阅读说明：本技术 新的环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物及其制备方法和应用 (New cycloartane type saponin-9, 19-seco-9, 11-ene derivative and its preparing method and use ) 是由 王芳 江志波 梁大连 张岱州 段崇刚 王帆 袁振海 李敏 贾婵媛 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及三个新的环阿尔廷型皂苷-9,10-裂环-9,11-烯衍生物制备方法及其应用；三个新的环阿尔廷型皂苷-9,10-裂环-9,11-烯衍生物,具有如下结构：<Image he="189" wi="700" file="DDA0002578046700000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>该三个环阿尔廷型皂苷-9,10-裂环-9,11-烯衍生物1具有抗肿瘤活性,可用于抗肿瘤药物的开发和应用。(The invention belongs to the technical field of medicines, and relates to a preparation method and application of three novel cycloartane-type saponin-9, 10-seco-9, 11-ene derivatives; three novel cycloartane-type saponin-9, 10-seco-9, 11-ene derivatives having the structure: the three cycloartane-type saponin-9, 10-seco-9, 11-ene derivative 1 has antitumor activity, and can be used for development and application of antitumor drugs.)

新的环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物及其制备方 法和应用

所属技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及皂苷类化合物分离、制备和应用，具体涉及三个新型的环阿尔廷型三萜皂苷衍生物、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

环阿尔廷类(9,19-cycloartane)化合物为羊毛甾烷型四环三萜类化合物。近几十年来，发现了大量的环阿尔廷类。已分离得到的环阿尔廷类化合物主要来自植物界，如豆科的紫云英属(Astragalus)、毛莨科的升麻属(Cimicifugeae)和唐松草属(Thalictrum)、铁角蕨科的铁角蕨属(Asplenium)。

环阿尔廷型皂苷类化合物是中药升麻和黄芪的主要成分。近年来的研究表明其有多方面的药理活性。文献报道紫云英属植物Astragalus oleifolius具有止汗、利尿的作用，并对肾炎、糖尿病、白血病、子宫癌有疗效，其主要成分中包括环阿尔廷三萜；紫云英属植物Astragalus spinous在埃及的民间用来治疗高血压、白血病和子宫癌，Astragalusverrucosus的醇提物分别具有免疫增强作用和免疫调节作用，其主要成分中均包括环阿尔廷三萜。

虽然文献报道早期从采自东北地区的过山蕨全草70％乙醇提取物中分离得到的12个环阿尔廷型皂苷均无细胞毒活性。我们前期研究中发现采自河南地区的过山蕨全草大极性提取部位中富含新型环阿尔廷型皂苷，综合利用多种分离和鉴定手段注重微量成分的获得继续从过山蕨全草大极性提取部位分离制备、鉴定了3个新结构环阿尔廷型皂苷-9,10-裂环-9,11-烯衍生物并测定抗肿瘤活性，在现有技术中还未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供了三个新结构环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物、制备方法及其应用。

本发明提供了三个新的环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物，具有如下结构：

本发明还提供了所述新型环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)过山蕨经超声、闪式提取技术或溶剂提取法，采用30％～95％的乙醇或甲醇提取，减压回收提取液至无醇味，水分散，醋酸乙酯萃取，回收溶剂，收集得到醋酸乙酯和水相提取物；

(2)上述步骤(1)所得水相提取物经非极性大孔树脂柱色谱处理，依次用水和醇梯度洗脱，得到15％～95％醇洗脱部位；

(3)上述步骤(2)所得醇洗物经硅胶柱色谱、反相中压柱色谱或凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、水一些溶剂或混合溶剂梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)所得流分经半制备或制备型HPLC色谱分离，以甲醇/水，乙腈/水或甲醇/乙腈/水为流动相洗脱，得到新环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物1-3。

本发明提供的所述新型环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物1-3的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或超声提取1～3次，所用溶剂是体积为30％～95％乙醇，所述过山蕨的质量与溶剂的体积的比例为1:5～1:20；所述的萃取1～5次，所述水相提取物与溶剂的体积的比例为1:3～1:10。

本发明所提供的所述新型环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物1-3的制备方法，步骤(2)中所述的醇为乙醇，其梯度洗脱浓度为15％～95％；所述的非极性树脂为AB-8大孔树脂和MCI树脂，经AB-8大孔树脂柱色谱分离30％～60％乙醇洗脱部位和MCI树脂柱色谱分离50％～80％乙醇洗脱部位含有目标化合物。

本发明所提供的所述新型环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物1-3的制备方法，步骤(3)中所述经硅胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为1:12～3:7的氯仿或二氯甲烷/甲醇或乙醇，乙酸乙酯/甲醇或95％乙醇，混合比例4:1～3:1的流分含有目标化合物；所述经反相中压柱色谱法分离，洗脱溶剂为乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂，混合溶剂的体积比例为0:100～100:0，优选50:50～100:0，混合比例60:40～90:10的流分含有目标化合物；所述经凝胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为以甲醇，二氯甲烷/甲醇混合溶剂等度洗脱，二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1～1:5的流分含有目标化合物。

本发明所提供的所述新型环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物1-3的制备方法，步骤(4)中所述4)中所述洗脱流分经高效液相色谱分离，流动相为甲醇/水、乙腈/水或甲醇/乙腈/水，从甲醇/水混合溶剂比例为5:1～1:1的流分中得到化合物1-3。

本发明对新化合物1-3体外抗肿瘤活性进行了初步测试和评价，所选细胞系为白血病细胞(HL-60)和人肝癌细胞(HepG2)。因此，本发明中制备的新化合物1-3可在开发抗肿瘤药物方面应用。

本发明首次提供了以过山蕨全草为原料，富集、制备、鉴定新环阿尔廷型皂苷-9,19-裂环-9,11-烯衍生物1-3的方法，并且评价抗肿瘤活性，阐述了其在开发抗肿瘤药物中的应用。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此限制本发明。

实施例1：

(1)过山蕨干燥全草17.4kg，用95％乙醇加热回流提取3次(用量为11L)，减压回收提取液的粗提物；粗提物水分散经醋酸乙酯萃取3次(用量为3L)，减压回收萃取液得醋酸乙酯相和水相粗提物；

(2)步骤(1)所得水相提取物经AB-8大孔树脂吸附，用水、30％、50％和95％乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；AB-8大孔树脂吸附30％醇洗脱物经MCI大孔树脂，用水、15％、30％、70％和95％乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；

(3)步骤(2)中所得的AB-8大孔吸附树脂50％乙醇洗脱物和MCI大孔树脂70％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱进行分离，经乙酸乙酯/95％乙醇100:5，100:8，100:10，8:1，4:1，2:1，1:1混合溶剂梯度洗脱，混合比例4:1～3:1的流分含有目标化合物；经反相中压柱色谱法分离，洗脱溶剂为乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂，混合溶剂的体积比例为0:100～100:0，优选50:50～100:0，混合比例60:40～90:10的流分含有目标化合物；经凝胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为以甲醇，二氯甲烷/甲醇混合溶剂等度洗脱，二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1～1:5的流分含有目标化合物。

(4)将步骤(3)所得乙酸乙酯/95％乙醇8:1流分经半制备HPLC色谱分离，以72％甲醇/水为流动相洗脱，示差检测，流速为1mL/min，得到新化合物1；乙酸乙酯/95％乙醇4:1流分经半制备HPLC色谱分离，以65％甲醇/水为流动相洗脱，示差检测，流速为1mL/min，得到新化合物2和3。

化合物1：白色胶状物；[α]_D ²⁰+20.33(c 0.25,MeOH)；(+)-HRESIMS m/z 979.5468[M+H]⁺(calcd for C₄₈H₈₁O₂₀,979.5472).¹H NMR和¹³C NMR数据见表1、表2。

化合物2：白色胶状物；[α]_D ²⁰+48.78(c 0.24,MeOH)；(+)-HRESIMS m/z 979.5464[M+H]⁺(calcd for C₄₈H₈₃O₂₀,979.5472).¹H NMR和¹³C NMR数据见表1、表2。

化合物3：白色无定型粉末；[α]_D ²⁰+44.64(c 0.22,MeOH)；(+)-HRESIMS m/z1141.5967[M+H]⁺(calcd for C₅₄H₉₃O₂₅,1141.6000).¹H NMR和¹³C NMR数据见表1、表2。

表1化合物1–3的¹H NMR数据^a

^{a 1}H NMR data(δ)was measured at 600 MHz in pyridine-d₅.Proton couplingconstants(J)in Hz are given in parentheses.The assignments were based onDEPT,¹H-¹H COSY,gHMQC and HMBC experiments.

表2化合物1–3的¹³C NMR数据^a

^{a 13}C NMR data(δ)was measured at 150 MHz in pyridine-d₅.Theassignments were based on DEPT,¹H-¹H COSY,gHMQC and HMBC experiments.

实施例2：

(1)过山蕨干燥全草17.4kg，用95％乙醇加热回流提取3次(用量为11L)，减压回收提取液的粗提物；粗提物水分散经醋酸乙酯萃取3次(用量为3L)，减压回收萃取液得醋酸乙酯相和水相粗提物；

(2)步骤(1)所得水相提取物经D101大孔树脂吸附，用水、20％、60％和95％乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；D101大孔树脂吸附20％醇洗脱物经HPD200大孔树脂，用水、10％、20％、50％和95％乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；

(3)步骤(2)中所得的D101大孔吸附树脂60％乙醇洗脱物和HPD200大孔树脂50％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱进行分离，经乙酸乙酯/95％乙醇100:5，100:8，100:10，8:1，4:1，2:1，1:1混合溶剂梯度洗脱，混合比例4:1～3:1的流分含有目标化合物；经反相中压柱色谱法分离，洗脱溶剂为乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂，混合溶剂的体积比例为0:100～100:0，优选50:50～100:0，混合比例60:40～90:10的流分含有目标化合物；经凝胶柱色谱法分离，洗脱溶剂为以甲醇，二氯甲烷/甲醇混合溶剂等度洗脱，二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1～1:5的流分含有目标化合物。

(4)将步骤(3)所得乙酸乙酯/95％乙醇10:1流分经半制备HPLC色谱分离，以70％甲醇/水为流动相洗脱，示差检测，流速为1mL/min，得到新化合物1；乙酸乙酯/95％乙醇4:1流分经半制备HPLC色谱分离，以60％甲醇/水为流动相洗脱，示差检测，流速为1mL/min，得到新化合物2和3。

实施例3：化合物1-3体外抗肿瘤实验测试

1、取对数生长期的白血病HL-60细胞，人肝细胞癌HepG2细胞。

2、HL60细胞以1.0×10⁵mL^-1接种于96孔培养板中，每孔100μL；HepG2细胞以3.0×10⁴mL^-1接种于96孔培养板中，每孔100μL；

3、置于37℃、5％CO2培养箱中，贴壁细胞HepG2培养12h，悬浮细胞HL60培养1h后，加入含有不同浓度的化合物的培养基100uL，每一样品设4-5个浓度级别，每一化合物设3个复孔，每板设3个复孔的空白对照

4、培养24h后取板备测。将备测孔依次加入CCK8溶液20μL，入孵箱继续培养2h，在BIORAD 550型酶标仪上测定450nm处的光密度值。按下列公式计算肿瘤细胞生成抑制率，再以药物浓度对肿瘤细胞生成抑制率作图得到计量曲线，从曲线上读取药物的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1－实验孔测定值/对照孔测定值)×100％

表3化合物1-3体外抗肿瘤活性实验结果

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围。