本发明公开了一种全基因组甲基化单链DNA建库方法,其步骤包括:重亚硫酸盐处理待建库的基因组DNA,获得单链DNA;加入引物1,引物1的随机引物与单链DNA互补,在DNA聚合酶1的作用下合成第一链;产物纯化后先高温解链,然后在新合成的第一链的3’端添加2~4个ATP,形成一个核糖核苷酸的尾巴;RNA连接酶催化下,在第一链的核糖核苷酸的尾巴后连接上引物2;加入与引物2互补的引物3,在DNA聚合酶2的作用下合成第二链,获得双链DNA;文库扩增。本发明的单链DNA建库方法,可以有效利用重亚硫酸盐处理后的DNA样本,将处理后的单链DNA顺利扩增,文库转化率比传统方法高,要求的初始DNA用量可低至1ng。