阅读说明：本技术 一种腺苷钴胺粗品的制备方法 (Preparation method of cobamamide crude product ) 是由 户鹏东 裴立忠 高宏伟 沈毅 马琼 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种腺苷钴胺粗品的制备方法,其工艺为包括将脱氮假单孢杆菌发酵液经喷雾干燥制成腺苷钴胺菌丝粉,然后采用丙酮复合溶媒浸提、离心分离、减压浓缩得到腺苷钴胺浓缩液Ⅰ,再经大孔树脂吸附、丙酮水溶液解析、减压浓缩得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ,最后经絮凝过滤、丙酮结晶,抽滤、真空干燥,得到腺苷钴胺粗品。本发明将脱氮假单孢杆菌发酵液进行喷雾干燥,得到腺苷钴胺菌丝粉,再用丙酮复合溶媒进行浸提,避免脱氮假单孢杆菌发酵液异常时,经板框过滤困难状况,最大限度回收腺苷钴胺,有利于提高产品质量和收率,具有工艺操作更为简捷,生产进度易保障,生产操作连贯性强,产生废水量少等特点。(The invention relates to a process for preparing adenosyl cobalamin crude product, which comprises, spray drying the denitrified pseudomonas fermentation liquor to prepare adenosyl cobalamin hypha powder, then leaching with acetone composite solvent, centrifugal separation, decompression concentration to obtain adenosyl cobalamin concentrated solution I, then absorbing with macroporous resin, resolving with acetone water solution, decompression concentration to obtain adenosyl cobalamin concentrated solution II, finally flocculating filtering, crystallizing with acetone, suction filtering, vacuum drying to obtain the adenosyl cobalamin crude product. The invention carries out spray drying on the pseudomonas denitrificans fermentation liquor to obtain adenosylcobalamine hypha powder, and then uses acetone composite solvent to carry out extraction, thereby avoiding the difficult condition of filtering through a plate frame when the pseudomonas denitrificans fermentation liquor is abnormal, recovering the adenosylcobalamine to the maximum extent, being beneficial to improving the product quality and yield, and having the characteristics of simpler process operation, easy guarantee of production progress, strong continuity of production operation, less waste water production and the like.)

一种腺苷钴胺粗品的制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵提取技术领域，特别是涉及一种腺苷钴胺粗品的制备方法。

背景技术

腺苷钴胺(adenosylcobalamin)是维生素 B₁₂其中的一种，通常称为辅酶维生素B₁₂（5，6-二甲基咪唑基-5-脱氧腺嘌呤核苷基钴胺）。

腺苷钴胺参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进与甲基叶酸还原为四氢叶酸；也参与三羧酸循环，对神经髓鞘中脂蛋白的形成非常重要，可使巯基酶处于活性状态，从而参与广泛的蛋白质及脂肪代谢，促进红细胞的发育与成熟，为完整形成神经鞘脊髓纤维和保持消化系统上皮细胞功能所必须的因素。腺苷钴胺可直接被人体利用吸收无需转化，与组织细胞亲和力强，体内存留较久。

腺苷钴胺是细胞生长增殖和维持神经髓鞘完整所必须的物质，是细胞合成核苷酸的重要辅酶，在营养修复神经、改善贫血等方面具备较好的临床价值，临床用于治疗多发性神经炎、神经根炎、三叉神经痛、坐骨神经痛、神经麻痹、巨幼细胞贫血、营养不良性贫血、妊娠期贫血，也可用于肝病、长期萎缩性胃炎等方面的治疗。制剂剂型包括片剂和冻干粉针剂。

腺苷钴胺（adenosylcobalamin）的分子式为 C₇₂H₁₀₀CoN₁₈O₁₇P，分子量 1579.57，为黄橙色六方晶体，暴露于空气中呈现深红色结晶形粉末，溶解于水（1：80），略溶于乙醇和苯酚，不溶于丙酮、***、二氯乙烷等，无臭、无味。腺苷钴胺水溶液呈中性，在水中的溶解度为16.4mmol/L（24℃），pH<3.5的水溶液为黄色，pH>3.5 的水溶液为红色，但在pH=4.5～5 时最稳定，于120℃加热20min不破坏。腺苷钴胺中的钴都处于三价氧化状态，在空气中被缓慢氧化成水钴胺。可作为氰钴胺、甲钴胺的生产原料。

工业生产中，腺苷钴胺提取过程包括，在维生素B12发酵液（脱氮假单孢杆菌发酵液）中加入聚合氯化铝或硫酸铝，将发酵液进行絮凝，以沉淀蛋白，改善发酵液性状以利板框过滤，得到滤渣再加水调成浆，进管式离心机破壁分离，离心滤液与板框滤液混合，进大孔树脂吸附，用稀丙酮或稀乙醇进行解析，解析液经减压浓缩后，加入丙酮结晶，得到腺苷钴胺粗品。

以上生产工艺中，存在的问题主要有以下几点：

1脱氮假单孢杆菌发酵液含有大量发酵代谢产物，如蛋白、氨基酸等，及未代谢完的糖类、油脂类，使发酵液中粘细物质较多，加入絮凝剂，絮凝这些粘细物质，可减轻对板板滤布毛孔的堵塞，有一定助滤作用，但脱氮假单孢杆菌发酵过程中，易染杂菌、易发生发酵代谢不正常，造成发酵液质量严重恶化，絮凝剂助滤作用受限，板框难以过滤，严重影响过滤收率和过滤进度，而且，腺苷钴胺存在液体环境中时间过长，易造成产品质量下降。

2腺苷钴胺属胞内发酵，腺苷钴胺主要存在菌丝体中，酸化过滤过程中，一部分腺苷钴胺进入滤液中，但还有一部分存在滤渣中，需将滤渣加水调浆经离心机高速旋转破壁，以浸提腺苷钴胺。为提高收率，需进行多次加水调浆浸提，离心机易污染，拆洗次数多，影响连贯性作业，产生废水多，增加环保处理压力。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高产品质量，提高收率，工艺操作便捷，生产操作连贯性强，产生废水量少的腺苷钴胺粗品的制备方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种腺苷钴胺粗品的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：将脱氮假单孢杆菌发酵液经喷雾干燥制成腺苷钴胺菌丝粉，然后采用丙酮复合溶媒浸提、离心分离、减压浓缩得到腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，再经大孔树脂吸附、丙酮水溶液解析、减压浓缩得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ，最后经絮凝过滤、丙酮结晶、抽滤、真空干燥得到腺苷钴胺粗品；

所述丙酮复合溶媒为丙酮、异丙醇和水的混合液，其体积比为3.5～4.5:1.5～2.0:5.5～6.5，投料比为：W_菌丝粉：W_{丙酮复合溶媒}=1:2.5～3。

所述喷雾干燥条件为：进风温度110～140℃，出风温度65～70℃。

所述丙酮复合溶媒浸提2～3次，每次3～6h。

所述大孔树脂吸附、丙酮水溶液解析、减压浓缩系指将腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，经大孔树脂吸附，再经30～50%丙酮水溶液解析，经薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ。

所述絮凝过滤系指在腺苷钴胺浓缩液Ⅱ中，加入0.15～0.3%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，再依次经板框过滤、液体过滤器过滤。

所述丙酮结晶是指在所得滤液中，加入其体积8～10倍丙酮，使腺苷钴胺结晶析出。

同传统腺苷钴胺提取工艺相比，本发明的技术优势体现在：

1 脱氮假单孢杆菌发酵液经喷雾干燥得到含腺苷钴胺菌丝粉，用含腺苷钴胺菌丝粉提取制备腺苷钴胺，避免了脱氮假单孢杆菌发酵液进板框过滤易发生的过滤受阻，过滤进度和收率难保障的情况，整个工艺操作更为简捷，生产进度易保障，有利于提高产品质量、提高收率。

2本发明采用丙酮、异丙醇和水组成的混合液复合溶媒来浸提腺苷钴胺，提高了酯溶性，增加菌丝细胞壁亲和性，有利于进入菌丝细胞内将腺苷钴胺提取出来。本发明比单纯用水浸泡、离心机高速破壁提取方式，收率高3～5%，而且生产操作连贯性强，产生废水量少。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

取脱氮假单孢杆菌发酵液（菌体浓度15%（w/v)，发酵效价290μg/ml），分别进行以下实验，其中：

取脱氮假单孢杆菌发酵液500L，经泵进喷雾干燥装置，控制进风温度110～140℃，出风温度65～70℃，得到腺苷钴胺菌丝粉75kg，分成5份，每份15kg（含腺苷钴胺0.029kg），分别进行实施例实验。

取脱氮假单孢杆菌发酵液100L，进行对照例实验。

实施例1

取腺苷钴胺菌丝粉15kg（含腺苷钴胺0.029kg），投入溶媒浸提罐，按投料比（菌丝粉（w）：复合溶媒（v）=1：2.5），加入丙酮复合溶媒（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（v）=3.5:1.5:5.5），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进离心机过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，用薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅰ39L(效价718μg/ml)，收率96.6%。

将以上腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，进大孔树脂吸附柱，再依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，用薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ75L(效价358μg/ml)，收率95.9%。

腺苷钴胺浓缩液Ⅱ中，按其体积加入0.15%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，得到腺苷钴胺过滤液。

将以上腺苷钴胺过滤液投入结晶罐中，室温下，加入8倍腺苷钴胺过滤液体积的丙酮，使腺苷钴胺结晶析出，抽滤、干燥，得到腺苷钴胺粗品0.029kg(含量86.0%），收率92.7%。总收率85.9%。

实施例2

取腺苷钴胺菌丝粉15kg（含腺苷钴胺0.029kg），投入溶媒浸提罐，按投料比（菌丝粉（w）：复合溶媒（v）=1：2.8），加入丙酮复合溶媒（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（v）=4.0:1.7:6.0），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进离心机过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液43L，浓缩液效价660μg/ml，收率97.9%。

将以上腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，进大孔树脂吸附柱，再依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，用薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ79L(效价350μg/ml)，收率97.4%。

腺苷钴胺浓缩液Ⅱ中，按其体积加入0.20%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，得到腺苷钴胺过滤液。

将以上腺苷钴胺过滤液投入结晶罐中，室温下，加入9倍腺苷钴胺过滤液体积的丙酮，使腺苷钴胺结晶析出，抽滤、干燥，得到腺苷钴胺粗品0.029kg(含量88.0%），收率92.5%。总收率88.2%。

实施例3

取腺苷钴胺菌丝粉15kg（含腺苷钴胺0.029kg），投入溶媒浸提罐，按投料比（菌丝粉（w）：复合溶媒（v）=1：3.0），加入丙酮复合溶媒（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（v）=4.5:2.0:6.5），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进离心机过滤，收集滤渣，照前再进行二次浸提，合并三次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液45L，浓缩液效价630μg/ml，收率97.8%。

将以上腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，进大孔树脂吸附柱，再依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，用薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ81L(效价336μg/ml)，收率96.0%。

腺苷钴胺浓缩液Ⅱ中，按其体积加入0.25%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，得到腺苷钴胺过滤液。

将以上腺苷钴胺过滤液投入结晶罐中，室温下，加入10倍腺苷钴胺过滤液体积的丙酮，使腺苷钴胺结晶析出，抽滤、干燥，得到腺苷钴胺粗品0.029kg(含量88.0%），收率93.8%。总收率88.1%。

实施例4

取腺苷钴胺菌丝粉15kg（含腺苷钴胺0.029kg），投入溶媒浸提罐，按投料比（菌丝粉（w）：复合溶媒（v）=1：3.2），加入丙酮复合溶媒（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（v）=4.0:2.0:6.5），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进离心机过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液50L，浓缩液效价560μg/ml，收率96.6%；

将以上腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，进大孔树脂吸附柱，再依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，用薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ86L(效价319μg/ml)，收率97.9%。

腺苷钴胺浓缩液Ⅱ中，按其体积加入0.30%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，得到腺苷钴胺过滤液；

将以上腺苷钴胺过滤液投入结晶罐中，室温下，加入9倍腺苷钴胺过滤液体积的丙酮，使腺苷钴胺结晶析出，抽滤、干燥，得到腺苷钴胺粗品0.029kg(含量88.0%），收率93.0%。总收率87.9%。

实施例5

取腺苷钴胺菌丝粉15kg（含腺苷钴胺0.029kg），投入溶媒浸提罐，按投料比（菌丝粉（w）：复合溶媒（v）=1：3.5），加入丙酮复合溶媒（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（v）=3.5:2.0:6.0），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进离心机过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液55L，浓缩液效价516μg/ml，收率97.9%。

将以上腺苷钴胺浓缩液Ⅰ，进大孔树脂吸附柱，再依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，用薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺浓缩液Ⅱ91L(效价305μg/ml)，收率97.8%。

腺苷钴胺浓缩液Ⅱ中，按其体积加入0.22%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，得到腺苷钴胺过滤液。

将以上腺苷钴胺过滤液投入结晶罐中，室温下，加入9倍腺苷钴胺过滤液体积的丙酮，使腺苷钴胺结晶析出，抽滤、干燥，得到腺苷钴胺粗品0.029kg(含量87.0%），收率90.9%。总收率87.0%。

对比案例1

取脱氮假单孢杆菌发酵液100L（菌体浓度15%、发酵效价290μg/ml），含腺苷钴胺0.029kg，加入20%（w/w)盐酸，调pH4.2，用泵进入蒸汽喷射器，与压力0.6MPa饱和蒸汽混合、加热，温度达90℃，再按脱氮假单孢杆菌发酵液体积，加入1.2%（w/v)聚合氯化铝，搅拌20～30min后，静置20min，板框过滤，得到滤液82L，滤渣16.2kg。

将以上滤渣投入水浸提罐中，按投料比（滤渣（w）：水（v）:1：5.0），加入水，控制搅拌转速80rpm，室温下进行浸泡，浸泡3hr后，离心，收集滤渣，照前再进行二次浸提，至残渣效价≤10μg/ml，合并水浸提液、滤液，得到腺苷钴胺混合液总计325L（效价85μg/ml），过滤收率95.2%。

将以上腺苷钴胺混合液进大孔树脂吸附柱，再依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，经薄膜蒸发器减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液310L（效价85μg/ml），收率95.4%。

将上述腺苷钴胺解析浓缩液中，加入9倍腺苷钴胺解析浓缩液过滤液体积的丙酮，使腺苷钴胺结晶析出，抽滤、干燥，得到腺苷钴胺粗品0.028kg(含量86.0%），收率91.4%。总收率83.0%。

效果对比：