官。骨肿瘤的骨侵蚀行为也有所缓解（图21），在对肿瘤细胞发挥杀伤作用的同时不会引起全身性毒性（图22）。

基于可注射功能化微球的治疗方式，虽然目前只是在治疗骨肉瘤皮下荷瘤小鼠的实验中取得了一定的疗效，但根据其作用原理，相信后续在用于其他含有肿瘤浸润性T细胞的实体瘤中也会有好的表现。该治疗方式的推出可能为实体瘤的治疗提供新的可行选择。