具有能形成分子内氢键的官能团的氨基酸、包含该氨基酸的肽化合物、及其制备方法
阅读说明：本技术 具有能形成分子内氢键的官能团的氨基酸、包含该氨基酸的肽化合物、及其制备方法 (Amino acid having functional group capable of forming intramolecular hydrogen bond, peptide compound comprising the same, and method for producing the same ) 是由 村冈照茂 田中翔太 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：发现通过使构成肽化合物的氨基酸中的至少一个为具有能形成分子内氢键的侧链的氨基酸能够改善肽化合物的膜透过性。(It was found that the membrane permeability of a peptide compound can be improved by making at least one of the amino acids constituting the peptide compound an amino acid having a side chain capable of forming an intramolecular hydrogen bond.)
技术领域
本发明涉及能够提高肽化合物的膜透过性的氨基酸，及包含该氨基酸的肽化合物，及它们的制备方法。
背景技术
在与困难靶标进行接触(以抑制蛋白-蛋白相互作用为代表的)这方面，中分子化合物(分子量：500～2000)可能优于低分子化合物。另外，在可以移动至细胞内这方面，中分子化合物也可能优于抗体。在具有生理活性的中分子化合物中，肽药物中也已经有40种以上已上市的，价值较高的分子种类(非专利文献1)。
作为肽药物的代表例，可列举环孢菌素A、多粘菌素B。如果专注于它们的结构，则作为特征点，可列举它们为包含一些非天然氨基酸(以N-甲基氨基酸为代表)的肽这点，或者为环状肽这点。非天然氨基酸是指天然情况下不在mRNA上编码的氨基酸，加上在源自天然的环孢菌素A、多粘菌素B中包含非天然氨基酸，对于这些非天然的结构部位、环状结构在生物体内的作用部位和相互作用、有助于药物动力学而表现出药理活性这点非常使人感兴趣。
近年来，对中分子肽的可有助于改善药物动力学的膜透过性而言，作为用于提高所述膜透过性的条件(为了满足类药物性而需要的条件)，已有报道例如，具有环状部，N取代氨基酸数目，氨基酸残基数目的范围，脂溶性等条件(专利文献1)。另外，也有着眼于非天然氨基酸N-甲基氨基酸，通过翻译合成而构建了N-甲基肽文库的报道(专利文献2)。另外，目标与药物的相互作用对于为了目标与药物形成复合体是重要的，这之中重要的是氢键(非专利文献3)。质子供体虽然为了形成氢键是必要的，但对膜透过性造成负面影响。实际上，已知作为改善膜透过性的方法之一，氨基酸的N-甲基化是奏效的(专利文献1)。除了氨基酸的N-甲基化以外，也考察了利用在主链中包含的酰胺键掩蔽(mask)质子，由此造成的对膜透过性的影响(非专利文献2)。
一方面，并没有关于设计在氨基酸的侧链上具有质子和可掩蔽的质子官能团的非天然氨基酸，并利用掩蔽其质子的功能使肽的膜透过性得以改善的报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/100132号
专利文献2：国际公开第2012/033154号
非专利文献
非专利文献1：Future Med.Chem.2009，1，1289-1310.
非专利文献2：Angew.Chem.Int.Ed.2018，57，14414-14438.
非专利文献3：最新创药化学上卷，p87
发明内容
发明要解决的问题
在作为医药上有用的肽的创制中，可以说提高靶分子与肽的相互作用是必要的。对提高靶分子与肽的相互作用而言，可以说更重要的是不仅氨基酸的主链，侧链的结构也与靶分子进行相互作用。为了改善与靶分子的相互作用，不仅在于包含20种天然氨基酸的肽，在肽中掺入设计使得与靶分子的相互作用更加牢固的非天然氨基酸更为有利。在专利文献1及专利文献2记载的方法中，记载了从构成肽的单位的氨基酸的酰胺键部位的N-甲基化，氨基酸残基数，脂溶性的角度而来的启示，但另一方面，并没有考察对认为有利于与靶分子的结合的氢键而言，将为了形成所述氢键而必要的(以氧原子、氮原子等为代表的)杂原子导入氨基酸的侧链的情况的结构特性。在非专利文献1中虽然记载了肽药物、环状肽的环化方法的例示，但并没有启示膜透过性与氨基酸的结构之间的相关。在非专利文献2中有对肽药物的例示，但没有将构成肽的氨基酸的结构转换与对医药上的有用性连接起来的启示，终究为仅进行了对已知化合物的考察，在医药上的通用性有限。
本发明是鉴于肽化合物的设计(特别是给予膜透过性的影响的研究)现在没有着眼于氨基酸各自的结构特性进行而作出的，本发明的课题为提供改善肽化合物的膜透过性的氨基酸，及包含该氨基酸的肽化合物。
用于解决问题的方法
作为上述课题的解决办法，本发明人发现以下内容而完成了发明。即，设计了如下氨基酸侧链：所述氨基酸侧链具有用于与靶分子的相互作用所必需的杂原子，并且能够在同一氨基酸侧链内利用分子内氢键将该氨基酸侧链上的质子掩蔽。制备包含该氨基酸的肽化合物并对膜透过性进行了评价，结果惊讶地发现，在膜透过性方面，包含该氨基酸的肽化合物优于含有不形成分子内氢键的氨基酸的肽化合物。再者，发现了在具有形成分子内氢键的侧链的氨基酸的设计中，如下结构发挥效果：质子供体和质子受体能够形成伪(pseudo)环状结构，优选为4元环，5元环，6元环，或者7元环的结构。另外，发现了对包含该氨基酸的肽化合物的膜透过而言，最适的构成肽的氨基酸残基的数目，N取代氨基酸残基的数目，在肽中包含的N取代氨基酸残基的比例，cLogP的范围，芳环数目。
本发明在非限定性的具体一个实施方式中包含以下内容。
[1]肽化合物，所述肽化合物由2个以上的氨基酸连接而成，其中，氨基酸中至少1个在其侧链内能够形成氢键。
[2]根据[1]所述的肽化合物，其中，在侧链内能够形成氢键的氨基酸在侧链内能够形成伪4～7元环。
[3]根据[1]或[2]所述的肽化合物，其中，在侧链内能够形成氢键的氨基酸以下述式A表示：
式中，
R1为氢或C1-C6烷基，或以式1或式2表示的基团，在该情况下，R2A及R2B中，R2A为氢或C1-C6烷基，或以式1或式2表示的基团，且R2B为氢或C1-C6烷基，或者，R2A及R2B与它们结合的碳原子共同形成4～6元环，或者
R1，与R1结合的氮原子，R2A，及与R2A结合的碳原子共同形成4～6元杂环，该杂环任选具有选自由以式1或式2表示的基团，-OH，及烷氧基组成的组中的1个或多个取代基，在该情况下，R2B为氢或C1-C6烷基，
R3为单键或-CHR4-，
R4为氢或C1-C4烷基，或以式1或式2表示的基团，
式1及式2分别以下述式表示：
式中，
*表示结合点，
Q1及Q2独立地为单键，C1-C4亚烷基，或包含1个氧原子的C2-C4杂亚烷基，
A1为-O-，或-S-，
L1为任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，
A2为单键，-O-，或-S-，
L2为单键或任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，
X为-OH，-NRZ1RZ2，或-CONRZ1RZ2，或任选被氧代或者1个或多个卤素取代的，含有1～3个杂原子的5～6元的饱和或者不饱和杂环基；
RZ1及RZ2独立地选自由氢，-OH，C1-C4烷基，及C1-C4烷基磺酰基组成的组，
Y为-OH，C1-C4烷基磺酰氨基，-NRZ3RZ4，或-CONRZ3RZ4，或任选被氧代或者卤素取代的，含有1～3个杂原子的5～6元的饱和或者不饱和杂环基，
RZ3及RZ4独立地选自由氢，-OH，C1-C4烷基，及C1-C4烷基磺酰基组成的组，
Z为氢或C1-C4烷基，
条件是在A2为-O-，或-S-的情况下，Z不为氢，
其中，以式A表示的氨基酸中包含至少1个以式1或式2表示的基团中的任一个。
[4]根据[3]所述的肽化合物，其中，
R1为以式1或式2表示的基团，
R2A及R2B独立地为氢或C1-C6烷基，或者，R2A及R2B与它们结合的碳原子共同形成4～6元环，
R3为单键，或-CHR4-，
R4为氢或C1-C4烷基。
[5]根据[3]所述的肽化合物，其中，
R1，与R1结合的氮原子，R2A，及与R2A结合的碳原子共同形成4～6元杂环，该杂环具有以式1或式2表示的基团，
R2B为氢或C1-C6烷基，
R3为单键，或-CHR4-，
R4为氢或C1-C4烷基。
[6]根据[3]所述的肽化合物，其中，
R1为氢或C1-C6烷基，
R2A为以式1或式2表示的基团，
R2B为氢或C1-C6烷基，
R3为单键，或-CHR4-，
R4为氢或C1-C4烷基。
[7]根据[3]所述的肽化合物，其中，R1为氢或C1-C6烷基，
R2A及R2B独立地为氢或C1-C6烷基，或者，R2A及R2B与它们结合的碳原子共同形成4～6元环，
R3为-CHR4-，
R4为以式1或式2表示的基团。
[8]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q1为C1-C4亚烷基，
A1为-O-或-S-，
L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，
X为-OH。
[9]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q1为C1-C4亚烷基，
A1为-O-或-S-，
L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，
X为-CONRZ1RZ2，
RZ1为C1-C4烷基，
RZ2为氢。
[10]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q1为C1-C4亚烷基，
A1为-O-或-S-，
L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，
X为任选被氧代或者1个或多个卤素取代的，含有1～3个杂原子的5～6元的饱和或者不饱和杂环基。
[11]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q1为单键，
A1为-O-或-S-，
L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，
X为-OH。
[12]根据[3]～[11]中任一项所述的肽化合物，其中，Q1为CH2-。
[13]根据[3]～[12]中任一项所述的肽化合物，其中，A1为-O-。
[14]根据[3]～[13]中任一项所述的肽化合物，其中，L1选自由-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-CH2CH(CH3)-，-CH2CH(CF3)-，-CH2C(CH3)2-，-(CH2)2CH(CH3)-，-CH2C(CH3)2CH2-，-(CH2)2C(CH3)2-，及-CH2CO-组成的组。
[15]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，
Q2为C1-C4亚烷基，
L2为单键，
Y为-CONRZ3RZ4，
A2为-O-，或-S-，
Z为C1-C4烷基。
[16]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q2为C1-C4亚烷基，
L2为单键，
Y为-CONRZ3RZ4，
A2为单键，
Z为氢。
[17]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q2为C1-C4亚烷基，
L2为单键，
Y为C1-C4烷基磺酰氨基羰基，
A2为-O-，或-S-，
Z为C1-C4烷基。
[18]根据[3]～[7]中任一项所述的肽化合物，其中，Q2为C1-C4亚烷基，
L2为单键，
Y为-OH，
A2为-O-，或-S-，
Z为C1-C4烷基。
[19]根据[3]～[7]，[16]～[18]中任一项所述的肽化合物，其中，Q2为-CH2-。
[20]根据[3]～[7]，[15]，及[19]中任一项所述的肽化合物，其中Y为甲基氨基羰基，-CON(OH)Me，或-CONH(OH)-。
[21]根据[3]～[7]，[16]，及[19]中任一项所述的肽化合物，其中Y为-CON(OH)Me-。
[22]根据[3]～[7]，[15]，及[17]～[21]中任一项所述的肽化合物，其中A2为-O-。
[23]根据[3]～[7]，[15]，[17]～[22]中任一项所述的肽化合物，其中Z为甲基。
[24]根据[3]所述的肽化合物，其中，以式A表示的氨基酸选自由以下组成的组：
[25]根据[1]～[24]中任一项所述的肽化合物，所述肽化合物由5～30个氨基酸构成。
[26]根据[1]～[25]中任一项所述的肽化合物，其为环状。
[27]根据[26]所述的肽化合物，其包含由2～15个氨基酸构成的环状部。
[28]根据[1]～[27]中任一项所述的肽化合物，所述肽化合物包含2～30个N取代氨基酸。
[29]根据[1]～[28]中任一项所述的肽化合物，其中全部氨基酸数目中N取代氨基酸占的数目的比例为30％以上。
[30]根据[1]～[29]中任一项所述的肽化合物，所述肽化合物的ClogP为4.0～18。
[31]根据[1]～[30]中任一项所述的肽化合物，所述肽化合物的Papp为1.0x10-7cm/秒以上。
[32]文库，其含有[1]～[31]中任一项所述的肽和/或编码该肽的核酸。
[33]氨基酸，其为根据[3]～[23]中任一项所述的以式A表示的氨基酸。
[34]根据[33]所述的氨基酸，其选自由以下组成的组：
[35]保护氨基酸，其中，[33]或[34]所述的氨基酸中包含的氨基，和/或羧基被保护基保护。
[36]根据[35]所述的保护氨基酸，其中，氨基的保护基选自由Fmoc基，Boc基，Cbz基，Alloc基，nosyl基，dinitronosyl基，t-Bu基，三苯甲基，及异丙苯基组成的组，和/或
羧基的保护基选自由甲基，烯丙基，t-Bu基，三苯甲基，异丙苯基，甲氧基三苯甲基，及苄基组成的组。
发明的效果
根据本发明，能够提供在肽药物的探索，具体而言在膜透过性方面优异的，与靶分子特异性结合的氨基酸，及包含该氨基酸的肽，或这些氨基酸及肽。
附图说明
[图1-1]示出将不具有Trp侧链的环状肽化合物作为总体(母集团)的情况下的ClogP/总AA和Papp的关系的图。
[图1-2]示出将具有Trp侧链的环状肽化合物作为总体的情况下的ClogP/总AA和Papp的关系的图。
[图2]示出环状肽化合物的ARC与细胞膜穿透性的关系的图。
[图3-1]例如，在Ser(NMe-Aca)的侧链部分结构中的势能面(Potentialenergysurface)的图。
[图3-2]示出使用例如，在Ser(NMe-Aca)的侧链部分结构中的登记于CSD的X射线结构分析的结果，晶体结构(Crystal structures)的构象(Confor mation)分布的图。
[图4-1]例如，Ser(EtOH)，bAla(3R-MeOEtOH)，bAla(2S-MeOEtOH)的侧链部分结构中的势能面的图。
[图4-2]示出使用例如，Ser(EtOH)，bAla(3R-MeOEtOH)，bAla(2S-MeOEtOH)的侧链部分结构中的登记于的CSD中X射线结构分析的结果，晶体结构的构象分布的图。
具体实施方式
下文中，说明本说明书的优选非限定实施方式。
对在后述的本实施例中记载的所有要素(element)而言，其记载意在不受在意图对本专利申请的要求权利的国家中可以将实施例中记载的内容解释为限定性的方式的任何专利实务、惯例、法规等的限制，而是视为理所当然地也相同记载在本“具体实施方式”中。
对本说明书中任一项所述的一或多个要素(element)的一部分或全部任意地进行的组合而言，只要与基于本领域技术人员的技术常识的技术不矛盾，就也包括在本明申请中，且作为本领域技术人员理应理解的内容被记载。
在本说明书中使用以下缩略词。Ala(丙氨酸)，Arg(精氨酸)，Asn(天冬酰胺)，Asp(天冬氨酸)，Cys(半胱氨酸)，Glu(谷氨酸)，Gln(谷氨酰胺)，Gly(甘氨酸)，His(组氨酸)，Ile(异亮氨酸)，Leu(亮氨酸)，Lys(赖氨酸)，Met(甲硫氨酸)，Phe(苯丙氨酸)，Pro(脯氨酸)，Ser(丝氨酸)，Thr(苏氨酸)，Trp(色氨酸)，Tyr(酪氨酸)，Val(缬氨酸)。另外，除了这些以外，使用在后述缩略词表及表1中记载的缩略词。
(官能团等的定义)
在本说明书中，“烷基”，是指从脂肪族烃除去1个任意氢原子而衍生的1价基团，在骨架中不含有杂原子(指除了碳及氢原子以外的原子)或不饱和的碳-碳键，具有含有氢及碳原子的烃或烃基结构的部分集合。烷基包含直链状或支链状的那些。作为烷基，为碳原子数1～20(C1-C20，以下“Cp-Cq”是指碳原子数为p～q个)的烷基，优选可列举：C1-C6烷基，C1-C5烷基，C1-C4烷基，C1-C3烷基等。作为烷基，具体而言，可列举：甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，异丙基，叔丁基，仲丁基，1-甲基丙基，1，1-二甲基丙基，2，2-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1，1，2，2-四甲基丙基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，异戊基，新戊基等。
本说明书中的“杂烷基”是指在上述“烷基”的骨架中优选包含1～5个杂原子的基团，可列举优选为C2-C10杂烷基，C2-C6杂烷基等。作为杂烷基，具体而言可列举-CH2OCH3，-CH2OCH2CH3，-CH(CH3)OCH3，-CH2CH2N(CH3)2等。
作为本说明书中的“卤原子”，可列举F、Cl、Br及I，例示优选为F或Cl。
本说明书中的“氟代烷基”是指上述“烷基”的1个或多个氢原子被氟原子取代的基团，优选可列举C1-C6氟代烷基，C1-C4氟代烷基，C1-C2氟代烷基等。作为氟代烷基，具体而言可列举三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，五氟乙基，2，2，3，3-四氟丙基，七氟丙基，三氟甲氧基，2，2，2-三氟乙氧基，五氟乙氧基，2，2，3，3-四氟丙氧基，七氟丙氧基等。
本说明书中的“烷基磺酰基”是指结合有上述“烷基”的磺酰基(即，-SO2-烷基)。作为烷基磺酰基，优选可列举C1-C6烷基磺酰基，C1-C4烷基磺酰基等，具体而言可列举甲基磺酰基，乙基磺酰基，正丙基磺酰基，异丙基磺酰基等。
本说明书中的“烷基磺酰氨基”是指氨基(-NH2)的一个氢原子被上述“烷基磺酰基”取代的基团。作为烷基磺酰氨基，优选可列举C1-C6烷基磺酰氨基，C1-C4烷基磺酰氨基等，具体而言可列举甲基磺酰氨基，乙基磺酰氨基，正丙基磺酰氨基，异丙基磺酰氨基等。
本说明书中的“烯基”为具有至少1个双键(2个相邻的sp2碳原子)的1价基团。根据双键及取代组分(存在时)的配置不同，双键的几何学形态可以取共同(E)或相反(Z)、顺式或反式构型。作为烯基，可列举直链状或支链状的那些，包括含有内部烯烃的直链等。优选可列举C2-C10烯基，进一步优选可列举C2-C6烯基。作为这样的烯基，具体而言可列举例如，乙烯基，烯丙基，1-丙烯基，2-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯(包括顺、反)基，3-丁烯基，戊烯基，己烯基等。
本说明书中的“炔基”为具有至少1个三键(2个相邻的SP碳原子)的1价基团。可列举直链状或支链状的炔基，包括内部亚烷基。优选可列举C2-C10炔基，进一步优选可列举C2-C6炔基。作为炔基具体而言可列举例如，乙炔基，1-丙炔基，丙炔基，3-丁炔基，戊炔基，己炔基等。
在本说明书中，“环烷基”是指饱和或部分饱和的环状的1价脂肪族烃基，包括单环、二环、螺环。优选可列举C3-C10环烷基。环烷基任选是部分不饱和的。作为环烷基，具体而言，可列举例如，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，二环[2.2.1]庚基等。
在本说明书中，“芳基”是指1价芳香族烃环，优选可列举C6-C10芳基。作为芳基具体而言可列举例如，苯基，萘基。
在本说明书中，“杂芳基”是指构成环的原子中(在本说明书中也称为“环内”)优选含有1～5个杂原子的芳香族性的环的1价基团，任选是部分饱和的。环可以为单环，或2个稠环(例如，苯或单环杂芳基缩合而成的2环式杂芳基)。构成环的原子的数目优选为5～10(5-10元杂芳基)。作为杂芳基具体而言可列举例如，咪唑基，噻唑基，噁二唑基，噻二唑基，噁二唑酮基(oxadiazolonyl)，噻二唑啉基，四唑基，吡啶，吲哚基等。
在本说明书中，“在环内具有杂原子”是指构成环的原子中含有杂原子，作为这样的环，可例示：吡啶等芳香族杂环，哌啶，吗啉，吡咯烷，或氮杂环丁烷等非芳香族杂环。另外，在上述杂原子为氧原子的情况下，表述为“在环内具有氧原子”等。
在本说明书中，“杂环基”是指在环内具有至少一个杂原子(例如：N、O、S等)的基团，也称为饱和杂环基，或不饱和环基。作为杂原子优选为N或O，杂原子的数目为优选为1个或2个，优选为4～6元环。另外，杂环基任选被烷基，氟烷基，氧代，卤原子取代。作为杂环基，优选例示吡啶基，哌啶基，吗啉代基，吡咯烷基，噁二唑酮基，或氮杂环丁烷基。
在本说明书中，“芳基烷基(芳烷基)”是指同时包含芳基和烷基的基团，例如，上述烷基的至少一个氢原子被芳基取代的基团，优选可列举“C5-C10芳基C1-C6烷基”。可列举例如苄基等。
本说明书中的“亚烷基”是指从上述“烷基”进一步除去1个任意氢原子而衍生的二价基团。作为亚烷基，优选可列举C1-C2亚烷基，C1-C3亚烷基，C1-C4亚烷基，C1-C5亚烷基，C1-C6亚烷基。作为亚烷基具体而言可列举-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，CH(CH3)CH2-，-C(CH3)2-，-(CH2)4-，CH(CH3)CH2CH2-，-C(CH3)2CH2-，-CH2CH(CH3)CH2-，-CH2C(CH3)2-，-CH2CH2CH(CH3)-，-(CH2)5-，-(CH2)6-等。
本说明书中的“杂亚烷基”是指从上述“杂烷基”进一步除去1个任意氢原子而衍生的二价基团，可列举C2-C6杂亚烷基，C2-C5杂亚烷基，C2-C4杂亚烷基，C2-C3杂亚烷基，C2杂亚烷基等。例如，作为在基团中作为杂原子而包含氧原子的杂亚烷基，具体而言可列举-CH2O-，-OCH2-，-CH2OCH2-，-OCH2CH2-，-CH2CH2O-等。
在本说明书中，“亚芳基”是指从上述芳基进一步除去1个任意氢原子而衍生的2价基团。亚芳基可以为单环也可以为稠环。构成环的原子数目没有特别限定，优选为6～10个(C6-C10亚芳基)。作为亚芳基，具体而言可列举例如亚苯基等。
在本说明书中，“杂亚芳基”是指从上述杂芳基进一步除去1个任意氢原子而衍生的2价基团。杂亚芳基可以为单环也可以为稠环。构成环的原子数目没有特别限定，优选为5～10个(5元～10元杂亚芳基)。作为杂亚芳基具体而言可列举咪唑二基，吡啶二基，噁二唑二基，噻唑二基，噻二唑二基等。
在本说明书中，“稠环结构”是指在具有的二个或其以上的环的环式化合物中，有多个环共有2个或其以上的原子的环式结构。“2个以上芳环形成的稠环结构”是指在具有的二个或其以上的芳环的环式化合物中，有多个芳环共有2个或其以上的原子的环式结构。并不意在于限定，作为稠环结构可例示吲哚骨架、苯并呋喃骨架、苯并咪唑骨架、喹啉骨架、二环[4.4.0]癸烷等。
本说明书中，赋予“任选被取代”的修饰语的情况，作为所述取代基，可列举例如，烷基，氟烷基，烷氧基，氟代烷氧基，烯基，烯氧基，炔基，炔氧基，环烷基，芳基，杂芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基，卤原子，硝基，氨基，单烷基氨基，二烷基氨基，氰基，羧基，烷氧基羰基，甲酰基等。
本说明书中的“杂环”是指构成环的原子中优选含有1～5个杂原子的，非芳香族的1价或2价杂环。杂环可以在环中具有双键或三键，环中碳原子可以被氧化而形成羰基，也可以为单环，稠环，螺环。构成环的原子数目优选为3～12个(3～12元杂环)，更优选为4～7个(4～7元杂环)，进一步优选为5～6个(5～6元杂环)。作为杂环具体而言可列举例如，哌嗪，吡咯烷，哌啶，吗啉，均吗啉，(R)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪，(S)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪，3-氧代哌嗪，2-氧代吡咯烷，氮杂环丁烷，2-氧代咪唑烷，氧杂环丁烷，二氢呋喃，四氢呋喃，二氢吡喃，四氢吡喃，四氢吡啶，硫代吗啉，吡唑烷，咪唑啉，噁唑烷，异噁唑烷，噻唑烷，咪唑烷，异噻唑烷，噻二唑啉，噁唑烷酮，苯并二噁烷，苯并噁唑啉，二氧杂环戊烷，二噁烷，四氢硫代吡喃等。
(肽化合物)
在一些方面，本发明涉及肽化合物，所述肽化合物由2个以上的氨基酸连接而成，氨基酸中至少1个(具体而言例如，1个，2个，3个，4个，或其以上)在所述氨基酸的侧链内能够形成氢键。
肽化合物的结构
本发明的“肽化合物”中包括2个以上的氨基酸连接而成的，直链状或环状的肽化合物。需要说明的是，环状肽化合物与“具有环状部的肽化合物”为相同意义。
本说明书中的术语“氨基酸”中包括天然氨基酸及非天然氨基酸。本说明书中的“天然氨基酸”是指，Gly，Ala，Ser，Thr，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，His，Glu，Asp，Gln，Asn，Cys，Met，Lys，Arg，Pro。对非天然氨基酸没有特别限定，可例示：β-氨基酸、D型氨基酸、N取代氨基酸、α，α-二取代氨基酸、侧链与天然氨基酸不同的氨基酸、羟基羧酸等。作为本说明书中的氨基酸，允许为任意立体构型。对氨基酸的侧链的选择不设具体限制，除了氢原子以外，例如可从烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基，环烷基、为螺结合的环烷基中自由选择。可以各自被赋予取代基，对这些取代基也没有限制，例如可从包括：卤原子，O原子，S原子，N原子，B原子，Si原子或P原子的任意取代基中独立地自由选择1个或2个以上。即，可例示任选被取代的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基，环烷基等。另外，本说明书中的氨基酸任选具有作为后述的“能形成分子内氢键的”侧链。在非限定的一个实施方式中，本说明书中的氨基酸为在相同分子内具有羧基和氨基的化合物即可(即使在这种情况下，在氨基酸中也包括亚氨基酸诸如脯氨酸、羟基脯氨酸)。
作为源自卤素的取代基，可列举氟(-F)，氯(-Cl)，溴(-Br)，碘(-I)等。
作为源自O原子的取代基，可列举羟基(-OH)，氧基(-OR)，羰基(-C＝O-R)，羧基(-CO2H)，氧基羰基(-C＝O-OR)，羰氧基(-O-C＝O-R)，硫代羰基(-C＝O-SR)，羰基硫基(-S-C＝O-R)，氨基羰基(-C＝O-NHR)，羰基氨基(-NH-C＝O-R)，氧羰基氨基(-NH-C＝O-OR)，磺酰氨基(-NH-SO2-R)，氨基磺酰基(-SO2-NHR)，氨磺酰氨基(-NH-SO2-NHR)，硫代羧基(-C(＝O)-SH)，羧基羰基(-C(＝O)-CO2H)。
作为氧基(-OR)的例子，可列举：烷氧基，环烷氧基，烯氧基，炔氧基，芳氧基，杂芳氧基，芳烷氧基等。
作为羰基(-C＝O-R)的例子，可列举：甲酰(-C＝O-H)基，烷羰基，环烷基羰基，烯羰基，炔羰基，芳基羰基，杂芳基羰基，芳烷羰基等。
作为氧基羰基(-C＝O-OR)的例子，可列举：烷氧基羰基，环烷氧基羰基，烯氧基羰基，炔氧基羰基，芳氧基羰基，杂芳氧基羰基，芳烷氧基羰基等。
(-C＝O-OR)
作为羰氧基(-O-C＝O-R)的例子，可列举：烷基羰氧基，环烷羰氧基，烯羰氧基，炔羰氧基，芳基羰氧基，杂芳基羰氧基，芳烷羰氧基等。
作为硫代羰基(-C＝O-SR)的例子，可列举：烷基硫代羰基，环烷基硫代羰基，烯基硫代羰基，炔基硫代羰基，芳基硫代羰基，杂芳基硫代羰基，芳烷基硫代羰基等。
作为羰基硫基(-S-C＝O-R)的例子，可列举：烷基羰基硫基，环烷基羰基硫基，烯羰基硫基，炔羰基硫基，芳基羰基硫基，杂芳基羰基硫基，芳烷羰基硫基等。
作为氨基羰基(-C＝O-NHR)的例子，可列举烷基氨基羰基，环烷基氨基羰基，烯基氨基羰基，炔基氨基羰基，芳基氨基羰基，杂芳基氨基羰基，芳烷基氨基羰基等。除了这些以外，可列举-C＝O-NHR中的与N原子结合的H原子进一步被烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基取代而成的化合物。
作为羰基氨基(-NH-C＝O-R)的例子，可列举：烷基羰基氨基，环烷基羰基氨基，烯羰基氨基，炔羰基氨基，芳基羰基氨基，杂芳基羰基氨基，芳烷羰基氨基等。除了这些以外，可列举-NH-C＝O-R中的与N原子结合的H原子进一步被烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基取代而成的化合物。
作为氧基羰基氨基(-NH-C＝O-OR)的例子，可列举：烷氧羰基氨基，环烷氧羰基氨基，烯氧基羰基氨基，炔氧基羰基氨基，芳氧基羰基氨基，杂芳氧基羰基氨基，芳烷氧基羰基氨基等。除了这些以外，可列举-NH-C＝O-OR中的与N原子结合的H原子进一步被烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基取代而成的化合物。
作为磺酰氨基(-NHSO2-R)的例子，可列举：烷基磺酰氨基，环烷基磺酰氨基，烯基磺酰氨基，炔基磺酰氨基，芳基磺酰氨基，杂芳基磺酰氨基，芳烷基磺酰氨基等。除了这些以外，可列举-NH-SO2-R中的与N原子结合的H原子进一步被烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基取代而成的化合物。
作为氨基磺酰基(-SO2-NHR)的例子，可列举：烷基氨基磺酰基，环烷基氨基磺酰基，烯基氨基磺酰基，炔基氨基磺酰基，芳基基氨基磺酰基，杂芳基氨基磺酰基，芳烷基氨基磺酰基等。除了这些以外，可列举-SO2-NHR中的与N原子结合的H原子进一步被烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基取代而成的化合物。
作为氨磺酰基氨基(-NHSO2-NHR)的例子，可列举：烷基氨磺酰基氨基，环烷基氨磺酰基氨基，烯基氨磺酰基氨基，炔基氨磺酰基氨基，芳基氨磺酰基氨基，杂芳基氨磺酰基氨基，芳烷基氨磺酰基氨基等。并且，-NH-SO2-NHR中的与N原子结合的2个H原子可以被独立选自由烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，及芳烷基组成的组中的取代基取代，另外，这些中的2个取代基也可以形成环。
作为源自S原子的取代基，可列举硫醇(-SH)，硫代(-S-R)，亚磺酰基(-S＝O-R)，磺酰基(-S(O)2-R)，磺基(-SO3H)。
作为硫基(-S-R)的例子，可以选自烷基硫基，环烷硫基，烯硫基，炔硫基，芳硫基，杂芳硫基，芳烷硫基等。
作为亚磺酰基(-S＝O-R)的例子，可列举烷基亚磺酰基，环烷基亚磺酰基，烯基亚磺酰基，炔基亚磺酰基，芳基亚磺酰基，杂芳基亚磺酰基，芳烷基亚磺酰基等。
作为磺酰基(-S(O)2-R)的例子，可列举：烷基磺酰基，环烷基磺酰基，烯基磺酰基，炔基磺酰基，芳基磺酰基，杂芳基磺酰基，芳烷基磺酰基等。
作为源自N原子的取代基，可列举叠氮(-N3，也称为“叠氮基”)，氰基(-CN)，伯氨基(-NH2)，仲氨基(-NH-R)，叔氨基(-NR(R′))，脒基(-C(＝NH)-NH2)，取代脒基(-C(＝NR)-NR′R″)，胍基(-NH-C(＝NH)-NH2)，取代胍基(-NR-C(＝NR″′)-NR′R″)，氨基羰基氨基(-NR-CO-NR′R″)。
作为仲氨基(-NH-R)的例子，可列举烷基氨基，环烷基氨基，烯基氨基，炔基氨基，芳基氨基，杂芳基氨基，芳烷基氨基等。
作为叔氨基(-NR(R′))的例子，可列举例如：烷基(芳烷)氨基等具有各自独立地选自烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷等中的任意2个取代基的氨基，这些中的任意2个取代基也可以形成环。
作为取代脒基(-C(＝NR)-NR′R″)的例子，可列举N原子上的3个取代基R、R′及R″为从烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基中各自独立地选择的基团，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。
作为取代胍基(-NR-C(＝NR″′)-NR′R″)的例子，可列举R、R′、R″及R″′为从烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基中各自独立地选择的基团，或者由这些基团形成环而成的基团等。
作为氨基羰基氨基(-NR-CO-NR′R″)的例子，可列举R、R′及R″为从氢原子，烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基中各自独立地选择的基团，或者由这些基团形成环而成的基团等。
作为源自B原子的取代基，可列举硼基(-BR(R′))、二氧硼基(-B(OR)(OR′))等。这2个取代基R及R′可以从烷基，环烷，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基等中各自独立地选择、或者它们也可以形成环。
一般而言，氨基酸是指在分子内分别具有1个以上的氨基和羧基的分子，在本说明书中，本发明的氨基酸中也可以包括分子内具有羟基和羧基的羟基羧酸。在本说明书中，也存在将羟基羧酸称为羟基氨基酸的情况。
α氨基酸指氨基酸分子内的氨基和羧基结合的碳是同一个，将在该碳上的取代基称为氨基酸的侧链。将氨基酸分子内的氨基，羧基，及由这些基团结合的碳这一系列的部分称为氨基酸的主链。
氨基酸的主链氨基可以是非取代的(NH2基)，可以是被取代的(即，-NHR基：R表示任选具有取代基的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，芳烷基，环烷基，另外，也可以是脯氨酸那样，与N原子结合的碳链与α位的碳原子形成环。)。将这样的主链氨基发生了取代的氨基酸，在本说明书中称为“N取代的氨基酸”。作为本说明书中的“N取代氨基酸”，优选例示为N-烷基氨基酸，N-C1-C6烷基氨基酸，N-C1-C4烷基氨基酸，N-甲基氨基酸，具有“能形成分子内氢键的”侧链的N取代氨基酸，但不限于这些。
在本说明书中构成肽化合物的“氨基酸”中，包括各自对应的全部同种型。“氨基酸”的同种型，为有至少1个原子被原子编号(质子数)相同且质量数(质子和中子的数目之和)不同的原子取代而成。作为构成本发明的肽化合物的“氨基酸”中包含的同种型的例子，有：氢原子，碳原子，氮原子，氧原子，磷原子，硫原子，氟原子，氯原子等，分别包括：2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、、32P、35S、18F、36Cl等。
本发明的“直链状肽化合物”为天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键或者酯键连接而形成的那些，只要是不具有环状部的化合物即可，没有特别限定。构成直链状肽化合物的天然氨基酸或者非天然氨基酸的总数可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30个，优选的范围为6～20个，7～19个，7～18个，7～17个，7～16个，7～15个，8～14个，9～13个。
本发明的“环状肽化合物”为天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键或者酯键连接而形成的那些，只要是具有环状部的化合物即可，没有特别限定。构成环状肽化合物的天然氨基酸或者非天然氨基酸的总数可以为，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30个，优选范围为6～20个，7～19个，7～18个，7～17个，7～16个，7～15个，8～14个，9～13个。
在本说明书中，肽化合物的“环状部”是指2个以上的氨基酸残基发生连接而形成的环状的部分。再者，在本说明书中，述及环状肽化合物的部分结构时使用的“直链部”，是指不包含在环状部的主链结构中的部分，并且在该部分的链上至少具有一个酰胺键和/或酯键。
构成本说明书的环状肽化合物的环状部的氨基酸数目没有限制，可列举例如，2个以上，3个以上，4个以上，6个以上，7个以上，8个以上，9个以上，10个以上，11个以上，12个以上，30个以下，20个以下，18个以下，16个以下，15个以下，14个以下，13个以下，12个以下，11个以下，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，及16个。如果考虑膜透过性和代谢稳定性的并存，则构成上述环状部的氨基酸数目优选为2～30个，2～15个或5～15个，更优选为5～14个，7～14个或8～14个，更优选8～13个，9～13个，8～12个，8～11个或9～12个，特别优选9～11个。
在非限定的一个实施方式中，直链部的氨基酸数目(单元的数目)优选为0～8个，更优选0～5个，更优选为0～3个。需要说明的是，在非限定的一个实施方式中，在本说明书的“直链部”中，存在包括天然氨基酸、非天然氨基酸(包括经化学修饰、骨架转换而成的氨基酸)的情况。
在非限定的一种实施方式中，本说明书的肽化合物或环状肽化合物优选在环状部或直链部不具有酯键的那些。
在非限定的一种实施方式中，对本说明书的环状肽化合物而言，可以为在环状部或直链部的肽部位的侧链不具有选自由以下(A)～(C)组成的组中的至少一个的环状肽化合物：
(A)吲哚骨架；
(B)由2个以上的芳环形成的稠环结构；
(C)无取代的羟基苯基。
之中，优选为在环状部的侧链不具有上述(A)，(C)的环状肽化合物，更优选在环状部的侧链不具有上述(B)，(C)的环状肽化合物。上述“由2个以上的芳环形成的稠环结构”可以为“稠环结构”。
在非限定的一种实施方式中，本说明书的环状肽化合物的分子量可为500～2000。
在非限定的一种实施方式中，本说明书的环状肽化合物可以为，在环状部或直链部的肽部位的侧链中不具有选自由(A)甲基硫基及(B)硫羟基组成的组中的至少一个或两者的环状肽化合物。
在本发明中，当2个氨基酸通过酰胺键形成肽化合物时，通过第一氨基酸中的主链的羧基的OH基被第二氨基酸中的主链的氨基的氮原子部分取代，从而可形成肽化合物。
在本发明中，当2个氨基酸通过酯键形成肽化合物时，通过第一氨基酸中主链的羧基的OH基被第二羟基氨基酸中主链的羟基的氧原子部分取代，从而可形成肽化合物。
在本发明中，当天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键或者酯键进行连接，从而形成肽化合物时，2个以上的氨基酸通过酰胺键和/或酯键连续进行结合，从而可形成肽化合物。
在本说明书中的肽化合物中，通过酰胺键和/或酯键连接的部位在本说明书中也称为“肽部位”。其中，在肽化合物为环状的情况下，环化部的结合方式不限于酰胺键、酯键。作为环化部的结合方式，可列举例如，酰胺键，碳-碳键，二硫键，酯键，硫酯键，硫醚键，内酰胺键，经由三唑结构的键，经由荧光团结构的键等共价键，这些中，因为代谢稳定性高而优选酰胺键。即，一种实施方式中，本说明书的环状肽化合物优选在环化部具有酰胺键。“环化部的结合方式”，是指通过环化反应而形成了环化的部位的结合方式。
作为本发明的“肽化合物”可以为直链或环状肽，所述直链或环状肽在上述的天然氨基酸及非天然氨基酸的总数的条件基础上或独立于该条件地，包含至少2个(优选为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30个，特别优选为5，6或7个，优选范围为2～30个，3～30个，6～20个，7～19个，7～18个，7～17个，7～16个，7～15个，8～14个，9～13个)N取代氨基酸，并包含至少1个未N取代的氨基酸。作为“N取代”可列举与N原子结合的氢原子被甲基，乙基，丙基，丁基，己基取代等，但不限于这些。作为N取代氨基酸，优选可列举在天然氨基酸中包含的氨基被N-甲基化，N-乙基化，N-丙基化，N-丁基化，N-戊基化而成的氨基酸，称它们为N-甲基氨基酸，N-乙基氨基酸，N-丙基氨基酸，N-丁基氨基酸，N-戊基氨基酸。将N未取代氨基酸转换为N取代氨基酸称为N取代化，也称为N-烷基化，N-甲基化，或N-乙基化。作为本发明的肽化合物中包含的N取代氨基酸数目的比例，可例示构成肽化合物的总氨基酸数目的30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上。
在非限定的一种实施方式中，本说明书的环状肽化合物的肽部位中包含的N取代氨基酸的数目可例示优选为2以上或3以上，更优选为4以上，5以上，或6以上，进一步优选为7以上，特别优选为8以上，另外优选为20以下，15以下，14以下，13以下，12以下，10以下，9以下。作为本说明书的环状肽化合物中包含的N取代氨基酸的数目，可例示构成环状部的氨基酸的数目的30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上。这里所述N取代的氨基酸，可以优选为N-烷基氨基酸，更优选为N-甲基氨基酸。即，非限定的一种实施方式中，上述N取代氨基酸的数目作为N-烷基氨基酸的数目，或N-甲基氨基酸的数目而例示。构成环状部的氨基酸的数目为8的情况下，N取代氨基酸的数目优选为3～7。构成环状部的氨基酸的数目为9的情况下，N取代氨基酸的数目优选为3～8。构成环状部的氨基酸的数目为10的情况下，N取代氨基酸的数目优选为3～8。构成环状部的氨基酸的数目为11的情况下，N取代氨基酸的数目优选为4～9。构成环状部的氨基酸的数目为12的情况下，N取代氨基酸的数目优选为4～10。构成环状部的氨基酸的数目为13的情况下，N取代氨基酸的数目优选为4～11。构成环状部的氨基酸的数目为14的情况下，N取代氨基酸的数目优选为5～12。
在本说明书中，有时也将构成肽化合物的“氨基酸”称为“氨基酸残基”。
在本说明书中的“肽化合物”中，也可以包括其药学上允许的盐、或它们的溶剂合物。
在本说明书中，术语“侧链”于氨基酸的侧链，或环状肽化合物的环状部的侧链等上下文中使用，指不包含在各自主链结构中的部分。
在本说明书中，“氨基酸数目”是指构成肽化合物的氨基酸残基(氨基酸单元)的数目，是指切割连接氨基酸的酰胺键、酯键、及环化部的键时产生的氨基酸单元的数目。
肽化合物的膜透过性
在非限定的一种实施方式中，对本说明书中的肽化合物或环状肽化合物而言，可以为为了实现较高膜透过性，不具有在中性(例如pH＝7.0)下极度发生离子化的官能团的环状肽化合物。本说明书中使用的pKa在没有另外说明的情况下指实测值的pKa。另外，通过后述ADMETPredictor求出的pKa值称为计算pKa。本说明书中使用的碱性pKa在没有另外说明的情况下指实测值的碱性pKa。另外，将利用后述的ADMETPredictor求出的碱性pKa值称为碱性计算pKa。
pKa及碱性pKa可以通过常规方法求出。可以通过例如实验化学讲座5“热的测定及平衡”，460页(日本化学会编，丸善株式会社发行)所述的方法等测定。更具体而言，可利用参考例3-1中记载的方法测定。另外，在制备测定的氨基酸的侧链的pKa值、及碱性pKa值受到其它官能团的影响而难于求出时，可以以能够仅测定目标的官能团的pKa、及碱性pKa的测定方式，将适当的其它官能团利用保护基等保护后而测定。
在本说明书中，“酸性侧链”是指pKa为10以下的侧链，“碱性侧链”是指碱性pKa为4以上的侧链。在本说明书中，将pKa超过10的侧链、碱性pKa低于4的侧链定义为中性侧链。
在非限定的一种实施方式中，本说明书中的肽化合物或环状肽化合物中，除了具有能进行氢键的侧链的氨基酸以外，可以包含具有不形成分子内氢键的酸性侧链的氨基酸。在该情况下，该酸性侧链的pKa可以为3.5～10。上述酸性侧链的pKa优选为3.5以上，更优选3.9以上，更优选4.5以上，更优选5.0以上，更优选5.5以上，更优选5.7以上。另外，上述碱性pKa优选为10以下。作为上述pKa的范围，优选例示为3.5～10，3.9～10，4.5～10，5.0～10，或5.5～10，5.7～10。当这些pKa以计算值表示时，计算pKa优选为3.5以上，更优选4.5以上，5.0以上，5.4以上，8.0以上，8.3以上。另外，计算pKa优选为10以下。作为上述计算pKa的范围，优选例示为3.5～10，4.5～10，5.0～10，5.4～10，8.0～10，或8.3～10。
在非限定的一种实施方式中，本说明书中的肽化合物或环状肽化合物中除了具有能进行氢键的侧链的氨基酸以外，可以包含具有不形成分子内氢键的碱性侧链的氨基酸。在该情况下，该碱性侧链的碱性pKa可以为4.0～10。上述碱性侧链的碱性pKa优选为10以下，更优选9.5以下，9.0以下，8.5以下，7.5以下，或7.2以下，特别优选6.5以下。另外，上述碱性pKa优选为4.0以上。作为上述碱性pKa的范围，优选例示为4.0～10，4.0～9.5，4.0～9.0，4.0～8.5，4.0～7.5，4.0～7.2，4.0～6.5。当这些碱性pKa以计算值表示时，碱性计算pKa优选为10以下，更优选9.5以下，9.0以下，8.8以下，8.6以下，8.5以下，7.5以下，或6.5以下。另外，上述碱性计算pKa优选为4.0以上。作为上述碱性计算pKa的范围，优选例示为4.0～10，4.0～9.5，4.0～9.0，4.0～8.8，4.0～8.6，4.0～8.5，4.0～7.5，4.0～6.5。
并不意在于限定，如后述的参考例所示，在肽部位的侧链中包含的芳环数目或比例，可对于环状肽化合物的膜透过性造成影响。当肽部位的侧链中包含的芳环数目或比例超过一定数值时，可得到具有较高膜透过性的化合物的概率可能降低。即，芳环数目对膜透过性造成负的影响。
在本说明书中，在涉及发明效果的上下文中使用的“负的影响”指会抵消发明效果的影响。例如，当将原本应该发挥的发明效果作为100％的情况下，可将使该效果成为30％，20％、10％，或5％以下的情况作为存在“负的影响”。
在非限定的一种实施方式中，为了高膜透过性，本说明书的环状肽化合物的肽部位的侧链中包含的芳环数目优选为5以下，优选例示为0，1，2，或3，作为优选范围可例示0～3，1～3。另外，作为在构成肽部位的氨基酸的数目中，肽部位的侧链中包含的芳环数目占的比例，优选为40％以下，优选例示为35％以下，30％以下，27％以下，25％以下，20％以下。
本说明书中的“芳环数目”(也称为“Aromatic Ring Count”(ARC))是指环状肽化合物的肽部位的侧链中包含的芳环数目，例如，将苯酚基数作1个，二环式稠环如吲哚骨架数作2个，三环式稠环如蒽数作3个。
在非限定的一种实施方式中，为了高膜透过性，本说明书的环状肽化合物中可以包含的芳环数目方面具有限制，另一方面，在包含能形成分子内氢键的侧链的氨基酸中，优选存在可有助于与靶分子的结合的部位：环状部。即，在一种实施方式中，本说明书中的肽化合物为环状肽化合物，且在该环状肽化合物的环状部中含有在能形成分子内氢键的侧链上包含芳环的氨基酸，在该种情况下，作为肽化合物的环状部中包含的芳环数目可例示1，2，或3，作为芳环数的范围可例示1～3或2～3，其中，所述氨基酸。另外，在本说明书中的肽化合物为环状肽化合物，且该环状肽化合物的环状部中含有在能形成分子内氢键的侧链上包含芳环的氨基酸，在该种情况下，作为在肽化合物中包含芳环的总数中环状部中包含的芳环数目占的比例可例示30％以上，40％以上，60％以上，80％以上，或100％。
本发明中肽化合物的膜透过性可以根据国际公开第2018/124162号中记载的膜透过性的测定方法测定。
在非限定的一种实施方式中，本发明的肽化合物的Papp优选为1.0×10-7cm/秒以上，5.0×10-7cm/秒以上，8.0×10-7cm/秒以上，更优选9.0×10-7cm/秒以上，进一步优选1.0×10-6cm/秒以上，特别优选3.0×10-6cm/秒以上。
除非另有说明，本说明书中的“膜透过系数(Papp)”指使用国际公开第2018/124162号中记载的测定方法(改良法)测定的值。
在非限定的一种实施方式中，本说明书的环状肽化合物的ClogP优选为4以上，更优选5以上，进一步优选6以上，特别优选8以上，优选例示为18以下，17以下，16以下，可例示4～18，5～17，及6～16。本说明书中的ClogP为用计算机计算的分配系数，可以使用Daylight Chemical Information Systems，Inc.的Daylight Version 4.9计算。
在非限定的一个方式中，作为本说明书的环状肽化合物的ClogP/总aa的下限优选为1.0以上，更优选1.1以上，进一步优选1.2以上。另外，作为ClogP/总aa的上限优选1.8以下，1.7以下，1.6以下，1.5以下。作为ClogP/总aa的范围，可例示1.0～1.8，1.0～1.7，1.1～1.6，及1.1～1.5。本说明书中的“总aa”(也表述为“总AA”)是指构成肽化合物的肽部位的氨基酸的数目。例如，环状部包含10个氨基酸，直链部包含1个氨基酸的环状肽化合物的总aa为11。在本说明书中，ClogP/总aa通过将ClogP除以总aa而算出。
肽化合物的代谢稳定性
在非限定的一种实施方式中，本说明书中的肽化合物优选具有良好的代谢稳定性。为了良好的代谢稳定性，优选肽化合物中包含的氨基酸数目为8个以上、更优选9个以上，进一步优选11个以上。另外，在一个实施方式中，优选不具有可能容易被氧化的硫醚键。另外，在一个实施方式中，由于容易被氧化而可能成为代谢稳定性的妨碍，优选不具有甲硫基。
(能形成分子内氢键的氨基酸)
在非限定的一种实施方式中，本发明的肽化合物包含至少1个，具体而言例如1个，2个，3个，4个或其以上的在侧链内可以形成氢键(即，分子内氢键)的氨基酸。
在本说明书的氨基酸的侧链中，包括与氨基酸中包含的碳原子(例如，α，β，或γ-碳原子)结合的链，及与氮原子结合的链。本说明书中，氨基酸的侧链的长度可以通过参考例1中记载的方法求出。即，可以通过将氨基酸单位的N末端利用乙酰基，C末端利用甲基氨基加帽，通过分子建模软件MOE(Chemical Computing Group公司)的LowModeMD使其产生构象，测定离侧链部位结合的原子(为天然氨基酸的情况，为α-碳原子(Cα碳))最远的同一侧链的原子(不包括氢原子)的距离而求出。
在本说明书中，“长侧链”是指长度5.4埃以上的侧链。为了分子内氢键，氨基酸的侧链优选为长侧链。作为长侧链的长度，优选为5.4埃以上，更优选5.6埃以上，更优选5.8埃以上，特别优选6.0埃以上。上述侧链的长度的上限没有特别限定，可例示：20埃以下、15埃以下、13埃以下、12埃以下、11埃以下、10埃以下、9.0埃以下、8.8埃以下、8.5埃以下、及8.0埃以下。作为上述长侧链的长度的范围，可例示5.4～20埃，6.0～20埃，6.0～15埃，6.0～13埃，6.0～10埃。
在非限定的一种实施方式中，对“长侧链”而言，(i)优选为在其侧链上不包含酰胺键或包含1个酰胺键的侧链，(ii)也可以为其侧链上不包含酰胺键的侧链。即，在非限定的一种实施方式中，优选可例示在环状部具有如下氨基酸的环状肽化合物，所述氨基酸在其侧链中不具有2个以上的酰胺键，且具有长度为6.0～11埃的长侧链。本说明书中的长侧链可以具有芳环，也可以不具有。
在非限定的一种实施方式中，能形成分子内氢键的氨基酸优选为长侧链的氨基酸。
有无分子内氢键可通过例如X射线结构分析、利用1H NMR的化学位移进行辨别。通常而言，认为温度依赖性化学位移变化量＜2ppb/K时发生明显的氢键，当＞4ppb/K时，不发生氢键。另外，如实施例3例示的基于计算化学的构象分析也是用于判断是否可能形成分子内氢键的办法。
一些方面中，本发明的肽化合物在其侧链内包含至少1个，具体而言例如，1个，2个，3个，4个，或其以上的能形成伪W元环的氨基酸。
本说明书中的“伪W元环”是指虽然不具有由共价键形成的环状结构，但通过分子内氢键使构象固定而由此形成伪的环状结构。“W”为表示选自3以上的自然数的环的大小，在构成伪的环状部分的原子中必须包含这3个原子：为质子供体的氢原子，及与该氢原子直接结合的原子，与质子供体能够形成氢键的质子受体。表示拟环状结构的环状结构的环的大小的W为3以上即可，优选为4～7，或5～7，进一步优选为5～6。在下文中例示的Ser(nPrOH)的侧链部分结构的情况中，为质子供体的羟基的氢原子，及与该氢原子直接结合的羟基的氧原子，为质子受体的醚基的氧原子分别符合上述3个原子，而形成了伪6元环。另外，分子内氢键的特征是与周边的环境配合而能够结构转换为环化体和非环化体，可以期待具有官能团的化合物的膜透过性的提高，所述官能团在生物体膜中那样疏水性的环境中形成将质子供体掩蔽那样的环化体结构，由此形成分子内氢键。一方面，在例示作为靶分子的抑制剂，某化合物与该靶分子结合的情况时，可期待具有形成分子内氢键的官能团的该化合物形成非环化体结构，由此质子供体和质子受体中的两者或者任一者与该靶分子结合，使得该化合物和靶分子之间能够更有效地形成分子间氢键。下列作为其1例而记载能进行分子内氢键的结构的一部分与靶分子的酰胺部位形成分子间相互结合的模式图(*表示与Ser(nPrOH)的α碳的结合点，**，及***分别表示与靶分子的蛋白的结合点)。
Ser(nPrOH)的侧链部分结构
在非限定的一种实施方式中，具有能进行分子内氢键的侧链氨基酸，可以在其形成分子内氢键的部分结构中形成伪4～7元环，优选为形成伪5～7元环，特别优选形成伪5～6元环。
在非限定的一种实施方式中，本说明书中，作为能形成分子内氢键的结构可例示下列(*表示与式1的Q1，或式2的Q2的结合点)。
在非限定的一种实施方式中，在侧链内能够形成氢键的氨基酸可以由下述式A表示。
一些方面中，式(A)中，R1为氢或C1-C6烷基，或以式1或式2表示的基团，在该情况下，(a)R2A及R2B中，R2A为氢或C1-C6烷基，或以式1或式2表示的基团，且R2B为氢或C1-C6烷基，或者(b)R2A及R2B与它们结合的碳原子共同形成4～6元环。R1为C1-C6烷基的情况下，作为R1优选为甲基。R2B为C1-C6烷基的情况下，R2B优选为甲基。另外，R2B为C1-C6烷基的情况下，R2A优选为以式1或式2表示的基团，或C1-C6烷基。另外，在R2A及R2B与它们结合的碳原子共同形成4～6元环情况下，作为该4～6元环，优选环丙基，环丁基，环戊基，环己基。
在另一方面，式(A)中，R1，与R1结合的氮原子，R2A，及与R2A结合的碳原子共同形成4～6元杂环，在该情况下，R2B为氢或C1-C6烷基。R2B为C1-C6烷基的情况下，R2B优选为甲基。上述4～6元杂环任选具有选自由以式1或式2表示的基团，-OH，及烷氧基组成的组中的1个或多个取代基。另外，作为上述4～6元杂环优选为吡咯烷(即，脯氨酸样结构)。
作为R1，R2A，R2B的组合，当R2A为以式1或式2表示的基团的情况下，优选R1为氢或C1-C6烷基，且R2B为氢或C1-C6烷基，该C1-C6烷基优选为甲基。另外，在R1为如式1或式2表示的基团的情况下，优选为R2A为氢或C1-C6烷基，且R2B为氢，C1-C6烷基，或者R2A和R2B共同形成4～6元环，其中该C1-C6烷基优选为甲基。
式(A)中，R3为单键或-CHR4-，其中R4为氢或C1-C4烷基，或以式1或式2表示的基团。R3为-CHR4-的情况下，作为R4优选为氢，或以式1或式2表示的基团。
式(A)中，可以包含2种以上以式1和/或式2表示的基团，优选仅包含以式1或式2表示的基团中任一种。作为包含以式1或式2表示的基团中任一种的实施方式，具体而言例如可列举下列。
(i)R1为以式1或式2表示的基团，R2A为氢或C1-C6烷基，优选为氢，R2B为氢或C1-C6烷基，优选为氢，R3为单键或-CHR4-，R4为氢或者C1-C4烷基，优选为氢。
(ii)R1为氢或C1-C6烷基，R2A为以式1或式2表示的基团，R2B为氢或C1-C6烷基，优选为氢，R3为单键或-CHR4-，优选为单键，R4为氢或者C1-C4烷基，优选为氢。
(iii)R1为氢或C1-C6烷基，R2A为氢或C1-C6烷基，优选为氢，R2B为氢或C1-C6烷基，优选为氢，R3为-CHR4-，R4为以式1或式2表示的基团。
(iv)R1，与R1结合的氮原子，R2A，及与R2A结合的碳原子共同形成4～6元杂环(优选为吡咯烷环)，该杂环具有以式1或式2表示的基团，R2B为氢或C1-C6烷基，优选为氢，R3为单键或-CHR4-，优选为单键，R4为氢或者C1-C4烷基，优选为氢。
式1及式2分别以下述式表示：
式中*表示结合点。以式A表示的氨基酸中包含至少1个以式1或式2表示的基团中的任一个。例如，以式A表示的氨基酸中可以包含以式1或式2表示的基团中的任一种，在该情况下，式A中R1，R2，或R4中的任一项为以式1或式2表示的基团。
式1中，Q1为单键，C1-C4亚烷基，或包含1个氧原子的C2-C4杂亚烷基。Q1为C1-C4亚烷基的情况下，作为Q1优选为-CH2-或-(CH2)2-。
式1中，A1为-O-，或-S-，优选为-O-。
式1中，L1为任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基。作为L1具体而言可列举-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-CH2CH(CH3)-，-CH2CH(CF3)-，-CH2C(CH3)2-，-(CH2)2CH(CH3)-，-CH2C(CH3)2CH2-，-(CH2)2C(CH3)2-，-CH2CO-等。一些方面中，L1优选为不是非取代的-(CH2)2-。
式1中，X为-OH，-NRZ1RZ2，或-CONRZ1RZ2，或任选被氧代或者1个或多个卤素取代的，含有1～3个杂原子的5～6元的饱和或者不饱和杂环基，其中RZ1及RZ2独立地选自由氢，-OH，C1-C4烷基，及C1-C4烷基磺酰基组成的组。X为-NRZ1RZ2-的情况下，X优选为-NH2，-NHMe，-NHEt，-NH(nPr)，-NH(iPr)，-NH(tBu)。X为-CONRZ1RZ2-的情况下，X优选为-CONH2，-CONHMe，-CONHEt，-CONH(nPr)，-CONH(iPr)，-CONH(tBu)。另外，X为任选被氧代或者1个或多个卤素取代的5～6元的饱和或者不饱和杂环基的情况下，作为该饱和或者不饱和杂环基优选为4，5-二氢-1，2，4-噁二唑基，4，5-二氢-1，2，4-噻二唑基，吡咯烷基，作为X优选为以下基团：
作为这样的-Q1-A1-L1-X的优选组合，具体而言可列举下列。
(i)Q1为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，A1为-O-或-S-，优选为-O-，L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，X为-OH。
(ii)Q1为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，A1为-O-或-S-，优选为-O-，L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，优选为-CH2-，X为-NRZ1RZ2，RZ1为C1-C4烷基，RZ2为氢。
(iii)Q1为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，A1为-O-或-S-，优选为-O-，L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，优选为-CH2-，X为-CONRZ1RZ2，RZ1为C1-C4烷基，RZ2为氢。
(iv)Q1为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，A1为-O-或-S-，优选为-O-，L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，优选为-CH2-，X为任选被氧代或者1个或多个卤素(优选为氟)取代的，含有1～3个杂原子的5～6元的饱和或者不饱和杂环基。
(v)Q1为单键，A1为-O-或-S-，优选为-O-，L1为任选被选自由C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，X为-OH。
式2中，Q2为单键，C1-C4亚烷基，或包含1个氧原子的C2-C4杂亚烷基。Q2为C1-C4亚烷基的情况下，作为Q2优选为-CH2-或-(CH2)2-。
式2中，L2为单键或任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基。作为L2具体而言可列举单键，-CH2-，-CO-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-CH2CH(CH3)-，-CH2CH(CF3)-，-CH2C(CH3)2-，-(CH2)2CH(CH3)-，-CH2C(CH3)2CH2-，-(CH2)2C(CH3)2-，-CH2CO-等。
式2中，Y为-OH，C1-C4烷基磺酰氨基，-NRZ3RZ4，或-CONRZ3RZ4，或任选被氧代或者卤素取代的，含有1～3个杂原子的5～6元的饱和或者不饱和杂环基，其中RZ3及RZ4独立地选自由氢，-OH，C1-C4烷基，及C1-C4烷基磺酰基组成的组。Y为-NRZ3RZ4-的情况下，Y优选为-NH2，NHMe，NHEt，NH(nPr)，NH(iPr)，NH(tBu)。另外，Y为C1-C4烷基磺酰氨基的情况下，Y优选为甲基磺酰氨基。再者另外，Y为C1-C4烷基磺酰氨基的情况下，L2优选为-CO-。
式2中，A2为单键，-O-，或-S-，优选为-O-。
式2中，Z为氢或C1-C4烷基，在Z为C1-C4烷基的情况下，作为该C1-C4烷基优选为甲基。
式2中，在A2为-O-，或-S-的情况下，Z不为氢。即，作为-A2-Z，具体而言A2为单键且Z为氢，或A2为-O-且Z为C1-C4烷基，或A2为-S-且Z为C1-C4烷基。
作为这样的-Q2-，-L2-Y，及-A2-Z的优选组合，具体而言可列举下列。
(i)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，优选为-CO-，Y为-NRZ3RZ4，优选为甲基氨基，-N(OH)Me，或-NH(OH)，A2为-O-，或-S-，优选为-O-，Z为C1-C4烷基，优选为甲基。
(ii)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为单键，Y为-CONRZ3RZ4，优选为甲基氨基羰基或-CON(OH)Me，或-CONH(OH)，A2为-O-，或-S-，优选为-O-，Z为C1-C4烷基，优选为甲基。
(iii)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，优选为-CO-，Y为-NRZ3RZ4，优选为-N(OH)Me，A2为单键，Z为氢。
(iv)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为单键，Y为-CONRZ3RZ4，优选为-CON(OH)Me，A2为单键，Z为氢。
(v)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为任选被选自由氟，C1-C2烷基，C1-C2氟代烷基，及氧代(＝O)组成的组中的1个或多个取代基取代的直链C1-C3亚烷基，优选为-CO-，Y为C1-C4烷基磺酰氨基，优选为甲基磺酰氨基，A2为-O-，或-S-，优选为-O-，Z为C1-C4烷基，优选为甲基。
(vi)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为单键，Y为C1-C4烷基磺酰氨基羰基，优选为甲基磺酰氨基羰基，A2为-O-，或-S-，优选为-O-，Z为C1-C4烷基，优选为甲基。
(vii)Q2为C1-C4亚烷基，优选为-CH2-，L2为单键，Y为-OH，A2为-O-，或-S-，优选为-O-，Z为C1-C4烷基，优选为甲基。
作为这些在侧链内能够形成氢键的氨基酸，和/或在侧链内能够形成伪4～元环的氨基酸，更具体而言可列举以下氨基酸。
在非限定的一种实施方式中，在肽化合物中包含本发明的以式A表示的氨基酸的情况下，优选通过该氨基酸的主链的氨基及羧基与相邻的氨基酸连接。在该情况下，以式(A)表示的氨基酸也可以如下表示(*表示在肽化合物中，与相邻的氨基酸的结合点)。
在非限定的一种实施方式中，本发明涉及保护氨基酸，其中，上述能形成分子内氢键的氨基酸的氨基，和/或羧基被保护基保护。作为保护氨基酸的氨基的保护基，可列举Fmoc基，Boc基，Cbz基，Alloc基，nosyl基，dinitronosyl基，t-Bu基，三苯甲基，异丙苯基等。另外，作为保护氨基酸的羧基的保护基，可列举甲基，烯丙基，t-Bu基，三苯甲基，异丙苯基，甲氧基三苯甲基，苄基等。可以通过例如“Greene’s，“Protective Groups in OrganicSynthesis″(第5版，John Wiley&Sons 2014)”中记载的方法导入这些保护基。
无意用特定的理论进行限制，本发明人有如下思考。当作为用氢键掩蔽在肽中包含的氨基酸的侧链上的质子的方法，使用在肽的主链中包含的酰胺键时，形成掩蔽侧链上的质子的氢键不得不依靠偶然，因为肽的构象因每个肽而不同。因此，难以通过氢键的形成始终掩蔽侧链的质子。另外，在利用相邻的氨基酸的主链中包含的酰胺键形成掩蔽侧链的质子的氢键的情况下，能够采用的侧链的变体会受到限制。在假设与相邻的氨基酸的主链中包含的酰胺键形成氢键的氨基酸的情况下，成为质子供体的位置被限定在与能够形成氢键的主链的酰胺键接近的位置。另一方面，在非限定的一种实施方式中，本说明书的氨基酸由于能够在其“侧链内”形成氢键，因此，可提高侧链设计的自由度。例如，也能够在保持可掩蔽质子的氢键的形成同时加长侧链，可提高侧链上的质子在与目标的相互作用中得以使用的可能性。
(通常的制备方法)
下面对本发明的在侧链内能够形成氢键的氨基酸，及肽化合物的一般制备方法进行说明。
(能形成分子内氢键的氨基酸的制备方法)
在侧链中具有分子内氢键的氨基酸的制备中，关于在侧链中具有醚键的氨基酸，可以通过以下2种合成法制备。
制法1：
在Lewis酸存在下，将具有被保护的氨基和羧酸基的氮丙啶的化合物与具有相应的适当的保护基的醇反应，进行开环反应，之后进行不需要的保护基的脱保护。在下述通式中，可以作为P1使用Cbz基，Fmoc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等，作为P2使用Me基，烯丙基，苄基等。作为开环反应中使用的Lewis酸，优选例示为催化剂量的BF3·OEt2。溶剂优选例示为二氯甲烷，作为试剂使用的醇(ROH)也能够用作溶剂。当在R上含有可能参与反应的官能团的情况下，优选将该官能团在Lewis酸存在下用稳定的保护基进行保护。例如优选当R包含羟基时，用苄基等对该羟基进行保护，当包含仲氨基时用Alloc基等对该氨基进行保护。在通过开环反应构建氨基酸的基本骨架之后，可以通过进行保护基的适当的转换，由此转换为期望的氨基酸(P3被Cbz基，Fmoc基，Boc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等保护的氨基酸，或者P3为氢的无保护的氨基酸)。
制法2：
可以在侧链具有羟基，氨基被保护的氨基酸与2-溴-N-甲基乙酰胺这样的α卤羰基化合物或者与溴乙腈进行烷基化反应之后，通过适当的官能团转换实施下述方案所示的制备。下述通式中，作为P1优选Cbz基，Boc基，Trt基等碱性条件下稳定的保护基。作为α卤羰基化合物，优选例示Ra为NMe、NtBu等的那些。X1优选为卤素，溴基。烷基化反应中使用的碱可例示NaH，NaOtBu，NaOt-Pent等，可以通过相对于在侧链具有羟基，氨基被保护的氨基酸使用2当量以上，由此选择地将该氨基酸的羟基部位烷基化。作为使用的溶剂，优选例示DMF，DMI等。在进行使用溴乙腈的烷基化之后，能够以得到的腈基为基础构建杂环而构建氨基酸基本骨架。下述方案中例示使产生的腈基与羟胺作用，之后，构建利用CDI环化的噁二唑酮环的情况。构建氨基酸的基本骨架之后，通过进行保护基的适当的转换可以转换为期望的氨基酸(P3被Cbz基，Fmoc基，Boc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等保护的氨基酸，或者P3为氢的无保护的氨基酸)。
制法3：
苯丙氨酸衍生物可以使用在Jackson-Negishi coupling(Journal of OrganicChemistry，2010，75，245)中记载的方法，使用相关转移催化剂的甘氨酸叔丁酯的二苯甲酮亚胺的不对称苄基化(J.Am.Chem.Soc.1999，121，6519)等制备。另外，也可以通过进行如下述通式所示的N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯(NHPI酯)和芳香族碘化合物或者芳香族溴化合物用作原料的伴随脱碳酸的交叉耦合反应而制备。下述通式中，n表示碳原子数目，没有特别限制，优选n＝1或者2。作为P1使用在交叉耦合条件下稳定的基团，优选可例示Fmoc基。R4-X1为芳香族卤素化合物，R4表示芳香族部位。当R4包含在交叉耦合反应条件下可被转换的官能团的情况，优选用在交叉耦合反应条件下稳定的保护基保护。例如，在R4中包含羟基的情况下，优选将羟基用四氢吡喃基(THP)基等保护。X1为卤素，优选可例示溴(Br)基，碘(I)基。作为交叉耦合反应中使用的催化剂，优选将镍和锌用作催化剂，作为催化剂的配位子优选使用4，4’-二-叔丁基-2，2’-双吡啶(dtbbpy)。作为溶剂优选使用二甲基乙酰胺。通过伴随脱碳酸的交叉耦合反应构建氨基酸的基本骨架之后，可以通过进行保护基的适当的转换由此转换为期望的氨基酸(P3被Cbz基，Fmoc基，Boc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等保护的氨基酸，或者P3为氢的无保护的氨基酸)。
在如下这样的侧链部位在氨基酸的N原子上的氨基酸中，也可以通过同样的反应制备。
制法4：
可通过使用阿恩特-艾斯特尔特(Arndt-Eistert)合成(人名反应中学到的有机合成战略，p18)而制备相应的β-氨基酸。
制法5：
β-氨基酸可通过以下进行制备：相对于具有相应官能团的氧化物进行使用氨的开环反应，在得到的化合物的胺部位导入保护基，然后将产生的仲醇转换为离去基团之后，进行伴随由于亲核取代反应发生的立体反转的转换为腈基的转换，接下来进行转换为羧酸的转换。下述通式中，在R中包含参与反应的官能团的情况下，优选用适当的保护基进行保护，例如在R中包含羟基的情况下，优选将该羟基用Trt基保护。作为在开环反应后得到的氨基的保护基的P1，优选例示为Cbz基，Boc基，Alloc基等。产生的仲醇被转换为离去基团X2(作为X2优选可例示甲磺酰基(OMs基)等)。可将得到的离去基团在伴随由氰基丙烷(CN-)进行的亲核取代反应的立体反转的同时，衍生为腈基，通过转换为羧酸而构建氨基酸的基本骨架。对从腈基向羧酸的转换而言，可例示例如在酸性条件下的水解。构建氨基酸的基本骨架之后，可通过保护基的适当替换，由此转换为期望的氨基酸(P3被Cbz基，Fmoc基，Boc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等保护后的氨基酸，或者P3为氢的无保护的氨基酸)。
制法6
可通过将具有羟基，且氨基被保护的环状氨基酸和卤素化合物进行使用碱的烷基化反应，之后进行适当的官能团的转换，从而如下述方案所示地制备环状氨基酸。作为使用的原料环状氨基酸，优选为4～8元环的那些，在下述方案中示例了5元环的情况。在环状部分存在的羟基的位置没有特别限定，优选如在通式中那样处于离氨基酸的N原子2个原子以上的位置。下述通式中，作为P1可以使用Cbz基，Boc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等。作为烷基化反应中使用的碱，优选为可例示氢化钠(NaH)，溶剂优选例示为二甲基甲酰胺。在烷基化反应中，当卤素化合物(R-X)在R上具有可能参与该反应的官能团的情况，优选将该官能团用在碱性条件下稳定的保护基保护。例如在R包含羟基时优选用四氢吡喃基(THP)基，苄基(Bn)基，叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基等甲硅烷基醚等保护该羟基。另外，X1为卤素，可例示氯(Cl)基，溴(Br)基，碘(I)基。在通过烷基化反应构建氨基酸的基本骨架之后，可以通过进行保护基的适当的转换，由此转换为期望的氨基酸(P3被Cbz基，Fmoc基，Boc基，Alloc基，nosyl基(Ns基)等保护的氨基酸，或者P3为氢的无保护的氨基酸)。
制法7
上述的氨基酸可以按照下述方案进行N-甲基化：通过在酸性条件下进行使用多聚甲醛的环化反应，接着将得到的环化体在酸性条件下开环的同时，将产生的亚胺进行还原。
(肽化合物的制备方法)
肽化合物的化学合成方法
作为本说明书中的肽化合物或环状肽化合物的化学合成方法，可例示液相合成法，使用Fmoc合成、Boc合成等的固相合成法，及它们的组合等。在Fmoc合成中，由以下氨基酸构成基本单位：主链氨基由Fmoc基保护，侧链官能团根据需要由哌啶、t-Bu基，THP基，Trt基等碱性且不被切割的保护基团保护，不保护主链羧酸的氨基酸。作为基本单位，只要是具有被Fmoc保护的氨基和羧基的组合即可，没有特别限定。也可以例如以二肽作为基本单位。在N末端配置的基本单位，也可以不是Fmoc氨基酸。例如，其可以为Boc氨基酸，也可以为不具有氨基的羧酸类似物。将主链羧基，或者在主链羧基被适当的保护基保护后的侧链中具有羧基的氨基酸的侧链羧基通过与固相载体的官能团的化学反应而担载在固相上。接着，通过哌啶、DBU等碱将Fmoc基脱保护，使新产生的氨基与接下来添加的基本单位的具有羧基的保护氨基酸发生缩合反应，由此生成肽键。在缩合反应中，作为羧基的活化剂，能够为DIC与HOBt的组合、DIC与HOAt的组合、HATU与DIPEA的组合等各种组合。通过反复进行脱Fmoc基和接在其后的肽键生成反应，可以生成想要的肽序列。得到想要的序列后，进行从固相的切割、和将根据需要而导入的侧链官能团的保护基脱保护。另外，也能够在进行从固相的切割前进行肽的结构转换、环化。从固相的切割和脱保护可以利用同一条件，例如90∶10的TFA/H2O进行，也可以根据需要而利用各自的条件进行脱保护。对从固相的切割而言，可以使用在1％TFA等弱酸下的切割，或可以作为保护基而利用Pd等而利用这两者化学反应的正交性(orthogonality)。也可以在这些工序之间或者最后实施环化等工序。可以使例如，侧链羧酸与N末端主链的氨基进行缩合、侧链氨基与C末端主链的羧酸进行缩合。此时，在C末端侧的羧酸与被环化的侧链羧酸之间，或在N末端侧的主链氨基或羟基与被环化的侧链氨基之间需要有反应正交性，如上述所述，考虑保护基的正交性而进行保护基的选择。可以将如上所述地得到的反应物用反相层析柱、分子筛柱等进行纯化。这些细节例如记载于默克株式会社在2002年5月1日发行的固相合成手册等中。用于固相合成的树脂可以使用市售的，可例示CTC树脂，Wang树脂，或SASRIN树脂。
在本说明书中记载的化合物的制备中，在定义的基团在实施方法的条件下会受到不希望的化学转换情况下，可以通过使用例如，官能团的保护，脱保护等办法而制备该化合物。其中，保护基的选择及加保护脱保护的操作可列举例如，“Greene’s，“ProtectiveGroups in Organic Synthesis″(第5版，John Wiley&Sons 2014)”中记载的方法，可以将它们根据反应条件而适当使用。另外，根据需要也可以改变导入取代基等反应工序的顺序。例如，氨基的保护基可例示Fmoc，Boc，Cbz，或Alloc基等。对这些氨基甲酸酯(carbamate)基而言，可以通过使氨基在氨基甲酸酯化剂和碱催化剂存在下反应而导入。氨基甲酸酯化剂可列举例如Boc2O，BocOPh，FmocOSu，FmocCl，CbzCl，AllocCl等。作为碱催化剂可列举例如碳酸锂，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，碳酸铯，碳酸氢铯，氢氧化锂，氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铯，磷酸钠，磷酸钾，N-甲基吗啉，三乙胺，二异丙基乙基胺，N，N-二甲基氨基吡啶等。氨基的保护基氨基甲酸酯基可以通过碱性条件下，酸性条件下，或加氢分解反应的条件下等除去。
肽化合物的翻译合成方法
作为本说明书中的肽化合物的翻译合成方法，可例示使用无细胞翻译体系合成的方法，在所述方法中包括基于重建的无细胞翻译体系的合成法。从能够除去期望排除的因素的方面，优选利用重建的无细胞翻译系统。
一方面中，本说明书提供本说明书中的肽化合物的翻译合成方法，所述肽化合物包含至少一种，两种以上，或3种以上的本说明书的氨基。并不作为限定，这样的翻译合成方法可以包括以下(i)及(ii)：
(i)制备结合至少一种，两种以上，或3种以上的本说明书中氨基酸的tRNA的工序；
(ii)利用无细胞翻译系统翻译包含至少1个与上述tRNA的反密码子对应的密码子的核酸，从而得到上述肽化合物的工序。
在非限定的一种实施方式中，本说明书中的翻译合成方法可以为环状肽化合物的翻译合成方法。
无细胞翻译系统
在本说明书中，术语“无细胞翻译系统”是指利用除了从细胞提取到的核糖体和参与翻译的蛋白因子组，tRNA，氨基酸，ATP等能量源及其再生体系组合而成的那些，只要是能够将mRNA翻译成蛋白质的那些即可，没有限制。另外，对翻译合成反应正在进行中的体系而言，也可以包括在本说明书中的“无细胞翻译系统”中。在本说明书中的无细胞翻译系统中，可以包含作为翻译肽时的模板的核酸，除了这些以外，也可以包含起始因子、延长因子、解离因子、氨基酰tRNA合成酶等。这些因子能够通过从各种细胞的提取液进行纯化而得到。用于对因子进行纯化的细胞，可列举例如，原核细胞或真核细胞。作为原核细胞，可列举：大肠杆菌细胞，极端嗜热细胞，或枯草杆菌细胞。作为真核细胞，已知有以：酵母细胞、小麦胚芽，兔网织红细胞，植物细胞，昆虫细胞或动物细胞为材料的那些。另外，对tRNA、氨基酰tRNA合成酶(ARS)而言，除了天然存在的那些以外，也可以使用人工tRNA，识别非天然氨基酸的人工氨基酰tRNA合成酶。通过使用人工tRNA，人工氨基酰tRNA合成酶，能够合成部位特异性地导入有非天然氨基酸的肽。需要说明的是，根据需要，也可以通过在无细胞翻译系统中加入T7 RNA聚合酶等RNA聚合酶，由此从模板DNA进行转录。
在本说明书中，“无细胞翻译系统中包含某种物质”，是指也包括以下实施方式：即使在翻译合成开始时不含有该物质，在翻译合成的过程中，在体系内也进行合成而变得包含该物质。理解作例如，在翻译合成的过程中有将氨基酸酰化而成的tRNA被合成的情况下，在无细胞翻译系统中包含该氨基酰tRNA。
PURESYSTEM(注册商标)(BioComber，Japan)，为将对于大肠杆菌的翻译必要的蛋白因子类、能量再生类酶、核糖体分别进行提取、纯化，与tRNA、氨基酸、ATP、GTP等混合而成的重建无细胞翻译系统。能够容易地制作不仅杂质的含量较少，且不含有作为重建体系而期望排除的蛋白因子、氨基酸的体系。((i)Nat Biotechnol.2001；19：751-5.Cell-freetranslation reconstituted with purified components.Shimizu Y，Inoue A，TomariY，Suzuki T，Yokogawa T，Nishikawa K，Ueda T.(ii)Methods Mol Biol.2010；607：11-21.PURE technology.Shimizu Y，Ueda T.)。
例如，虽然多有报道作为导入非天然氨基酸的密码子而利用终止密码子的方法，但通过使用上述PURESYSTEM，能够由此构建除去了天然氨基酸、ARS的合成体系。由此，可以使编码除外的天然氨基酸的密码子对应于非天然氨基酸(J Am Chem Soc.2005；127：11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides.Josephson K，Hartman MC，Szostak JW.)。可以进一步通过对密码子的解除简并，从而并非将天然氨基酸除外而是将非天然氨基酸加入(Kwon I，et al.Breaking the degeneracy of the genetic code.JAm Chem Soc.2003，125，7512-3.)。可以通过将包含N-甲基氨基酸的肽采用PURESYSTEM等无细胞翻译系统而利用核糖体合成。
更具体而言，翻译合成能够通过向以下系统加入mRNA而进行，例如，适当取舍地选择对大肠杆菌的翻译而言必要的蛋白因子类(甲硫氨酰tRNA反式甲酰酶、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS(从AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRS中选必要的那些))、核糖体、氨基酸、肌酸激酶、肌激酶、无机焦磷酸酶、核苷二磷酸激酶、源自E.coli的tRNA、磷酸肌酸、谷氨酸钾、HEPES-KOH pH 7.6、乙酸镁、亚精胺、二硫苏糖醇、GTP、ATP、CTP、UTP等而混合而成的PURESYSTEM等公知的无细胞翻译系统。另外，如果加入了T7 RNA聚合酶，则也可以偶联进行从包含T7启动子的模板DNA的转录、翻译。另外，可以通过将期望的氨基酰tRNA组、允许氨基酰tRNA合成酶(ARS)的非天然氨基酸组(例如F-Tyr)添加到体系中，从而翻译合成包含非天然氨基酸的肽化合物(Kawakami T，etal.Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids.J Am ChemSoc.2008，130，16861-3；Kawakami T，et al.Diverse backbone-cyclized peptides viacodon reprogramming.Nat Chem Biol.2009，5，888-90.)。进一步，也可以代替天然的ARS或在它们的基础上，将ARS的变体包含在体系中，并且在体系中包含非天然氨基酸组，由此翻译合成包含非天然氨基酸的肽化合物。或者，也可以通过利用核糖体、EF-Tu等的突变体而提高非天然氨基酸的翻译导入的效率(Dedkova LM，et al.Construction of modifiedribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins.Biochemistry.2006，45，15541-51.，Doi Y，et al.Elongation factor Tu mutants expand amino acidtolerance of protein biosynthesis system.J Am Chem Soc.2007，129，14458-62.，Park HS，et al.Expanding the genetic code of Escherichia coli withphosphoserine.Science.2011，333，1151-4.)。
在非限定的一个实施方式中，本说明书的无细胞翻译系统(也称为“本说明书的翻译系统”)可以为用于制造肽化合物的翻译系统，优选为用于制造环状肽化合物的翻译系统。
在非限定的一个实施方式中，在本说明书的翻译系统中可以包含5～32种、5～28种、或5～20种非天然氨基酸，例示优选为8～20种、10～20种、13～20种。一种实施方式中，本说明书的翻译体系中包含氨基酸的种数中可以有50％以上，60％以上，70％以上，80％以上为非天然氨基酸。
在非限定的一种实施方式中，本说明书的翻译体系可以包含5～28种，或5～20种N取代氨基酸，优选例示为5～18种，5～15种。一种实施方式中，本说明书的翻译体系中包含氨基酸的种数中可以有40％以上，50％以上，60％以上，70％以上为N取代氨基酸。其中N取代的氨基酸可以指N-烷基氨基酸或N-甲基氨基酸，但在这样的情况下，也并不否定在本说明书的翻译系统中也包含其它N取代的氨基酸。
在非限定的一个实施方式中，本说明书的翻译系统可以调整为使得使用该翻译系统制造的肽化合物中包含的芳环数目的均值为一定的范围内。例如，可以对本说明书的翻译系统进行调整，使得在翻译合成的肽化合物中构成环状部的氨基酸数目中，具有芳环的氨基酸占的比例的均值为；40％以下，35％以下，30％以下，27％以下，25％以下，或20％以下，或使得在具有由8～11个氨基酸构成的环状部的肽化合物的环状部的侧链中包含的芳环数目的均值为0～3。对调整方法没有特别限定，可列举例如调整在翻译系统中包含的氨基酸的种类的数目中，具有芳环的氨基酸的种类占的数目。
在非限定的一个实施方式中，在本说明书的翻译系统中包含具有芳环的氨基酸即可，翻译体系中包含的氨基酸的种数中，具有芳环的氨基酸的种数占的比例为优选为40％以下，优选例示为35％以下，30％以下，27％以下，25％以下，20％以下。
在非限定的一种实施方式中，本说明书中的无细胞翻译体系可以为用于制备本说明书中的肽化合物的无细胞翻译体系，所述肽化合物包含至少一种，两种以上，或3种以上的本说明书的氨基酸。并不作为限定，这样的无细胞翻译系统可以包括以下(i)及(ii)：
(i)制备结合有至少一种，两种以上，或3种以上的本说明书中的氨基酸的tRNA；
(ii)编码上述肽化合物的核酸，
其中，该核酸包含至少1个与上述tRNA的反密码子对应的密码子即可。
tRNA
对于将非天然氨基酸翻译导入肽中而言，需要具有正交性而有效地被摄入核糖体的tRNA的氨基酰化((i)Biochemistry.2003；42：9598-608.Adaptation of an orthogonalarchaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base，amber，and opalsuppression.Anderson JC，Schultz PG.，(ii)Chem Biol.2003；10：1077-84.Using asolid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the geneticcode.Murakami H，Kourouklis D，Suga H.)。作为对tRNA进行氨基酰化的方法，可以使用以下5种方法。
作为用于进行在细胞内的tRNA的氨基酰化的酶，根据氨基酸不同而制备了氨基酰tRNA合成酶(ARS)。作为用于此的第一方法，可列举利用某种ARS允许N-Me His等非天然氨基酸的方法、制备允许非天然氨基酸的突变氨基酰tRNA合成酶并利用其的方法((i)ProcNatl Acad Sci U S A.2002；99：9715-20.An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acidinto proteins in eukaryotic translationand its application in a wheat germcell-free system.Kiga D，Sakamoto K，Kodama K，Kigawa T，Matsuda T，Yabuki T，Shirouzu M，Harada Y，Nakayama H，Takio K，Hasegawa Y，Endo Y，Hirao I，Yokoyama S.(ii)Science.2003；301：964-7.An expanded eukaryotic genetic code.Chin JW，CroppTA，Anderson JC，Mukherji M，Zhang Z，Schultz PG.Chin，JW.(iii)Proc Natl Acad SciU S A.2006；103：4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural aminoacids.Hartman MC，Josephson K，Szostak JW.)。第二，也可使用在试管内对tRNA进行氨基酰化，之后对氨基酸进行化学修饰的方法(J Am Chem Soc.2008；130：6131-6.Ribosomalsynthesis of N-methyl peptides.Subtelny AO，Hartman MC，Szostak JW.)。第三，可以利用RNA连接酶，使从tRNA的3′末端的CCA序列中除去CA而成的那些与另外制备的氨基酰化的pdCpA进行结合，由此得到氨基酰tRNA(Biochemistry.1984；23：1468-73.T4 RNA ligasemediated preparation of novel″chemically misacylated″tRNAPheS.Heckler TG，Chang LH，Zama Y，Naka T，Chorghade MS，Hecht SM.)。也存在基于Flexizyme的氨基酰化，所述flexizyme为将各种非天然氨基酸的活性酯担载于tRNA的核酶(J Am Chem Soc.2002；124：6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.MurakamiH，Bonzagni NJ，Suga H.)。第四，也可使用将tRNA与氨基酸活性酯在阳离子性胶束中进行超声波混合的方法(Chem Commun(Camb).2005；(34)：4321-3.Simple and quick chemicalaminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonicagitation.Hashimoto N，Ninomiya K，Endo T，Sisido M.)。作为第五方法，通过将与tRNA的3′末端附近互补的PNA上结合氨基酸活性酯而成的那些添加到tRNA上，也能够进行氨基酰化(J Am Chem Soc.2004；126：15984-9.In situ chemical aminoacylation withamino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K，Minohata T，NishimuraM，Sisido M.)。
更具体而言，能够使用如下的方法制作氨基酰tRNA。能够通过制备编码期望的tRNA序列并在上游配置有T7、T3或SP6启动子的模板DNA，利用T7 RNA聚合酶、T3、SP6 RNA聚合酶等适合于启动子的RNA聚合酶进行转录，由此合成RNA。也能够从细胞提取tRNA而纯化，使用tRNA的序列的互补序列的探针而提取目标的生成tRNA。此时，也能够将利用目标的tRNA的表达载体进行了转化的细胞作为来源。也能够通过化学合成而合成目标序列的RNA。例如，能够利用RNA连接酶使从如上所述地得到的3′末端的CCA序列除去CA而成的tRNA，与另外制备的氨基酰化的pdCpA或pCpA进行结合，由此得到氨基酰tRNA(pdCpA法、pCpA法)。该tRNA在肽化合物的制造中有用。或者，也能够制备全长tRNA而进行基于flexizyme的氨基酰化，所述flexizyme为将各种非天然氨基酸的活性酯担载于tRNA的核酶。另外，并不意在于限定，也能够使用天然的ARS或其变体制作氨基酰tRNA。如果使用天然ARS或其变体，则在翻译系统内暂时被消耗的氨基酰tRNA可利用天然ARS、其变体而再生成，因此，不需要在翻译系统中大量存在预先制作的氨基酰tRNA。这样的ARS变体记载于WO2016/148044中。这些氨基酰tRNA的制作方法也可以适当组合。
环状部的形成
在非限定的一个实施方式中，肽化合物的环状部通过将直链状的肽化合物进行环化反应而形成。
在本说明书中，“环化反应”是指在肽化合物的肽部分形成环状部的反应。在一个实施方式中，在本说明书的肽化合物中也包括：将通过环化反应形成有环状部的肽化合物进行进一步化学修饰、或使其反应而得到的肽化合物。另外，可以在环化反应之前进行化学修饰等。
方案A中示出了本说明书的肽化合物的肽部分的环化反应的一例。黑圆(●)单元(主链单元)，D单元(天冬氨酸单元)，三角(▲)单元(环化N末端单元)分别指构成肽部位的氨基酸残基。白圈表示用于固相合成的树脂。在方案A中，环状部是指包含1个三角单元和9个黑圆单元及1个D单元的部位。各个单元可以为相同的氨基酸，也可以为不同的氨基酸。本发明的环状肽可以通过例如国际公开第2013/100132号中记载的方法制备。
在本说明书中，“单元”是指本说明书的链状肽化合物的合成后而环化前的氨基酸、环化之后的氨基酸、环化之后的化学修饰结束的时间点的氨基酸中的任一种。在环化之后的化学修饰结束的时间点的氨基酸残基中，包括例如，通过在肽化合物的制备后的化学修饰而进行了化学转换、骨架转换而成的氨基酸残基。
文库
在非限定的一种实施方式中，本公开的肽化合物或编码它们的核酸的文库，分别可以为实质由本说明书中记载的肽化合物，或编码它们的核酸形成的文库。
本说明书的文库中包括：包含本说明书中的肽化合物的文库，及包含编码本说明书中的肽化合物的核酸的文库。本说明书的文库中包含本说明书中的肽化合物的文库，肽化合物-核酸复合体的文库，其中优选为环状肽化合物，或环状肽-核酸复合体的文库，特别优选环状肽-mRNA复合体的文库。作为文库，优选为展示文库。作为展示文库，例示利用了展示的文库，其中优选为mRNA展示文库、DNA展示文库、核糖体展示文库，更优选mRNA展示文库。
无意用特定的理论进行限制，本发明人有如下思考。在现在的肽库中，构成肽的氨基酸的侧链中包含质子供体被通过分子内氢键形成的掩蔽尚依赖于偶然。尤其是在随机配置构成氨基酸而使得具有多样性的肽库中，氨基酸之间难以如预期地形成氢键。如果是包含本说明书的氨基酸的肽化合物，则由于氨基酸的侧链中包含的质子供体部位使用了已经形成了氢键的氨基酸，因此，可以实现在肽化合物的侧链部位按照想要的目的在分子内形成氢键。对使用本说明书的氨基酸得到的肽化合物的文库而言，在分子内形成氢键从而可掩蔽侧链的质子供体的肽化合物出现的频率高，即，能够将包含膜透过性高的肽化合物的概率变高。
本说明书中，肽化合物可以为“由核酸编码的肽化合物”。在本说明书中“利用核酸编码的肽化合物”，不限定于通过将该核酸作为模板进行翻译而直接合成的肽化合物，也存在包括可接受翻译后修饰而合成的肽化合物的情况。例如，当通过翻译核酸而合成直链肽化合物，并利用之后的环化工序而合成环状肽化合物的情况，将该环状肽化合物称为利用上述核酸编码的环状肽化合物的情况。另外，在一个实施方式中，以核酸作为模板翻译合成的肽化合物，或在之后接受了翻译后修饰的肽化合物与该核酸的复合体(肽化合物-核酸复合体)，也包括在利用核酸编码的(环状)肽化合物中。
在非限定的一个实施方式中，本说明书的文库中包含的肽化合物、或利用文库中包含的核酸编码的肽化合物中包含的非天然氨基酸、N取代的氨基酸、或具有芳环的氨基酸的数目的均值，在合成DNA文库时可以利用对应上述氨基酸的密码子的出现频率进行调整。例如在包含10个氨基酸残基可变部位的肽的文库中，假设氨基酸从20种中进行选择的情况下，可以通过将该20种中N取代的氨基酸设为10种，由此以N取代的氨基酸的密码子单元相对于可变部位1个部位占10/20(50％)的方式合成。如上所述地，也可以算出在本说明书中的非天然氨基酸数目，N取代的氨基酸数目，芳环数目，或具有芳环的氨基酸的数目的比例的均值。
对本说明书的肽化合物，和/或编码它们的核酸的文库而言，“实质上由～组成”是指相对于该文库中包含的肽化合物，和/或编码它们的核酸的变体的理论总数目而言，该处列举的肽化合物，和/或编码它们的核酸的变体的理论数目占的比例可以为90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上、或99％以上，但不限于这些。
在本说明书的文库中，求出肽化合物的“变体的理论(总)数目”时，不将实际无法作为肽化合物而制造的那些算入理论(总)数目中。例如，在如以下(1)或(2)的情况下，由于相应的氨基酸不被翻译合成，因此，不将包含这样的氨基酸的肽化合物算入理论(总)数目中：(1)即使向翻译液中作为肽化合物的材料而添加了氨基酸，编码所述氨基酸的核酸也不作为模板而含有的情况；(2)虽然在作为肽化合物的模板的核酸中包含碱基序列，但使用不含有与其相应的氨基酸的翻译液的情况。另外，在制备环状肽化合物的过程中存在副反应物、未反应物的情况下，不将这些算入上述理论(总)数目中。
例如，在使用计20种天然氨基酸，根据针对一种氨基酸对应于1组密码子单元而成的密码子表，由随机配置了上述密码子单元而成的碱基序列进行翻译合成11个残基的肽的情况下，如果将翻译起始氨基酸固定为甲硫氨酸，则变体的理论数目为2010。
在非限定的一个实施方式中，本说明书的文库除了肽化合物，和/或编码它们的核酸以外，可以包含对能够与靶分子特异性结合的肽化合物的筛选而言必要的其它成分。另外，可以在不对本明申请的文库的效果造成负的影响的范围内包含其它成分。
在本明申请的文库中包含多种肽化合物，或编码它们的核酸。在本说明书中，将文库中包含的肽化合物的变体(种)的数目的性质称为“多样性”。对本说明书的文库中包含的肽化合物，或编码它们的核酸的多样性没有特别限定，可例示103以上，104以上，105以上，106以上，107以上，108以上，109以上，1010以上，1011以上，及1012以上。这些多样性不限于实测值，也可以为理论值。
在非限定的一个实施方式中，本说明书的文库中包含的，或利用文库中包含的核酸编码的肽化合物的除了核酸连接部以外的肽部分的分子量的均值，或环状肽化合物的环状部的分子量的均值可以为500～2000。
展示文库
展示文库，为将编码作为表现型的肽与编码作为其基因型的肽的RNA或DNA进行对应的文库。使用该文库，能够鉴定能够与靶分子特异性结合的肽化合物。例如，能够使期望的固定的目标与文库接触，洗掉不与目标结合的分子，由此缩小与目标结合肽的范围(淘选法)。通过分析与经过这样的过程选择的肽相对应的基因信息，能够弄清与目标发生结合的肽的序列。例如，已有报道利用作为氨基酰tRNA的类似物的抗生素嘌呤霉素与利用核糖体的mRNA翻译延长中的蛋白质进行非特异性连接的方法，作为mRNA展示(Proc Natl AcadSci USA.1997；94：12297-302.RNA-peptide fusions for the in vitro selection ofpeptides and proteins.Roberts RW，Szostak JW.)或体外病毒(FEBS Lett.1997；414：405-8.In vitro virus：bonding of mRNA bearing puromycin at the 3′-terminal endto the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro.NemotoN，Miyamoto-Sato E，Husimi Y，Yanagawa H.)。
先在通过从包含T7启动子等启动子的DNA文库转录而得到的mRNA文库的3′端结合有嘌呤霉素等间隔序列，利用无细胞翻译系统将mRNA翻译成蛋白质时，嘌呤霉素利用核糖体而与氨基酸混淆从而被掺入蛋白质中，使mRNA和编码其的蛋白质连接，构成mRNA与其产物进行对应的文库。由于在该过程中不包含大肠杆菌等的转化，因此能够实现高效率，构建大规模的展示文库。可以从作为包含具备利用淘选缩小范围，选择的分子的基因信息的标签的mRNA而合成cDNA，通过PCR扩增、分析碱基序列而弄清发生结合的蛋白的序列。
在利用了无细胞翻译系统的展示文库中，除了mRNA展示以外，已知有：作为编码包含肽与嘌呤霉素的复合体发生结合的肽的cDNA的文库的cDNA展示(Nucleic AcidsRes.2009；37(16)：e108.cDNA display：a novel screening method for functionaldisulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization ofmRNA-protein fusions.Yamaguchi J，Naimuddin M，Biyani M，Sasaki T，Machida M，Kubo T，Funatsu T，Husimi Y，Nemoto N.)，利用了作为在mRNA翻译中的核糖体与翻译产物的比较稳定的复合体的核糖体展示(Proc Natl Acad Sci U S A.1994；91：9022-6.An in vitropolysome display system for identifying ligands from very large peptidelibraries.Mattheakis LC，Bhatt RR，Dower WJ.)，利用了噬菌体内切核酸酶P2A与DNA形成共价键的共价展示(Nucleic AcidsRes.2005；33：e10.Covalent antibody display--anin vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H，Lobersli I，LosetGA，Hvattum E，Simonsen B，Stacy JE，McGregor D，Fitzgerald K，Welschof M，BrekkeOH，Marvik OJ.)，利用了微生物的质粒的复制起始蛋白RepA与复制起始点ori结合的CIS展示(Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101：2806-10.CIS display：In vitro selectionof peptides from librariesof protein-DNA complexes.Odegrip R，Coomber D，Eldridge B，HedererR，Kuhlman PA，Ullman C，FitzGerald K，McGregor D.)。另外，还已知将构成DNA文库的每1分子DNA的转录翻译系统封入油包水乳液、脂质体中，进行翻译反应的体外区室化(in vitro compartmentalization)(Nat Biotechnol.1998；16：652-6.Man-made cell-like compartments for molecular evolution.Tawfik DS，Griffiths AD.)。可以使用适当、公知的方法使用上述方法。
核酸文库
本发明中的“核酸”中也可以包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或具有人工碱基的核苷酸衍生物。另外，也可以包含肽核酸(PNA)。本发明的核酸可以是这些核酸中的任一种或者混合，只要保持目标的遗传信息。即，在本发明的核酸中也包括DNA-RNA的杂合核苷酸、DNA与RNA这样的不同核酸以单链连接而成的嵌合核酸。
作为在肽化合物文库中包含的作为肽化合物的模板的核酸的文库，可例示：mRNA文库、DNA文库等。可以通过在肽序列上没有固定氨基酸残基的部位混合碱基进行合成而得到核酸文库。也有例如，作为DNA文库，以将A、T、G、C，作为RNA文库，以将A、U、G、C各4种碱基的混合(N)的3倍数个的重复，或者以密码子的第一个第二个为N，第三个为W、M、K、S等2个碱基的混合的形式进行合成，其中，如果进一步将导入的氨基酸的种类抑制在16个以下，则使第三个为1种碱基的方法。另外，制备相当于密码子的3个字母的密码子单元，通过将其以任意比例进行混合而用于合成中使用，能够自由地调整氨基酸残基的出现频率。
能够使用无细胞翻译系统来翻译这些核酸文库。在使用无细胞翻译系统的情况下，优选在目标的核酸的下游含有编码间隔序列的序列。作为间隔序列，可列举包含甘氨酸、丝氨酸的序列，但不限定于此。另外，在嘌呤霉素、其衍生物等在利用核糖体的翻译时被掺入肽中的化合物与核酸文库之间，优选包含由RNA、DNA、六乙二醇(spc18)的聚合物(例如5-mer)等形成的接头。
文库的制备方法
在非限定的一个实施方式中，本申请的文库的制备能够基于上述本申请的肽化合物的制备方法进行，能够与适当的公知方法进行组合。在一个实施方式中，能够使用上述本申请的无细胞翻译系统制备本申请的肽化合物的文库。即，在本申请的文库的制备方法中，可以包括使用本申请的无细胞翻译系统而合成肽化合物的工序。在一个实施方式中，在本申请的无细胞翻译系统中记载的，例示的，优选的范围，实施方式也可直接适用在本申请的文库的制备方法中。
对mRNA展示文库而言，在非限定的一个实施方式中可以如下制造。首先化学合成在T7启动子等启动子的下游配置有期望的序列的DNA的文库，将其作为模板通过引物延长反应而成为双链DNA。将其作为模板而使用T7 RNA聚合酶等RNA聚合酶转录为mRNA。使该RNA的3′末端与连接有作为氨基酰tRNA的类似物的抗生素嘌呤霉素等的接头(间隔序列)结合。将其加到上述PURESYSTEM等公知的无细胞翻译系统中，通过保温使mRNA进行翻译，mRNA和在其上编码的肽经由包含嘌呤霉素等的接头而连接。能够如上所述地构建由将MRNA与其产物进行对应而成的MRNA与其产物的复合体构成的展示文库。接头可以进一步包含本领域技术人员所周知的间隔序列。另外，可以根据需要而通过上述方法、公知的方法而进行环化等翻译后修饰。
在非限定的一个实施方式中，本申请的文库可以为肽化合物文库，其包含选自由本说明书中记载的氨基酸组成的组中的至少一种，两种以上，或3种以上的氨基酸的肽化合物。作为这样的文库的制备方法，可以包括利用包含以下(i)及(ii)的无细胞翻译系统翻译合成肽化合物的工序：
(i)结合有选自由本说明书中记载的氨基酸组成的组中的至少一种，两种以上，或3种以上的氨基酸的tRNA；
(ii)编码上述肽化合物文库的核酸文库，
其中，在该核酸文库中可以包含核酸，所述核酸至少包含1个与上述tRNA的反密码子对应的密码子。
需要说明的是，在本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考并入本说明书。
实施例
本发明虽然利用以下实施例进行了例示，但并不受限于下述实施例。
在实施例中使用以下缩略词表中记载的缩略词。
[表1]
在肽合成及固相合成中使用的反应溶剂，使用了肽合成用(购自渡边化学、和光纯药)。例如为DCM、DMF、NMP、在DMF中的2％DBU、在DMF中的20％哌啶等。另外，在不以水作为溶剂加入的反应中，使用了脱水溶剂、超脱水溶剂、无水溶剂(购自关东化学，和光纯药等)。
LC/MS的分析条件如下述所述。
[表2]
实施例1肽化合物的化学合成
按照基于WO2013/100132中记载的Fmoc法的肽合成法，以下述基本途径进行了肽的延长。即，5个阶段的工序：1)将Asp侧链的羧酸担载于2-氯三苯甲基树脂而成的，从Asp的N末端出发的基于Fmoc法的肽延长反应，2)从2-氯三苯甲基树脂切割肽的过程，3)酰胺环化，其基于利用切割过程从2-氯三苯甲基树脂脱离而产生的Asp侧链的羧酸与肽链N末端(三角单元)的氨基的缩合，4)肽链中包含的侧链官能团的保护基的脱保护，5)基于制备型HPLC的化合物的纯化。另外，在包含在侧链中具有酸性官能团的氨基酸的肽化合物中，为了抑制脱保护剂的残留引起的肽的过量延长，因此，可以在肽延长反应时的树脂洗涤中使用0.08M三乙胺盐酸盐的二氯甲烷溶液。在本实施例中，如果没有特别表述，则为进行了基于该基本途径的肽化合物的合成。
1-1.在利用肽合成仪的肽合成中使用的Fmoc-氨基酸
在本说明书内记载的肽合成中，在利用肽合成仪的合成中使用了以下Fmoc-氨基酸。在侧链具有反应性官能团的氨基酸的情况下，使用了用适当的保护基保护的那些。需要说明的是，氨基酸的简称记载于下述表3中。
对Fmoc-D-Val-OH，Fmoc-MeLeu-OH，Fmoc-MePhe-OH，Fmoc-MeGly-OH，Fmoc-gMeAbu-OH(有时也记载为Fmoc-g-MeAbu-OH)，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-MeAla-OH，Fmoc-MeVal-OH，Fmoc-D-Abu-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-MeAbu-OH，Fmoc-MeIle-OH，Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-D-Ala-OH，Fmoc-Tyr(Clt)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe(4-CF3)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Hph-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-b-MeAla-OH，Fmoc-Ala(3-Pyr)-OH，Fmoc-D-MeAla-OH，Fmoc-Phe{#(CH2)2}-OH，Fmoc-Ala(Thz)-OH，Fmoc-D-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ser(Bn)-OH等而言，购自渡边化学或者Chempep公司或者Chem-Impex公司或者Bachem公司。另外，Fmoc-nPrGly-OH，Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH，Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH等通过WO2013/100132中记载的方法合成。另外，Fmoc-Thr(THP)-OH(化合物aa01)，Fmoc-nBuGly-OH(化合物aa02)，Fmoc-Ser(iPen)-OH(化合物aa04)，Fmoc-MeHph-OH(化合物aa05)，Fmoc-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH(化合物aa12)，Fmoc-Ser(Ph-3-Cl)-OH(化合物aa16)，Fmoc-Nle(6-OTHP)-OH(化合物aa17)，Fmoc-Ser(EtOTHP)-OH(化合物aa22)，Fmoc-MeSer(EtOTHP)-OH(化合物aa27)，Fmoc-Ser(S-2-PrOTHP)-OH(化合物aa34)，Fmoc-MeSer(S-2-PrOTHP)-OH(化合物aa39)，Fmoc-Ser(R-2-PrOTHP)-OH(化合物aa46)，Fmoc-MeSer(R-2-PrOTHP)-OH(化合物aa51)，Fmoc-Ser(tBuOTHP)-OH(化合物aa54)，Fmoc-MeSer(tBuOTHP)-OH(化合物aa55)，Fmoc-Ser(2-Me-2-BuOTHP)-OH(化合物aa62)，Fmoc-MeSer(2-Me-2-BuOTHP)-OH(化合物aa64)，Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OH(化合物aa68)，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OH(化合物aa70)，Fmoc-MeSer(1-CF3-EtOH)-OH(化合物aa71)，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOTHP)-OH(化合物aa72)，Fmoc-Gln(Me)-OH(化合物aa75)，Fmoc-Ser(NtBu-Aca)-OH(化合物aa78)，Fmoc-MeSer(NtBu-Aca)-OH(化合物aa79)，Fmoc-Ser(NMe-Aca)-OH(化合物aa81)，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH(化合物aa85)，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH(化合物aa89)，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH(化合物aa95)，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH(化合物aa101)，Fmoc-Phe(4-OClt-3-OMe)-OH(化合物aa104)，Tyr(3-OMe)的侧链苯酚部位被氯三苯甲基保护的那些)，Fmoc-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH(化合物aa109)，Fmoc-bAla(3R-MeOEtOTHP)-OH(化合物aa111)，Fmoc-bAla(2S-MeOEtOTHP)-OH(化合物aa117)，Fmoc-Nva(2R-4-F2-Pyrro(N-Alloc))-OH(化合物aa121)，Fmoc-Ser(S-4-F2-Pyrro(N-Alloc)-Me)-OH(化合物aa126)，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONMe)-OH(化合物aa127)，Fmoc-Phe(4-OMe-3-CONMe)-OH(化合物aa128)，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHMs)-OH(化合物aa129)，Fmoc-Hyp(2-EtOTHP)-OH(化合物aa133)，Fmoc-(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly-OH(化合物134)，Fmoc-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH(化合物aa135)，Fmoc-D-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH(化合物aa136)，Fmoc-MeHph(3-OMe-4-CONMe)-OH(化合物aa137)，Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OH(化合物aa139)，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OH(化合物aa140)，Fmoc-Ser(S-(Alloc)Mor-3-Me)-OH(化合物aa141)等如下所述合成。
关于包含在侧链具有叔醇的氨基酸(例如，Ser(tBuOH)，MeSer(tBuOH)，Ser(2-Me-2-BuOH)，MeSer(2-Me-2-BuOH)等)的序列，即使使用了没有用THP保护侧链的叔醇部位的Fmoc氨基酸(例如使用Fmoc-Ser(tBuOH)-OH(化合物aa53)，Fmoc-Ser(2-Me-2-BuOH)-OH(化合物aa61)等)，所述肽也可以毫无问题地进行延长。
关于包含在侧链中具有仲醇，且与醇结合的碳上结合了CF3基的结构的氨基酸(例如，Hnl(7-F3-6-OH)，Ser(1-CF3-EtOH)等)的序列，即使使用了侧链的仲醇部位没有被THP保护的Fmoc氨基酸(例如使用Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OH(化合物aa68)，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OH(化合物aa70)等)，所述肽也可以毫无问题地进行延长。
[表3]
氨基酸的简称
1-2.在利用肽合成仪的肽合成中使用的氨基酸合成
(2S，3R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)丁酸(化合物aa01，Fmoc-Thr(THP)-OH)的合成
(2S，3R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-羟基丁酸一水合物(Fmoc-Thr-OH的一水合物，购自东京化成，5.0g，13.9mmol)和对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(0.175g，0.70mmol)的混合物中加入甲苯(50mL)，通过减压蒸馏除去甲苯而共沸由此除去含有的水分。向得到的残渣中加入超脱水四氢呋喃(THF)(28mL)和3，4-二氢-2H-吡喃(8.8mL，97mmol)，在氮气氛围中，在50度搅拌4小时。通过LCMS(SQDFA05)确认原料消失后，将混合物冷却至25度，加入乙酸乙酯(30mL)。接着加入饱和氯化钠水溶液(30mL)洗涤有机层，用乙酸乙酯(30mL)萃取水层。将得到的全部有机层混合，将其进一步通过饱和氯化钠水溶液(30mL)进行2次洗涤。将有机层硫酸钠用干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，得到了粗产物(9.3g)。
使得到的粗产物中的4.65g溶解于四氢呋喃(THF)(30mL)，然后加入调节至pH 8.0的1.0M磷酸缓冲液(30mL)。将该混合物在50度搅拌4小时。冷却至25度之后，加入乙酸乙酯(30mL)，将有机层和水层分离。在水层中加入乙酸乙酯(30mL)进行萃取后，将得到的全部有机层混合，用饱和氯化钠水溶液(30mL)进行2次洗涤。用硫酸钠使有机层干燥，减压蒸馏除去溶剂，进一步利用泵在减压下于25度干燥30分钟。
将得到的残渣溶解于二乙醚(50mL)中，然后加入庚烷(50mL)。在控制的减压下(～100hPa)，仅蒸馏除去二乙醚，将得到的混合物过滤而得到固体。将该利用庚烷的洗涤操作重复两次。将得到的固体利用泵在减压下于25度干燥2小时，得到了Fmoc-Thr(THP)-OH的钠盐(2.80g，6.26mmol)。
在得到的全部量Fmoc-Thr(THP)-OH的钠盐中加入乙酸乙酯(50mL)和pH 2.1的0.05M磷酸水溶液(140mL)，在25度搅拌5分钟，之后将有机层和水层分离。在水层中加入乙酸乙酯(50mL)萃取，之后将得到的全部有机层混合，用饱和氯化钠水溶液(50mL)进行2次洗涤。用硫酸钠使有机层干燥，减压蒸馏除去溶剂。将残渣利用泵在减压下，于25度干燥2小时，之后将得到的固体溶解于叔丁基甲基醚(TBME)(50mL)中，进行减压蒸馏除去溶剂。进一步，利用泵在减压下，通过于25度干燥1小时，由此得到了(2S，3R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁酸(残留有化合物aa01，Fmoc-Thr(THP)-OH，2.70g，30mol％的叔丁基甲基醚(TBME))源自THP保护上的不对称碳的非对映体形式。将得到的Fmoc-Thr(THP)-OH利用-25度的冰箱保存。
LCMS(ESI)m/z＝424.2(M-H)-
保留时间：0.84分钟，0.85分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-丁基甘氨酸(化合物aa02，Fmoc-nBuGly-OH) 的合成
在氢化钠(26g，1.08mol)的四氢呋喃(THF)溶液(500mL)中一点一点地于室温加入叔丁基(叔丁氧羰基)甘氨酸酯(Boc-Gly-OtBu)(100g，432.36mmol)，搅拌30分钟之后，滴加了1-碘丁烷(239g，1.30mol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(50mL)。将反应液于室温搅拌16小时后，加入水。在减压下除去四氢呋喃(THF)之后，使用乙酸乙酯萃取3次，将得到的有机溶剂利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过闪蒸柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，定量地得到了叔丁基N-(叔丁氧羰基)-N-丁基甘氨酸酯(Boc-nBuGly-OtBu)(130g)。
在通过上述方法得到的叔丁基N-(叔丁氧羰基)-N-丁基甘氨酸酯(Boc-nBuGly-OtBu)(260g，904.68mmol)的1，4-二噁烷溶液(1000mL)中在0度滴加了浓盐酸(1000mL)。将反应液升温至室温之后，于室温搅拌16小时。通过将反应液浓缩，由此以粗产物形式得到了丁基甘氨酸(H-nBuGly-OH)(200g)的盐酸盐。
将粗产物丁基甘氨酸(H-nBuGly-OH)(60g)，碳酸钾(188.9g，1.37mol)，水/1，4-二噁烷(1∶1)(3000mL)的混合物于室温搅拌30分钟之后于室温，一点一点地加入了N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(183.2g，543.09mmol)。将反应液于室温搅拌16小时之后，利用醚洗涤3次。加入5M盐酸水溶液至得到的水层达到pH＝3之后，用乙酸乙酯萃取3次。将有机溶剂利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的粗产物利用醚洗涤，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-丁基甘氨酸(化合物aa02，Fmoc-nBuGly-OH)(121g)。
LCMS(ESI)m/z＝354(M+H)+
保留时间：0.87分钟(分析条件SQDFA05)
Fmoc-Ser(iPen)-OH(化合物aa04)的合成依照以下方案进行。
N-(叔丁氧羰基)-O-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-L-丝氨酸(化合物aa03)的合成
将(叔丁氧羰基)-L-丝氨酸(Boc-Ser-OH)(50g，234.65mmol)溶解于中二甲基甲酰胺(DMF)(250mL)，在冰冷却下(0度)加入氢化钠(22g，916.67mmol，60％油分散)。在冰冷却下搅拌30分钟之后，滴加了1-溴-3-甲基丁-2-烯(44g，295.24mmol)。加入后，将反应液于25度搅拌16小时之后，加入冰水使反应急冷，加入盐酸水溶液(5M)将pH从2调节至3。之后，利用乙酸乙酯萃取2次，用饱和食盐水洗涤有机层，利用无水硫酸钠进行干燥。过滤之后，通过减压浓缩而除去乙酸乙酯，得到了包含目标物的粗产物。将该粗产物通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0→80/20)纯化，得到了N-(叔丁氧羰基)-O-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-L-丝氨酸(化合物aa03)(32g，48％)。
LCMS(ESI)m/z＝296(M+Na)+
保留时间：1.39分钟(分析条件SMD方法7)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-异戊基-L-丝氨酸(化合物aa04，Fmoc-Ser (iPen)-OH)的合成
将N-(叔丁氧羰基)-O-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-L-丝氨酸(化合物aa03)(185g，676.85mmol)，氨的甲醇溶液(2M，555mL)，Pd/C(18.5g)及甲醇(1500mL)混合，在氢气氛围中(5atm)，于室温搅拌16小时。通过过滤除去固体之后，通过减压浓缩除去溶剂，由此得到了N-(叔丁氧羰基)-O-异戊基-L-丝氨酸(Boc-Ser(iPen)-OH)(183g)得到了。
将得到的N-(叔丁氧羰基)-O-异戊基-L-丝氨酸(Boc-Ser(iPen)-OH)(175g)溶解于中1，4-二噁烷(500mL)，加入浓盐酸(300mL)之后，于室温搅拌16小时。将反应液减压浓缩，将得到的粗产物(122g)溶解于中1，4-二噁烷/水(1000mL/1000mL)，加入碳酸钾(239g，1.73mol)及N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(234g，694.36mmol)于室温搅拌16小时。之后，将反应液用己烷洗涤3次。洗涤之后，加入盐酸水溶液(6M)将水层的pH从2调节至3，用乙酸乙酯萃取2次。将有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤后减压浓缩而除去溶剂。将得到的粗产物用醚，己烷，乙酸乙酯洗涤，进一步以反相柱层析(水/乙腈＝100/0→30/70)进行纯化，以白色固体形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-异戊基-L-丝氨酸(化合物aa04，Fmoc-Ser(iPen)-OH)(95g，41％)。
LCMS(ESI)m/z＝398(M+H)+
保留时间：2.29分钟(分析条件SMD方法18)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-苯基丁酸(化合物aa05， Fmoc-MeHph-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-苯基丁酸(100g，244.11mmol)的甲苯溶液(1.5L)中于室温加入甲苯磺酸(TsOH)(2.575g，14.95mmol)，多聚甲醛(15.96g，488.77mmol)，在110℃搅拌16小时。在有机层中加入水，用水洗涤3次之后，将得到的有机层和得到的水层用乙酸乙酯萃取，将得到的有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，以粗产物形式得到了100g的(S)-5-氧代-4-苯乙基噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯。
在如上得到的(9H-芴-9-基)(S)-5-氧代-4-苯乙基噁唑烷-3-羧酸酯(50g，118.51mmol)的二氯甲烷溶液(700mL)中加入三乙基硅烷(Et3SiH)，三氟乙酸(TFA)(700mL)，在25℃搅拌16小时。将反应液减压浓缩，向得到的残渣加入碳酸钾水溶液，利用石油醚进行洗涤。得到的水层使用浓盐酸调整使得pH＝3，利用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，向得到的残渣中加入甲醇，己烷，再次减压浓缩，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-苯基丁酸(化合物aa05，Fmoc-MeHph-OH)(29.5g，58％，2个工序)。
LCMS(ESI)m/z＝416(M+H)+
保留时间：0.95分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物 aa12，Fmoc-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)的合成
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa12，Fmoc-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)通过下述途径合成。
(5-氟吡啶-3-基)甲醇(化合物aa07)的合成
在氮气氛围中，在市售的5-氟烟酸(化合物aa06)(14.1g，100mmol)中加入THF(200mL)，使用机械搅拌器搅拌。然后，于室温加入三乙胺(19.51mL，140mmol)，搅拌至固体完全溶解之后，将反应液使用冰浴冷却。之后，滴加氯甲酸乙酯(11.5mL，120mmol)，冰浴下搅拌30分钟。之后，使用干冰浴将反应液冷却使得为-60℃以下，以使得反应液不超过-20℃的方式，经历5分钟以上滴加了LiAlH4(氢化铝锂)的THF溶液(2.5M，40mL，100mmol)。将反应液在78℃搅拌3小时之后，以使得反应液不超过-20℃的方式加入了乙酸乙酯(69mL)。之后，使用冰浴进一步搅拌1小时，加入水(18mL)并于室温搅拌15分钟。将反应液使用NH硅胶过滤，减压浓缩，由此以黄色油状成分形式得到了(5-氟吡啶-3-基)甲醇(化合物aa07)(9.28g，73％)。
LCMS(ESI)m/z＝128(M+H)+
保留时间：0.28分钟(分析条件SQDFA05)
3-(溴甲基)-5-氟吡啶氢溴酸盐(化合物aa08)的合成
将圆底烧瓶与经用丙酮/干冰冷却的冷凝器连接，在氮气氛围中，加入(5-氟吡啶-3-基)甲醇(化合物aa07)(8.21g，64.6mmol)，25％HBr乙酸溶液(96mL，388mmol)。需要说明的是，反应在开放体系中进行，为了补集产生的HBr而使用了1M氢氧化钠水溶液。在将反应液缓慢搅拌的同时从室温升温至100℃，进一步搅拌3小时。之后将反应液冷却至室温，重复进行缓慢加入二异丙醚(48ml)3次，将得到的固体过滤，由此以灰色固体的形式得到了3-(溴甲基)-5-氟吡啶氢溴酸盐(化合物aa08)(12.43g，71％)。
1H NMR(Varian400-MR，400MHz，d-DMSO)δ4.77(2H，s)，7.85-7.88(1H，m)，8.55-8.56(2H，m)
O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa10，Trt-Ser(3-F-5- Me-Pyr)-OH)的合成
在氮气氛围中，在叔戊醇钠(NaOtPen)(13.7g，125mmol)中加入THF(45.8mL)搅拌后，分成3次加入市售的三苯甲基丝氨酸的三乙胺盐(Trt-Ser-OH三乙胺盐)(化合物aa09)(11.24g，25mmol)，于室温搅拌30分钟。将反应液使用冰浴搅拌15分钟，冷却之后，滴加3-(溴甲基)-5-氟吡啶氢溴酸盐(化合物aa08)(8.13g，30mmol)的DMF溶液(16mL)，进一步加入DMF(14mL)。将反应液在冰浴下搅拌45分钟之后，滴加3-(溴甲基)-5-氟吡啶氢溴酸盐(化合物aa08)(2.03g，7.5mmol)的DMF溶液(4.0mL)，进一步加入DMF(4.0mL)。之后，将反应液于室温进一步搅拌1小时，加入水(125mL)。将得到的混合液用叔丁基甲基醚(TBME)洗涤，将有机层用水萃取。将得到的水层汇总，使用饱和磷酸二氢钠水溶液(15mL)调整pH＝7之后，使用乙酸乙酯萃取2次。汇总得到的有机层，用将饱和食盐水稀释2倍而成的溶液洗涤3次，之后利用饱和食盐水洗涤2次。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，以黄色非晶形式得到了O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa10，Trt-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)(11.07g，97％)。
LCMS(ESI)m/z＝455(M-H)-
保留时间：0.86分钟(分析条件SQDFA05)
O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa11，H-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)) 的合成
在O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa10，Trt-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)(10.76g，23.57mmol)的1.4-二噁烷溶液(21.5mL)中于室温加入5～10％的盐酸/甲醇溶液(64.2mL)。于室温将反应液搅拌10分钟至20分钟后，加入1.4-二噁烷(135mL)。进一步追加加入1.4-二噁烷(90mL)之后，如下述所示的方式，加入事前少量制备的晶种(5mg)，于室温进一步搅拌30分钟。将得到的固体过滤，通过用二异丙醚(50mL)洗涤4次，在减压下干燥，由此以盐酸盐形式得到了O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa11，H-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH))(6.58g，95％)。
LCMS(ESI)m/z＝213(M-H)-
保留时间：0.24分钟(分析条件SQDAA05)
O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa11，H-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)) 的晶种的制备
在O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa10，Trt-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)(98mg，2.69mmol)的1.4-二噁烷溶液(819μL)中于室温加入5～10％的盐酸/甲醇溶液(2.45mL)，搅拌5小时。在反应液中加入1.4-二噁烷(6.0mL)，将得到的固体过滤，用二异丙醚洗涤，在减压下干燥，由此以盐酸盐形式得到了O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa11，H-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH))(222.5mg，86％)。
LCMS(ESI)m/z＝213(M-H)-
保留时间：0.24分钟(分析条件SQDAA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物 aa12，Fmoc-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)的合成
在O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa11，H-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH))的盐酸盐(6.37g，22.19mmol)中于室温加入水(42mL)，1.4-二噁烷(115mL)，二异丙基乙基胺(DIPEA)(13.53mL，78mmol)，搅拌。之后，在反应液中于室温加入N-琥珀酰亚胺9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc-OSu)(7.86g，23.3mmol)，于室温搅拌。通过LC-MS确认原料消失后，在反应液中于室温加入水(56.2mL)，用25％叔丁基甲基醚(MTBE)/己烷溶液洗涤2次。将得到的水层使用饱和磷酸二氢钠水溶液(NaH2PO4)调整使得成为pH＝6.1。之后，利用乙酸乙酯萃取2次，汇总得到的有机层，利用饱和食盐水稀释2倍而成的溶液、饱和食盐水进行洗涤。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，以黄色固体形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氟吡啶-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa12，Fmoc-Ser(3-F-5-Me-Pyr)-OH)(9.47g，98％)。
LCMS(ESI)m/z＝437(M+H)+
保留时间：0.86分钟(分析条件SQDAA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa16， Fmoc-Ser(Ph-3-Cl)-OH)的合成
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa16，Fmoc-Ser(Ph-3-Cl)-OH)通过下述途径合成。
3-(3-氯苯氧基)-2-(三苯甲基氨基)丙酸(S)-甲基(Trt-Ser(Ph-3-Cl)-OMe)(化 合物aa14)的合成
在氮气氛围中，在市售的3-羟基-2-(三苯甲基氨基)丙酸(S)-甲酯(化合物aa13，Trt-Ser-OMe)(6.0g，16.6mmol)和三苯基膦(PPh3)(8.71g，33.2mmol)的甲苯溶液(35mL)中于室温加入2.2M的二乙基偶氮羧酸盐(DEAD)的甲苯溶液(15.06mL，33.2mmol)，将反应液在50℃搅拌30分钟。将反应液减压浓缩，之后将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，得到了3-(3-氯苯氧基)-2-(三苯甲基氨基)丙酸(S)-甲基(Trt-Ser(Ph-3-Cl)-OMe)(化合物aa14)(4.43g，57％)。
1H NMR(Varian400-MR，400MHz，d-DMSO)δ7.42-7.44(6H，m)，7.28-7.30(7H，m)，7.20-7.21(3H，m)，6.99-7.01(2H，m)，6.83-6.85(1H，m)，4.19-4.22(1H，m)，4.06-4.08(1H，m)，3.49-3.51(1H，m)，3.17(3H，s)
(S)-2-氨基-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa15，H-Ser(Ph-3-Cl)-OH)的合成
在3-(3-氯苯氧基)-2-(三苯甲基氨基)丙酸(S)-甲基(Trt-Ser(Ph-3-Cl)-OMe)(化合物aa14)(3.9g，8.26mmol)的1.4-二噁烷溶液(80mL)中于室温加入1.0M氢氧化锂/甲醇溶液(83mL)，将反应液在50℃搅拌3小时。将反应液减压浓缩之后，向得到的残渣中加入三氟乙酸(TFA)(30mL)，在50℃搅拌10分钟。之后，将反应液减压浓缩，将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈)纯化，得到了(S)-2-氨基-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa15，H-Ser(Ph-3-Cl)-OH)(850mg，48％，2个工序)。
LCMS(ESI)m/z＝216(M+H)+
保留时间：0.37分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa16， Fmoc-Ser(Ph-3-Cl)-OH)的合成
在(S)-2-氨基-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa15，H-Ser(Ph-3-Cl)-OH)(850mg，3.94mmol)和N-琥珀酰亚胺9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc-OSu)(1.33g，3.94mmol)中于室温加入1，4-二噁烷(20mL)和水(20mL)之后，加入碳酸铯(2.569g，7.88mmol)，于室温搅拌。通过LC-MS确认原料消失后，加入水(20mL)，用二乙醚(40mL)洗涤2次。得到的水层使用5N盐酸水溶液调整至成为pH＝2，利用乙酸乙酯萃取2次。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-氯苯氧基)丙酸(化合物aa16，Fmoc-Ser(Ph-3-Cl)-OH)(1.42g，82％)。
LCMS(ESI)m/z＝438(M+H)+
保留时间：0.91分钟(分析条件SQDFA05)
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)己 酸(化合物aa17，Fmoc-Nle(6-OTHP)-OH)的合成
将通过市售购买的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-羟基己酸(Fmoc-Nle(6-OH)-OH)(3g，8.12mmol)和对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(408mg，1.62mmol)的甲苯溶液(10mL)进行减压浓缩，实施共沸脱水。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(15mL)，加入二氢吡喃(5.41mL，56.8mmol)在50度搅拌1小时。室温下，向反应液中加入乙酸乙酯，利用饱和食盐水对有机层洗涤2次，之后将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压浓缩。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(30ml)，加入pH已调节为8的磷酸缓冲液(30ml)，在50度搅拌3小时。室温下，将反应液利用乙酸乙酯进行萃取两次，用饱和食盐水洗涤得到的有机层，将有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压浓缩。将得到的残渣溶解于乙醚(50ml)，向其加入庚烷(50ml)由此使粗产物沉淀，进行减压浓缩，由此除去乙醚，将残留的上清溶液通过倾析而除去。将该操作重复两次，由此得到了粗产物。将得到的粗产物溶解于叔丁基甲基醚(150ml)中，加入0.05M磷酸水溶液(150ml)，于室温搅拌1小时。将有机层回收，利用乙酸乙酯萃取水层。将得到的有机层合并之后，用饱和食盐水洗涤2次，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)己酸(化合物aa17，Fmoc-Nle(6-OTHP)-OH)(2.925g，79％)。
LCMS(ESI)m/z＝454(M+H)+
保留时间：0.86分钟(分析条件SQDFA05)
甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa18，Cbz-Ser (EtOBn)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(25.0g，106mmol)及2-(苄氧基)乙烷-1-醇(23.8g，156mmol)溶解于二氯甲烷(100mL)中，冷却至0度后，加入三氟化硼二乙醚络合物(2.00mL，15.9mmol)在0度搅拌1小时。向反应液中加入水，利用二氯甲烷萃取2次之后，用碳酸钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa18，Cbz-Ser(EtOBn)-OMe)(30.0g，73％)。
LCMS(ESI)m/z＝388(M+H)+
保留时间：1.13分钟(分析条件SMD方法9)
N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa19，Cbz-Ser (EtOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，将氢氧化锂一水合物(13.9g，331mmol)，氯化钙(129g，1.24mol)溶解于水(321mL)中。向其中于室温加入甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa18，Cbz-Ser(EtOBn)-OMe)(30.0g，77.4mmol)的2-丙醇/四氢呋喃溶液(1.28L/321mL)，搅拌3小时。加入2M盐酸水溶液至达到pH2，除去有机层后，将水层用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa19，Cbz-Ser(EtOBn)-OH)(30.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-(2-羟乙基)-L-丝氨酸(化合物aa20，H-Ser(EtOH)-OH)的合成
在氢气氛围中，将N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa19，Cbz-Ser(EtOBn)-OH)(34.0g，91.1mmol)和钯碳(6.80g，20％w/w)溶解于甲醇(500mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-(2-羟乙基)-L-丝氨酸(化合物aa20，H-Ser(EtOH)-OH)(10.7g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟乙基)-L-丝氨酸(化合物aa21，Fmoc- Ser(EtOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将O-(2-羟乙基)-L-丝氨酸(化合物aa20，H-Ser(EtOH)-OH)(5.00g，33.5mmol)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(12.4g，36.9mmol)及碳酸钠10.6g，100mmol)溶解于水/1，4-二噁烷(136mL/56.0mL)中，于室温搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚洗涤3次之后，在水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH2，用乙酸乙酯萃取3次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟乙基)-L-丝氨酸(化合物aa21，Fmoc-Ser(EtOH)-OH)(12.0g，96％)。
LCMS(ESI)m/z＝372(M+H)+
保留时间：1.31分钟(分析条件SMD方法33)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-L-丝 氨酸(化合物aa22，Fmoc-Ser(EtOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟乙基)-L-丝氨酸(化合物aa21，Fmoc-Ser(EtOH)-OH)(1.6g，4.31mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(2.728mL，30.3mmol)的四氢呋喃(8.616mL)溶液中，加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(54.1mg，0.215mmol)，在50度搅拌2小时。将混合物冷却之后，加入乙酸乙酯。接着，利用饱和食盐水对有机层洗涤3次，利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(10mL)中，然后加入0.05M的磷酸缓冲液(100mL)(将1M的磷酸二氢钠(NaH2PO4)水溶液(94.3mL)和1M的磷酸氢2钠(Na2HPO4)水溶液(5.7mL)混合而制备)。该将混合物于室温搅拌10分钟之后，用叔丁基甲基醚萃取，用饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa22，Fmoc-Ser(EtOTHP)-OH)(1.75g，96％)。
LCMS(ESI)m/z＝456(M+H)+
保留时间：0.81分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-4-((2-(苄氧基)乙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa23) 的合成
将N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa19，Cbz-Ser(EtOBn)-OH)(30.0g，80.3mmol)，多聚甲醛(7.20g)及对甲苯磺酸(0.83g，4.82mmol)溶解于甲苯(300mL)中，在110度搅拌16小时。冷却至室温之后，用碳酸氢钠水溶液洗涤，将有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了(S)-4-((2-(苄氧基)乙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa23)(27.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa24，Cbz- MeSer(EtOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，在(S)-4-((2-(苄氧基)乙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa23)(27.0g，70.1mmol)的二氯甲烷溶液(450mL)中加入三乙基硅烷(24.4g，210mmol)和三氟乙酸(450mL)，于室温搅拌48小时。将反应液减压蒸馏而除去，进一步利用减压泵在减压下进行干燥后，再溶解于碳酸钾水溶液中，用二乙醚洗涤，加入浓盐酸至达到pH2后，用乙酸乙酯萃取2次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa24，Cbz-MeSer(EtOBn)-OH)(24.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-(2-羟乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa25，H-MeSer(EtOH)-OH)的合成
在氢气氛围中，将N-((苄氧基)羰基)-O-(2-(苄氧基)乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa24，Cbz-MeSer(EtOBn)-OH)(24.0g，62.0mmol)和钯碳(2.40g，10％w/w)溶解于甲醇(400mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-(2-羟乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa25，H-MeSer(EtOH)-OH)(12.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa26， Fmoc-MeSer(EtOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将O-(2-羟乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa25，H-MeSer(EtOH)-OH)(12g，73.54mmol)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(27.3g，81.0mmol)及碳酸钠27.3g，258mmol)溶解于水/1，4-二噁烷(320mL/160mL)中，于室温搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚洗涤3次之后，在水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH2，用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa26，Fmoc-MeSer(EtOH)-OH)(20.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙 基)-L-丝氨酸(化合物aa27，Fmoc-MeSer(EtOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa26，Fmoc-MeSer(EtOH)-OH)(18.0g，46.7mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中，加入对甲苯磺酸吡啶(0.59g，2.34mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(27.5g，327mmol)，在50度搅拌3小时。将混合物冷却至25度，加入乙酸乙酯。接着，利用饱和食盐水对有机层进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣(31g)中的25.0g溶解于四氢呋喃(200mL)中，然后加入调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(200mL)。将该混合物在50度搅拌3小时。冷却至25度之后，加入乙酸乙酯，将有机层与水层分离。在水层中加入乙酸乙酯进行萃取后，将得到的全部有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa27，Fmoc-MeSer(EtOTHP)-OH)(20.0g)。
LCMS(ESI)m/z＝487(M+NH4)+
保留时间：0.68分钟(分析条件SMD方法11)
(4S)-4-甲基-2-苯基-1，3-二氧杂环戊烷(化合物aa28)的合成
在氮气氛围中，在(S)-丙烷-1，2-二醇(20.0g，263mmol)的甲苯(200mL)溶液中加入苯甲醛(29.3g，276mmol)及对甲苯磺酸(0.45g，2.61mmol)，在130度搅拌16小时。将反应液浓缩，残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了(4S)-4-甲基-2-苯基-1，3-二氧杂环戊烷(化合物aa28)(31.5g，73％)。
LCMS(ESI)m/z＝165(M+H)+
保留时间：0.89分钟(分析条件SMD方法12)
(2S)-2-(苄氧基)丙烷-1-醇(化合物aa29)的合成
在氮气氛围中，在(4S)-4-甲基-2-苯基-1，3-二氧杂环戊烷(化合物aa28)(32g，194.88mmol)的二氯甲烷(1.00L)溶液中，在-50度加入氢化二异丁基铝的1M己烷溶液(390mL，390mmol)，在该温度搅拌15分钟之后，于室温搅拌2小时。加入饱和氯化铵水溶液而终止反应后，利用二氯甲烷萃取2次。将混合的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了(2S)-2-(苄氧基)丙烷-1-醇(化合物aa29)(35.5g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
甲基N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa30， Cbz-Ser(S-2-PrOBn)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(25.0g，106mmol)及(2S)-2-(苄氧基)丙烷-1-醇(化合物aa29)(26.5g，159mmol)溶解于二氯甲烷(188mL)中，冷却至0度后，加入三氟化硼二乙醚络合物(2.75mL)在0度搅拌1小时30分钟。向反应液中加入水，利用二氯甲烷萃取之后，用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了甲基N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa30，Cbz-Ser(S-2-PrOBn)-OMe)(30.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa31，Cbz-Ser (S-2-PrOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，将氢氧化锂一水合物(10.5g)氯化钙(103g)溶解于水(300mL)中。向其中于室温加入甲基N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa30，Cbz-Ser(S-2-PrOBn)-OMe)(25g，62.3mmol)的2-丙醇/四氢呋喃溶液(1.20L/300mL)，搅拌5小时。加入2M盐酸水溶液至达到pH2，除去有机层后，将水层用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa31，Cbz-Ser(S-2-PrOBn)-OH)(25.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-((S)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa32，H-Ser(S-2-PrOH)-OH)的合成
在氢气氛围中，将N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa31，Cbz-Ser(S-2-PrOBn)-OH)(3.00g，7.74mmol)和钯碳(0.30g，10％w/w)溶解于甲醇(50.0mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-((S)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa32，H-Ser(S-2-PrOH)-OH)(0.78g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa33， Fmoc-Ser(S-2-PrOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将O-((S)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa32，H-Ser(S-2-PrOH)-OH)(0.78g，4.78mmol)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(1.61g，4.78mmol)及N-乙基-异丙基丙烷-2-胺(DIPEA)(0.93mg，7.17mmol)溶解于水/1，4-二噁烷(8.00mL/22.0mL)中，于室温搅拌30分钟。将反应液用己烷(18.0mL)/叔丁基甲基醚(6.00mL)洗涤2次之后，在水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH2，用乙酸乙酯(20.0mL)萃取2次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa33，Fmoc-Ser(S-2-PrOH)-OH)(1.62g，88％)。
LCMS(ESI)m/z＝386(M+H)+
保留时间：0.68分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((2S)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙 基)-L-丝氨酸(化合物aa34，Fmoc-Ser(S-2-PrOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa33，Fmoc-Ser(S-2-PrOH)-OH)(83mg，0.22mmol)的四氢呋喃(1.00mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶(2.71mg，0.01mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(0.13g，1.51mmol)，在50度搅拌2小时。将混合物冷却至25度，加入乙酸乙酯。接着，利用饱和食盐水对有机层进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(1.00mL)中，然后加入调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(1.00mL)。将该混合物在50度搅拌3小时。冷却至25度之后，加入乙酸乙酯(175mL)，将有机层和水层分离。在水层中加入乙酸乙酯(175mL)进行萃取后，将得到的全部有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((2S)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa34，Fmoc-Ser(S-2-PrOTHP)-OH)(88.0mg，87％)。
LCMS(ESI)m/z＝468(M-H)-
保留时间：0.86分钟，0.87分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-4-(((S)-2-(苄氧基)丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物 aa35)的合成
将N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa31，Cbz-Ser(S-2-PrOBn)-OH)(25.0g，64.53mmol)，多聚甲醛(5.80g)及对甲苯磺酸(0.67g，3.89mmol)溶解于甲苯(250mL)中，在110度搅拌16小时。冷却至室温之后，用碳酸氢钠水溶液洗涤，将有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了(S)-4-(((S)-2-(苄氧基)丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa35)(18.6g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa36， Cbz-MeSer(S-2-PrOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，在(S)-4-(((S)-2-(苄氧基)丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa35)(18.6g，46.6mmol)的二氯甲烷溶液(296mL)中加入三乙基硅烷(16.2g，139mmol)和三氟乙酸(296mL)，于室温搅拌48小时。将反应液减压蒸馏而除去，进一步利用减压泵在减压下进行干燥之后，再溶解于碳酸钾水溶液中，用二乙醚洗涤，加入浓盐酸至达到pH2后，用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa36，Cbz-MeSer(S-2-PrOBn)-OH)(9.4g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-((S)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa37，H-MeSer(S-2-PrOH)-OH)的合 成
在氢气氛围中，将N-((苄氧基)羰基)-O-((S)-2-(苄氧基)丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa36，Cbz-MeSer(S-2-PrOBn)-OH)(9.40g，23.4mmol)和钯碳(1.80g，10％w/w)溶解于甲醇(185mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-((S)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa37，H-MeSer(S-2-PrOH)-OH)(3.40g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物 aa38，Fmoc-MeSer(S-2-PrOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将O-((S)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa37，H-MeSer(S-2-PrOH)-OH)(3.40g，19.2mmol)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(7.12g，22.1mmol)及碳酸钠7.13g，67.3mmol)溶解于水/1，4-二噁烷(80.0mL/40.0mL)中，于室温搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚洗涤3次之后，在水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH2，用乙酸乙酯萃取3次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa38，Fmoc-MeSer(S-2-PrOH)-OH)(8.00g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-((2S)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa39，Fmoc-MeSer(S-2-PrOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa38，Fmoc-MeSer(S-2-PrOH)-OH)(80.0g，20.0mmol)的四氢呋喃(40.0mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶(0.26g，1.02mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(11.8g，140mmol)，在50度搅拌2小时。将混合物冷却至25度，加入乙酸乙酯。接着，利用饱和食盐水对有机层进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣(9.30g)溶解于四氢呋喃(50.0mL)中，然后调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(50.0mL)加入。将该混合物在50度搅拌3小时。冷却至25度之后，加入乙酸乙酯，将有机层与水层分离。在水层中加入乙酸乙酯进行萃取后，将得到的全部有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，将得到的残渣通过反相柱层析(0.5％碳酸氢铵水溶液/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-((2S)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa39，Fmoc-MeSer(S-2-PrOTHP)-OH)(7.00g，72％)。
LCMS(ESI)m/z＝501(M+NH4)+
保留时间：0.82分钟(分析条件SMD方法10)
(4R)-4-甲基-2-苯基-1，3-二氧杂环戊烷(化合物aa40)的合成
在氮气氛围中，在(R)-丙烷-1，2-二醇(20g，262.83mmol)的甲苯(200mL)溶液中加入苯甲醛(29.3g，276mmol)及对甲苯磺酸(0.45g，2.61mmol)，在130度搅拌16小时。将反应液浓缩，残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了(4R)-4-甲基-2-苯基-1，3-二氧杂环戊烷(化合物aa40)(31.5g，73％)。
LCMS(ESI)m/z＝163(M-H)-
保留时间：7.21分钟(分析条件GC01)
(2R)-2-(苄氧基)丙烷-1-醇(化合物aa41)的合成
在氮气氛围中，在(4R)-4-甲基-2-苯基-1，3-二氧杂环戊烷(化合物aa40)(32.0g，195mmol)的二氯甲烷(1.00L)溶液中，在-50度加入氢化二异丁基铝的1M己烷溶液(390mL，390mmol)，于该温度搅拌15分钟之后，于室温搅拌2小时。加入饱和氯化铵水溶液而终止反应后，利用二氯甲烷萃取2次。将混合而成的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了(2R)-2-(苄氧基)丙烷-1-醇(化合物aa41)(35.5g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
甲基N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa42， Cbz-Ser(R-2-PrOBn)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(25g，106.28mmol)及(2R)-2-(苄氧基)丙烷-1-醇(化合物aa41)(26.5g，159mmol)溶解于二氯甲烷(188mL)中，冷却至0度后，加入三氟化硼二乙醚络合物(2.75mL)，在0度搅拌1小时30分钟。向反应液中加入水，利用二氯甲烷萃取之后，用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了甲基N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa42，Cbz-Ser(R-2-PrOBn)-OMe)(50.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa43，Cbz-Ser (R-2-PrOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，将氢氧化锂一水合物(10.5g)氯化钙(103g)溶解于水(300mL)中。向其中于室温加入甲基N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa42，Cbz-Ser(R-2-PrOBn)-OMe)(25.0g，62.3mmol)的2-丙醇/四氢呋喃溶液(1.50L/150mL)，搅拌5小时。加入2M盐酸水溶液至达到pH2，除去有机层后，将水层用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa43，Cbz-Ser(R-2-PrOBn)-OH)(25.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-((R)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa44，H-Ser(R-2-PrOH)-OH)的合成
在氢气氛围中，将N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa43，Cbz-Ser(R-2-PrOBn)-OH)(2.87g，7.41mmol)和钯碳(570mg，20％w/w)溶解于甲醇(50mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣利用乙酸乙酯在60度重结晶，由此得到了O-((R)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa44，H-Ser(R-2-PrOH)-OH)(900mg，74％)。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa45， Fmoc-Ser(R-2-PrOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将通过上述方法合成的O-((R)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa44，H-Ser(R-2-PrOH)-OH)(5.0g，30.64mmol)，碳酸氢钠(7.71g，91.8mmol)溶解于水/1，4-二噁烷(127mL/52.9mL)中，于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(10.85g，32.2mmol)，搅拌4小时。在反应液中加入水，用叔丁基甲基醚洗涤之后，在水层中加入浓盐酸至达到pH3，用叔丁基甲基醚萃取2次，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa45，Fmoc-Ser(R-2-PrOH)-OH)(8g，68％)。
LCMS(ESI)m/z＝386(M+H)+
保留时间：2.08分钟(分析条件SMD方法49)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((2R)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙 基)-L-丝氨酸(化合物aa46，Fmoc-Ser(R-2-PrOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa45，Fmoc-Ser(R-2-PrOH)-OH)(4.4g，11.4mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶(143mg，5.7mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(6.7g，79.8mmol)，在50度搅拌3小时。将混合物于室温冷却，加入叔丁基甲基醚之后，用饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤，得到的进行减压蒸馏除去溶剂，得到了粗产物(8g)。在得到的粗产物(800mg)中加入四氢呋喃(10mL)和调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(10mL)的混合液，在50度搅拌3小时。将反应液于室盐冷却之后，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤，进行过滤。将得到的溶液利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(0.5％碳酸氢铵水溶液/乙腈)纯化，汇总得到的级分并减压蒸馏除去乙腈。向得到的水层中加入调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液，用叔丁基甲基醚萃取3次，减压蒸馏除去溶剂，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((2R)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa46，Fmoc-Ser(R-2-PrOTHP)-OH)(400mg，2个工序65％)。
LCMS(ESI)m/z＝468(M-H)-
保留时间：0.85分钟，0.87分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-4-(((R)-2-(苄氧基)丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物 aa47)的合成
将N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa43，Cbz-Ser(R-2-PrOBn)-OH)(25.0g，64.5mmol)，多聚甲醛(5.80g)及对甲苯磺酸(0.67g，3.89mmol)溶解于甲苯(250mL)中，在110度搅拌16小时。冷却至室温之后，用碳酸氢钠水溶液洗涤，将有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了(S)-4-(((R)-2-(苄氧基)丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa47)(18.6g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa48， Cbz-MeSer(R-2-PrOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，在(S)-4-(((R)-2-(苄氧基)丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物aa47)(18.6g，46.6mmol)的二氯甲烷溶液(296mL)中加入三乙基硅烷(16.2g，139mmol)和三氟乙酸(296mL)，于室温搅拌48小时。将反应液减压蒸馏而除去，进一步利用减压泵在减压下进行干燥后，再溶解于碳酸钾水溶液中，用二乙醚洗涤，加入浓盐酸至达到pH2后，用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa48，Cbz-MeSer(R-2-PrOBn)-OH)(9.40g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-((R)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa49，H-MeSer(R-2-PrOH)-OH)的合 成
在氢气氛围中，将N-((苄氧基)羰基)-O-((R)-2-(苄氧基)丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa48，Cbz-MeSer(R-2-PrOBn)-OH)(9.40g，23.4mmol)和钯碳(1.80g，10％w/w)溶解于甲醇(185mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-((R)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa49，H-MeSer(R-2-PrOH)-OH)(3.40g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物 aa50，Fmoc-MeSer(R-2-PrOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将O-((R)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa49，H-MeSer(R-2-PrOH)-OH)(3.40g，19.2mmol)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(7.12g，22.1mmol)及碳酸钠7.13g，67.3mmol)溶解于水/1，4-二噁烷(80.0mL/40.0mL)中，于室温搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚洗涤3次之后，在水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH2，用乙酸乙酯萃取3次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa50，Fmoc-MeSer(R-2-PrOH)-OH)(8.00g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-((2R)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa51，Fmoc-MeSer(R-2-PrOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-2-羟丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa50，Fmoc-MeSer(R-2-PrOH)-OH)(8.00g，20.0mmol)的四氢呋喃(40.0mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶(0.26g，1.02mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(11.8g，139mmol)，在50度搅拌2小时。将混合物冷却至25度，加入乙酸乙酯。接着，利用饱和食盐水对有机层进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣(9.3g)溶解于四氢呋喃(100mL)中，然后加入调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(100mL)。将该混合物在50度搅拌3小时。冷却至25度之后，加入乙酸乙酯，将有机层与水层分离。在水层中加入乙酸乙酯进行萃取后，将得到的全部有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-((2R)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa51，Fmoc-MeSer(R-2-PrOTHP)-OH)(8.50g)。
LCMS(ESI)m/z＝501(M+NH4)+
保留时间：0.82分钟(分析条件SMD方法10)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa54，Fmoc-Ser(tBuOTHP)-OH)的合成按照以下方案进行。
甲基O-(2-(苄氧基)-2-甲基丙基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa52， Cbz-Ser(tBuOBn)-OMe)的合成
2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(2.0g，8.50mmol)及2-苄氧基-2-甲基-丙烷-1-醇(2.30g，12.75mmol)溶解于二氯甲烷(7.5mL)中，在冰冷却下经历5分钟滴加了三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(0.160mL，1.28mmol)。在冰冷却下搅拌30分钟之后，加入水(2.0mL)搅拌10分钟而终止反应，加入饱和碳酸氢钠水溶液。利用二氯甲烷萃取水层，将有机层利用无水硫酸镁干燥。过滤之后，通过减压浓缩除去有机溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯＝100/0→75/25)纯化，得到了甲基O-(2-(苄氧基)-2-甲基丙基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa52，Cbz-Ser(tBuOBn)-OMe)(2.36g，67％)。
LCMS(ESI)m/z＝416(M+H)+
保留时间：0.93分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟基-2-甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物 aa53，Fmoc-Ser(tBuOH)-OH)的合成
将甲基O-(2-(苄氧基)-2-甲基丙基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa52，Cbz-Ser(tBuOBn)-OMe)(2.36g，5.68mmol)溶解于甲醇(8.0mL)中。向其中添加将氢氧化锂一水合物(0.477g，11.36mmol)溶解于水(8.0mL)中而成的水溶液，于室温搅拌1小时。之后，加入2M的盐酸水溶液(8.52mL，17.04mmol)。将水层利用乙酸乙酯萃取3次，将有机层利用无水硫酸镁干燥。过滤之后，通过减压浓缩除去乙酸乙酯，得到了O-(2-(苄氧基)-2-甲基丙基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(Cbz-Ser(tBuOBn)-OH)。
将以上得到的O-(2-(苄氧基)-2-甲基丙基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(Cbz-Ser(tBuOBn)-OH)溶解于甲醇(45mL)中，加入Pd/C(456mg)，在氢气氛围化，于室温搅拌过夜。通过硅藻土过滤除去Pd/C之后，通过减压浓缩除去甲醇，由此定量地得到了O-(2-羟基-2-甲基丙基)-L-丝氨酸(H-Ser(tBuOH)-OH)(1.05g)。
将得到的O-(2-羟基-2-甲基丙基)-L-丝氨酸(H-Ser(tBuOH)-OH)(1.59g，8.97mL)及碳酸钠2.85g，26.9mmol)溶解于水(36mL)及1，4-二噁烷(15mL)中，慢慢加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(3.18g，9.42mmol)。于室温搅拌30分钟之后，在反应液中加入水(40mL)，用叔丁基甲基醚(60mL)洗涤3次。之后，在水层中加入2M的盐酸水溶液(26.9mL，53.8mmol)使水层的pH为1之后，用叔丁基甲基醚(60mL)萃取3次。将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤之后，将叔丁基甲基醚减压浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟基-2-甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa53，Fmoc-Ser(tBuOH)-OH)(2.62g，73％)。
LCMS(ESI)m/z＝400(M+H)+
保留时间：0.71分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙 基)-L-丝氨酸(化合物aa54，Fmoc-Ser(tBuOTHP)-OH)的合成
将N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟基-2-甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa53，Fmoc-Ser(tBuOH)-OH)(1.2g，3.00mmol)及3.4-二氢-2H-吡喃(1.90mL，21.03mmol)溶解于四氢呋喃(6.0mL)中，加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(0.038g，0.150mmol)，在50度搅拌2小时。之后，将反应液用乙酸乙酯(15mL)稀释，用饱和食盐水(15mL)洗涤3次。将有机层利用无水硫酸钠进行干燥之后，过滤，通过减压浓缩而除去溶剂。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(24.0mL)中，加入调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(24.0mL)，在50度搅拌3小时。将反应液用乙酸乙酯(45mL)稀释之后，用饱和食盐水(45mL)洗涤3次，将有机层用无水硫酸钠干燥。过滤之后，减压浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa54，Fmoc-Ser(tBuOTHP)-OH)(1.05g，72％)。
LCMS(ESI)m/z＝484(M+H)+
保留时间：0.91分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa55，Fmoc-MeSer(tBuOTHP)-OH)的合成按照以下方案进行。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基) 氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa55，Fmoc-MeSer(tBuOTHP)-OH)的合成
将N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟基-2-甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa53，Fmoc-Ser(tBuOH)-OH)(12g，30.04mmol)及多聚甲醛(2.75g，91.67mmol)溶解于三氟乙酸(31.4g，277.78mmol)及甲苯(60mL)中，于室温搅拌4小时。将反应液减压浓缩，之后将得到的残渣溶解于二氯甲烷，利用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤之后，利用无水硫酸钠进行干燥。过滤之后，通过减压浓缩除去二氯甲烷，由此得到了(S)-4-((2-羟基-2-甲基丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(12g，97％)。
将得到的(S)-4-((2-羟基-2-甲基丙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(1g，2.43mmol)溶解于三氟乙酸/二氯甲烷(13mL/13mL)中，滴加三乙基硅烷(Et3SiH)(832mg，7.16mmol)。于室温搅拌16小时之后，将反应液减压浓缩，将得到的残渣溶解于碳酸钾水溶液中，用叔丁基甲基醚洗涤之后，在水层中加入盐酸水溶液(1M)调节pH至2。将水层用叔丁基甲基醚萃取2次之后，将有机层用水，饱和食盐水各洗涤2次，用无水硫酸钠干燥。过滤之后，减压浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈＝100/0→50/50)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(Fmoc-MeSer(tBuOH)-OH)(700mg，70％)。
将得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-甲基-L-丝氨酸(Fmoc-MeSer(tBuOH)-OH)(6g，14.51mmol)和对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(182mg，0.73mmol)溶解于四氢呋喃(48mL)中，在氮气氛围化，于室温滴加3，4-二氢-2H-吡喃(8.5g，101.05mmol)。将反应液在50度搅拌5小时之后，向反应液中加入乙酸乙酯，进行了萃取。将有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤之后，进行减压浓缩，以混合物的形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸、及四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸。
将得到的混合物(50g)溶解于磷酸缓冲液(1M，pH＝6.8，1000mL)及四氢呋喃(1000mL)中，在50度搅拌4小时。之后，将反应液利用乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水洗涤有机层之后，利用无水硫酸钠进行干燥，过滤后减压浓缩。将得到的残渣通过反相柱层析(0～40％0.5％碳酸氢铵水溶液/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(2-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa55，Fmoc-MeSer(tBuOTHP)-OH)(20g)。
LCMS(ESI)m/z＝498(M+H)+
保留时间：0.94分钟(分析条件SMD方法20)
4，4-二甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa56)的合成
在氮气氛围中，在3-甲基丁烷-1，3-二醇(40.0g，384mmol)的氯仿(400mL)溶液中，加入二甲氧基甲基苯(87.6g，576mmol)及对甲苯磺酸(3.59g，18.9mmol)，在0度搅拌1.5小时。将反应液浓缩，残渣通过柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了4，4-二甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa56)(70.0g，95％)。
3-(苄氧基)-3-甲基丁烷-1-醇(化合物aa57)的合成
在氮气氛围中，在通过上述方法得到的4，4-二甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa56)(5.00g，26.0mmol)的二氯甲烷(130mL)溶液中，在-50度加入氢化二异丁基铝的1M己烷溶液(156mL，156mmol)，于该温度搅拌15分钟之后，于室温搅拌1小时。加入甲醇终止反应后，利用二氯甲烷萃取2次。将混合而成的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，残渣通过柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了3-(苄氧基)-3-甲基丁烷-1-醇(化合物aa57)(2.00g，40％)。
甲基O-(3-(苄氧基)-3-甲基丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa58， Cbz-Ser(2-Me-BuOBn)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(25g，106mmol)及3-(苄氧基)-3-甲基丁烷-1-醇(化合物aa57)(31.0g，159mmol)溶解于二氯甲烷(113mL)中，冷却至0度后，加入三氟化硼二乙醚络合物(2.26g，15.9mmol)，在0度搅拌3小时。向反应液中加入水，利用二氯甲烷萃取之后，用饱和碳酸钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，残渣通过柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了甲基O-(3-(苄氧基)-3-甲基丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa58，Cbz-Ser(2-Me-BuOBn)-OMe)(28.0g，55％)。
LCMS(ESI)m/z＝452(M+Na)+
保留时间：1.46分钟(分析条件SMD方法13)
O-(3-(苄氧基)-3-甲基丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa59，Cbz- Ser(2-Me-BuOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，将氢氧化锂一水合物(11.2g)氯化钙(110g)溶解于水(278mL)中。向其中于室温加入甲基O-(3-(苄氧基)-3-甲基丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa58，Cbz-Ser(2-Me-BuOBn)-OMe)(28.7g，68.4mmol)的2-丙醇/四氢呋喃溶液(278mL/1115mL)，搅拌5小时。加入2M盐酸水溶液至达到pH2，除去有机层后，将水层用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层混合，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-(3-(苄氧基)-3-甲基丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa59，Cbz-Ser(2-Me-BuOBn)-OH)(28.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物aa60，H-Ser(2-Me-BuOH)-OH)的合成
在氢气氛围中，O-(3-(苄氧基)-3-甲基丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa59，Cbz-Ser(2-Me-BuOBn)-OH)(28.0g，67.4mmol)和钯碳(6.00g，20％w/w)-甲醇(500mL)溶解于中，于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥后，从甲醇/二氯甲烷(1/5)进行重结晶，得到了O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物aa60，H-Ser(2-Me-BuOH)-OH)(7.00g，54％)。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物 aa61，Fmoc-Ser(2-Me-BuOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，将O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物aa60，H-Ser(2-Me-BuOH)-OH)(2.80g，14.6mmol)，碳酸钠4.66g，44.0mmol)溶解于1，4-二噁烷(24.5mL)/水(58.8mL)中后，加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(5.18g，15.4mmol)，于室温搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚洗涤3次之后，在水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH2，用乙酸乙酯萃取3次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物aa61，Fmoc-Ser(2-Me-BuOH)-OH)(5.80g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁 基)-L-丝氨酸(化合物aa62，Fmoc-Ser(2-Me-BuOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物aa61，Fmoc-Ser(2-Me-BuOH)-OH)(6.80g，16.5mmol)的四氢呋喃(35.0mL)溶液中，加入对甲苯磺酸吡啶(0.20g，0.82mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(10.3mL)，在50度搅拌5小时。将混合物冷却至25度，加入乙酸乙酯。接着，利用饱和食盐水对有机层进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣(11.0g)中0.75g溶解于四氢呋喃(20.0mL)中，然后加入调节至pH 6.8的1.0M磷酸缓冲液(20.0mL)。将该混合物在50度搅拌4小时。冷却至25度之后，加入乙酸乙酯，将有机层与水层分离。在水层中加入乙酸乙酯进行萃取后，将得到的全部有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(0.5％碳酸氢铵水溶液/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa62，Fmoc-Ser(2-Me-BuOTHP)-OH)(0.60g，80％)。
LCMS(ESI)m/z＝498(M+H)+
保留时间：0.72分钟(分析条件SMD方法11)
(S)-4-((3-羟基-3-甲基丁氧)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯 (化合物aa63)的合成
将N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-3-甲基丁基)-L-丝氨酸(化合物aa61，Fmoc-Ser(2-Me-BuOH)-OH)(0.20g，0.48mmol)，多聚甲醛(0.06g)及三氟乙酸(0.64g，5.62mmol)溶解于甲苯中(10.0mL)中，于室温搅拌16小时。将反应液减压蒸馏而除去，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了(S)-4-((3-羟基-3-甲基丁氧)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物aa63)(0.16g，80％)。
LCMS(ESI)m/z＝448(M+Na)+
保留时间：2.47分钟(分析条件SMD方法14)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-3-甲基丁基)-N-甲基-L-丝氨酸(化 合物aa64，Fmoc-MeSer(2-Me-BuOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，在(S)-4-((3-羟基-3-甲基丁氧)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物aa63)(1.00g，2.35mmol)，氯化铝(0.63g，4.70mmol)的二氯甲烷溶液(50.0mL)中，在0度慢慢滴加三乙基硅烷(0.75mL)，于室温搅拌2小时。将反应液用二氯甲烷稀释，用2M盐酸水溶液及饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-3-甲基丁基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa64，Fmoc-MeSer(2-Me-BuOH)-OH)(0.30g，30％)。
LCMS(ESI)m/z＝450(M+Na)+
保留时间：2.12分钟(分析条件SMD方法15)
(S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-6-氧代己酸甲酯(化合物aa65)的合成
在氮气氛围中，于室温在市售的(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-6-羟基己酸(Boc-Nle(6-OH)-OH)(10g，40.4mmol)的甲苯/甲醇(90mL/60mL)溶液中滴加2M的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷/己烷溶液(24.26mL，48.5mmol)，搅拌过夜。将反应液使用旋转蒸发仪减压浓缩，向得到的残渣中加入甲苯/甲醇(90mL/60mL)溶液，使其溶解之后，于室温滴加2M的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷/己烷溶液(24.26mL，48.5mmol)，搅拌6小时。将反应液使用旋转蒸发仪减压浓缩，由此作为粗产物得到了(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-6-羟基己酸甲酯(Boc-Nle(6-OH)-OMe)(13g)。
向得到的粗产物(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-6-羟基己酸甲酯(Boc-Nle(6-OH)-OMe)(13g)中于室温加入4N盐酸/1.4-二噁烷溶液(50mL，200mmol)，搅拌6小时。将反应液使用旋转蒸发仪减压浓缩，由此作为粗产物得到了(S)-2-氨基-6-羟基己酸甲酯(H-Nle(6-OH)-OMe)的盐酸盐(9.2g)。
在得到的粗产物(S)-2-氨基-6-羟基己酸甲酯(H-Nle(6-OH)-OMe)的盐酸盐(9.2g)的乙腈溶液(100mL)中于室温加入1，3-二氧代异二氢吲哚-2-羧酸乙酯(9.74g，44.4mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(15.52mL，89mmol)，搅拌过夜。将反应液使用旋转蒸发仪减压浓缩，由此将得到的残渣通过正相柱层析(二氯甲烷/甲醇)纯化，得到了(S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-6-羟基己酸甲酯(14.6g)。
在上述(S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-6-羟基己酸甲酯(7.08g，24.3mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)中在0度加入Dess-Martin Periodinane(CAS#87413-09-0，11.34g，26.7mmol)，于室温搅拌3小时。将反应液用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液/水(1/1)的溶液，饱和硫代硫酸钠水溶液，饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，减压浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-6-氧代己酸甲酯(化合物aa65)(3.6g，4个工序51％)。
LCMS(ESI)m/z＝290(M+H)+
保留时间：0.70分钟(分析条件SQDAA05)
(2S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(化合物 aa66)的合成
在氮气氛围中，在(S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-6-氧代己酸甲酯(化合物aa65)(3.62g，12.51mmol)的四氢呋喃溶液(50mL)中在0度加入(三氟甲基)三甲基硅烷(1.390mL，9.39mmol)，1M的四丁基氟化铵(TBAF)/四氢呋喃(THF)溶液(0.626mL，0.626mmol)，在0度搅拌10分钟。在反应液中在0度加入(三氟甲基)三甲基硅烷(1.390mL，9.39mmol)，1M的四丁基氟化铵(TBAF)/四氢呋喃(THF)溶液(0.626mL，0.626mmol)，搅拌30分钟。进一步在反应液中在0度加入(三氟甲基)三甲基硅烷(1.390mL，9.39mmol)，1M的四丁基氟化铵(TBAF)/四氢呋喃(THF)溶液(0.626mL，0.626mmol)，搅拌2小时30分钟。在反应液中在0度加入1N盐酸水溶液(37.5mL)，于室温搅拌20分钟之后，用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，由此得到了(2S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(化合物aa66)(1.8g，40％)。
LCMS(ESI)m/z＝358(M-H)-
保留时间：0.81分钟(分析条件SQDAA05)
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(化 合物aa67，Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OMe)的合成
在通过上述方法得到的(2S)-2-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(化合物aa66)(3.1g，8.63mmol)的甲醇溶液(30mL)中于室温加入肼的一水合物(1.258mL，25.9mmol)，乙酸(1.482mL，25.9mmol)，搅拌过夜。为了除去甲醇，将反应液通过旋转蒸发仪减压浓缩，得到的溶液用二甲亚砜稀释之后，通过反相柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，由此得到了(2S)-2-氨基-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(H-Hnl(7-F3-6-OH)-OMe)(2g)。
在上述(2S)-2-氨基-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(H-Hnl(7-F3-6-OH)-OMe)(2g，8.73mmol)中于室温加入水(25mL)，碳酸钠2.93g，34.9mmol)，四氢呋喃(50mL)，N-琥珀酰亚胺9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc-OSu)(3.53g，10.47mmol)，将反应液搅拌2小时。为了除去四氢呋喃，将反应液利用旋转蒸发仪减压浓缩，加入乙酸乙酯、1N盐酸水溶液，利用乙酸乙酯萃取2次。用饱和食盐水洗涤有机层，利用无水硫酸镁干燥之后，过滤，减压浓缩。将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)，正相柱层析(二氯甲烷/甲醇)纯化之后，进一步，通过反相柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，收集得到的级分，减压蒸馏除去甲醇，用乙酸乙酯萃取2次，用饱和硫酸氢钾溶液，饱和食盐水洗涤。减压蒸馏除去得到的有机溶剂，由此得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(化合物aa67，Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OMe)(1.4g，2个工序36％)。
LCMS(ESI)m/z＝452(M+H)+
保留时间：0.86分钟(分析条件SQDFA05)
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸(化合物 aa68，Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OH)的合成
在氯化钙(5.16g，46.5mmol)的水溶液(7.00mL)中于室温加入氢氧化锂的一水合物(0.521g，12.40mmol)，搅拌5分钟。于室温滴加(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸甲酯(化合物aa67，Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OMe)(1.4g，3.10mmol)的异丙醇/四氢呋喃溶液(28mL/7mL)，将反应液搅拌过夜。在反应液中加入1N盐酸水溶液，用叔丁基甲基醚萃取2次，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后之后，过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-7，7，7-三氟-6-羟基庚酸(化合物aa68，Fmoc-Hnl(7-F3-6-OH)-OH)(950mg，70％)。
LCMS(ESI)m/z＝438.6(M+H)+
保留时间：0.76分钟(分析条件SQDFA05)
甲基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸酯 (化合物aa69，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在另外合成的2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(化合物aa73，Fmoc-Azy-OMe)(0.20g，0.62mmol)和3，3，3-三氟丙烷-1，2-二醇(0.24g，1.9mmol)的二氯甲烷溶液(3.0mL)中在0度加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(7.8μL，0.062mmol)，搅拌30分钟。另外，在氮气氛围中，在(2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(化合物aa73，Fmoc-Azy-OMe)(5.0g，15.46mmol)和3，3，3-三氟丙烷-1，2-二醇(6.03g，46.4mmol)的二氯甲烷溶液(77.0mL)中在0度加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(0.19mL，1.55mmol)，搅拌30分钟。进一步，在氮气氛围中，在2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(化合物aa73，Fmoc-Azy-OMe)(3.6g，11.13mmol)和3，3，3-三氟丙烷-1，2-二醇(4.34g，33.4mmol)的二氯甲烷溶液(55.7mL)中在0度加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(0.14mL，1.11mmol)，搅拌30分钟。
在上述3个反应液中分别加入饱和碳酸氢钠水溶液之后，将全部反应液合并，减压蒸馏除去大部分的有机溶剂，在残留的溶液中加入乙酸乙酯(300mL)萃取。将有机层利用饱和食盐水溶液洗涤后，减压蒸馏除去有机溶剂。将得到的残渣通过正相硅胶柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了甲基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa69，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OMe)(6.57g，53％，纯度95％)及相同的化合物(3.1g，25％，纯度87％)。
LCMS(ESI)m/z＝454(M+H)+
保留时间：1.18分钟(分析条件SMD方法45)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物 aa70，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OH)的合成
将氯化钙(2.06g，18.5mmol)溶解于水(5.2mL)中，加入氢氧化锂的一水合物(207mg，4.94mmol)，于室温搅拌10分钟。在该溶液中加入甲基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa69，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OMe)(560mg，1.24mmol)的四氢呋喃(THF)(5.15mL)，异丙醇(20.6mL)溶液，于室温搅拌2小时。加入1N盐酸水溶液使反应终止。进一步，分别使用0.15g，1.11g，0.48g，0.96g的Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OMe，同样实施了反应。收集全部反应液，减压蒸馏除去大部分的溶剂。向得到的溶液中加入乙酸乙酯和水，进行萃取。减压蒸馏除去有机层，之后将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa70，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OH)(3.10g，98％)。
LCMS(ESI)m/z＝462(M+Na)+
保留时间：2.24分钟(分析条件SMD方法46)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸 (化合物aa71，Fmoc-MeSer(1-CF3-EtOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa70，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OH)(1.84g，4.19mmol)的二氯甲烷溶液(20.9mL)中加入多聚甲醛(151mg，5.03mmol)，无水硫酸镁(1.26g，10.5mmol)，三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(526μL，4.19mmol)，于室温搅拌3小时。为了除去不溶物，将反应液过滤之后用二氯甲烷(10mL)洗涤。
在经过滤的反应液中加入三乙基硅烷(2.0mL，12.6mmol)，三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(1.58mL，12.6mmol)，于室温搅拌30分钟。反应液用饱和食盐水稀释，利用二氯甲烷进行萃取。将得到的有机层减压浓缩，之后将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa71，Fmoc-MeSer(1-CF3-EtOH)-OH)(640mg，34％)。
LCMS(ESI)m/z＝452(M-H)-
保留时间：2.33分钟(分析条件SMD方法47)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa72，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOTHP)-OH)的合成
在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa70，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOH)-OH)(2.52g，5.74mmol)的二氯甲烷溶液(19.12mL)中加入3，4-二氢-2H-吡喃(3.92mL，43.0mmol)，对甲苯磺酸吡啶(0.144g，0.574mmol)，在40度搅拌过夜。之后，向反应液中加入水，利用二氯甲烷萃取，用饱和食盐水洗涤有机层。将有机层利用无水硫酸钠进行干燥之后，过滤，通过减压浓缩而除去溶剂。将得到的残渣溶解于四氢呋喃(29mL)中，加入1M的磷酸水溶液(pH＝8，29mL)在50度搅拌3小时。将反应液用水稀释，利用乙酸乙酯萃取2次。将有机层合并而利用饱和食盐水洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥之后，过滤，通过减压浓缩而除去溶剂。将得到的残渣溶解于二氯甲烷(60mL)和庚烷(60mL)中之后，减压浓缩二氯甲烷，由此沉淀出油状粗产物。通过倾析除去庚烷溶液。将该操作重复两次。将得到的粗产物溶解于乙酸乙酯，利用0.05M磷酸水溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤1次。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3，3，3-三氟-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa72，Fmoc-Ser(1-CF3-EtOTHP)-OH)(2.89g，96％)。
LCMS(ESI)m/z＝522(M-H)-
保留时间：1.00分钟(分析条件SQDAA05-2)
2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(化合物aa73，Fmoc- Azy-OMe)的合成
在氮气氛围中，在市售的(S)-1-三苯甲基氮丙啶-2-羧酸甲酯(Trt-Azy-OMe)(50g，145.60mmol)的氯仿/甲醇溶液(145mL/145mL)中在0度滴加三氟乙酸(33mL)，将反应液搅拌7小时。在反应液中在0度滴加N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(127mL)，(9H-芴-9-基)甲基碳酰氯(Fmoc-Cl)(36g，139.16mmol)的1，4-二噁烷溶液(145mL)，反应液在0度搅拌1小时30分钟。减压蒸馏除去反应液的溶剂，利用乙酸乙酯稀释之后，利用水、饱和氯化铵水溶液洗涤2次，利用饱和食盐水洗涤2次。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(化合物aa73，Fmoc-Azy-OMe)(40g，2个工序85％)。
LCMS(ESI)m/z＝324(M+H)+
保留时间：0.86分钟(分析条件SQDFA05)
叔丁基N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-甲基-L-谷氨酸酯(化合物aa74， Fmoc-Gln(Me)-OtBu)的合成
在冰冷却下，在(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu-OtBu)(20.0g，47.0mmol)及1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)(8.8g)的二甲基甲酰胺(DMF)(300mL)溶液中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(WSC·HCl)(13.5g)，搅拌10分钟。将反应液的温度保持为5度以下并加入2mol/L的甲基胺的四氢呋喃溶液(29.5mL)，于室温搅拌16小时。将反应液用己烷/乙酸乙酯(1/1，1400mL)和氯化铵水溶液(500mL)稀释，将有机层分离。将有机层用碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥之后，减压蒸馏除去溶剂，以粗产物形式得到了叔丁基N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-甲基-L-谷氨酸酯(化合物aa74，Fmoc-Gln(Me)-OtBu)(36.2g)。
LCMS(ESI)m/z＝439(M+H)+
保留时间：1.05分钟(分析条件SMD方法23)
N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-甲基-L-谷氨酰胺(化合物aa75，Fmoc-Gln (Me)-OH)的合成
叔丁基N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-甲基-L-谷氨酸酯(化合物aa74，Fmoc-Gln(Me)-OtBu)(43.6g)的二氯甲烷(DCM)(300mL)溶液中，在冰冷却下滴加三氟乙酸(TFA)(300mL)，于室温搅拌16小时。减压蒸馏除去溶剂，向得到的残渣加入乙醚和碳酸氢钠水溶液，有机相发生分离。将得到的水层利用5mol/L的盐酸水溶液将pH调整至1～2之间，过滤收取沉淀的固体，得到了N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-甲基-L-谷氨酰胺(化合物aa98，Fmoc-Gln(Me)-OH)(26.7g)。
LCMS(ESI)m/z＝383(M+H)+
保留时间：1.75分钟(分析条件SMD方法5)
2-溴-N-叔丁基乙酰胺(化合物aa76)的合成
在氮气氛围中，在2-溴乙酸(50.0g，360mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(80.0mL)溶液中加入2-甲基丙烷-2-胺(26.7g，365mmol)，N-乙基-异丙基丙烷-2-胺(DIPEA)(139g，1.08mol)及丙基膦酸酐(T3P)(229g，720mmol)，于室温搅拌2小时。向反应液中加入水，利用乙酸乙酯萃取2次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣用己烷洗涤，以粗产物形式得到了2-溴-N-叔丁基乙酰胺(化合物aa76，36.5g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa77，Trt-Ser (NtBu-Aca)-OH)的合成
在氮气氛围中，在三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser-OH)的三乙胺盐(1.50g，4.32mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)(2.00mL)溶液中加入氢化钠(0.52g，13.0mmol，60％油分散)，于室温搅拌2小时。向其加入2-溴-N-叔丁基乙酰胺(化合物aa76)(0.96g)的DMF(1.00mL)溶液，于室温搅拌1小时。向反应液中加入水，利用乙酸乙酯萃取2次，将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa77，Trt-Ser(NtBu-Aca)-OH)(1.60g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸 (化合物aa78，Fmoc-Ser(NtBu-Aca)-OH)的合成
在氮气氛围中，在O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(化合物aa77，Trt-Ser(NtBu-Aca)-OH)(15.3g，33.2mmol)的二氯甲烷(150mL)/水(150mL)溶液中，在4度加入三氟乙酸(11.2g，99.1mmol)，在相同温度搅拌2小时。将水层分离，加入N-乙基-异丙基丙烷-2-胺(DIPEA)至达到PH7为止。向其加入1，4-二噁烷(150mL)后，加入N-乙基-异丙基丙烷-2-胺(DIPEA)(14.9g，115mmol)及N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(22.3g，231mmol)，于25度搅拌16小时。在反应液中加入水，用己烷洗涤2次之后，在水层中加入浓盐酸至达到pH2，用乙酸乙酯萃取2次。将得到的有机层混合，用饱和食盐水洗涤有机层之后，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸(化合物aa78，Fmoc-Ser(NtBu-Aca)-OH)(14.2g，98％)。
LCMS(ESI)m/z＝441(M+H)+
保留时间：1.08分钟(分析条件SMD方法9)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-N-甲基-L- 丝氨酸(化合物aa79，Fmoc-MeSer(NtBu-Aca)-OH)的合成
在氮气氛围中，将N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸(化合物aa78，Fmoc-Ser(NtBu-Aca)-OH)(1.0g，2.270mmol)，多聚甲醛(203mg，6.81mmol)，((1S，4R)-7，7-二甲基-2-氧代二环[2.2.1]庚烷-1-基)甲磺酸(26mg，0.114mmol)的甲苯溶液(1.2mL)在80度搅拌1小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙酯萃取3次，利用饱和食盐水进行洗涤。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥后之后，过滤，减压浓缩，由此得到了(S)-4-((2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(1.035g)以粗产物形式。
在氮气氛围中，在上述粗产物(S)-4-((2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(1.035g)的二氯甲烷(DCM)溶液(2.86mL)中加入三乙基硅烷(Et3SiH)(1.096mL，6.86mmol)和水(40μL)，于室温搅拌2分钟之后，加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(0.580mL，4.57mmol)，于室温搅拌24小时。向反应液中加入饱和氯化铵水溶液，于室温搅拌40分钟后，利用二氯甲烷(DCM)萃取2次。将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥，向通过减压浓缩得到的残渣加入乙腈，用己烷洗涤。通过减压蒸馏除去乙腈，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-N-甲基-L-丝氨酸(化合物aa79，Fmoc-MeSer(NtBu-Aca)-OH)(0.9449g，2个工序92％)。
LCMS(ESI)m/z＝455(M+H)+
保留时间：0.79分钟(分析条件SQDFA05)
2-溴-N-甲基乙酰胺(化合物aa80)的合成
在氮气氛围中，在碳酸钾(11.61g，84mmol)中加入二氯甲烷(100mL)之后，于室温加入甲基胺盐酸盐(2.84g，42.0mmol)。在反应液中在0度滴加2-溴乙酰溴(3.47mL，40mmol)，于室温搅拌1小时。在反应液中加入水(20mL)，用二氯甲烷萃取后，在减压下浓缩，用油泵干燥，以粗产物形式得到了2-溴-N-甲基乙酰胺(化合物aa80)(5.2g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸(化 合物aa81，Fmoc-Ser(NMe-Aca)-OH)的合成
在氮气氛围中，在三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser-OH)的三乙胺盐(1.80g)的四氢呋喃(THF)(2.00mL)溶液中在0度加入1.9M双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠(NaHMDS)的THF溶液(4.86mL，9.23mmol)，搅拌15分钟。在反应液中在0度加入2-溴-N-甲基乙酰胺(化合物aa80)(1.22g)的THF(2.00mL)溶液，于室温搅拌15分钟。反应液中加入乙酸乙酯(300mL)，水(60mL)，1N盐酸水溶液(4.8mL)的混合液，将得到的有机层减压蒸馏除去，得到了粗产物。另外，在氮气氛围中，在三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser-OH)的三乙胺盐(1.80g)的四氢呋喃(THF)(2.00mL)溶液中在0度加入1.9M双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠(NaHMDS)的THF溶液(4.65mL，8.83mmol)，搅拌15分钟。在反应液中在0度加入2-溴-N-甲基乙酰胺(化合物aa80)(1.22g)的THF(2.00mL)溶液，于室温搅拌15分钟。将反应液中加入乙酸乙酯(300mL)，水(60mL)，1N盐酸水溶液(4.8mL)的混合液，将得到的有机层减压蒸馏除去，得到了粗产物。将上述2个粗产物合并，通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了O-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser(NMe-Aca)-OH)(2.5g)。
在得到的O-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser(NMe-Aca)-OH)(2.4g，5.73mmol)的二氯甲烷(DCM)溶液(2.87mL)中在0度加入三氟乙酸(TFA)(1.325mL，17.20mmol)，搅拌30分钟。在反应液中加入水(2.87mL)，将得到的水层通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此以粗产物形式得到了O-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸(H-Ser(NtBu-Aca)-OH)(900mg)。不对其进行纯化而用于下个工序。
在得到的粗产物O-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸(H-Ser(NtBu-Aca)-OH)(900mg)中于室温加入水(4.2mL)，N-乙基-N-异丙基丙烷-2-胺(DIPEA)(2.231mL，12.77mmol)的1，4-二噁烷溶液(14.0mL)之后，于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(1.723g，5.11mmol)，搅拌30分钟。在反应液加入乙酸乙酯(150mL)，水(30mL)，1N盐酸水溶液(3.0mL)的混合液中，将得到的有机层减压蒸馏除去。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)-L-丝氨酸(化合物aa81，Fmoc-Ser(NMe-Aca)-OH)(1.8g)。
LCMS(ESI)m/z＝399(M+H)+
保留时间：0.63分钟(分析条件SQDFA05)
甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa82，Cbz-Ser (nPrOH)-OMe)的合成
在氮气氛围中，将市售的2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(500mg，2.125mmol)及丙烷-1，3-二醇(810mg，10.645mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，冷却至0度后，加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·Et2O)(46mg，0.324mmol)，在0度搅拌4小时。在反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa82，Cbz-Ser(nPrOH)-OMe)(390mg，59％)。
LCMS(ESI)m/z＝334(M+Na)+
保留时间：1.09分钟(分析条件SMD方法13)
N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa83，Cbz-Ser(nPrOH)-OH) 的合成
在氮气氛围中，在氢氧化锂(3.14g，131.049mmol)，氯化钙(54.54g，491.434mmol)中于室温加入水(134mL)，2-丙醇(538mL)，搅拌之后，于室温加入甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa82，Cbz-Ser(nPrOH)-OMe)(10.2g，32.762mmol)的四氢呋喃溶液(134mL)，搅拌5小时。在反应液中加入6N盐酸水溶液至达到pH3，减压下除去有机溶剂之后，用乙酸乙酯萃取水层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa83，Cbz-Ser(nPrOH)-OH)(10.6g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa84，Fmoc- Ser(nPrOH)-OH)的合成
在氢气氛围中(～3atm)，将如上所述得到的粗产物N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa83，Cbz-Ser(nPrOH)-OH)(13g)，10％钯碳(4.65g)，甲醇(130mL)的混合物于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣用乙酸乙酯重结晶，由此得到了O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(H-Ser(nPrOH)-OH)(5.5g，2个工序78％)。
在氮气氛围中，在O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(H-Ser(nPrOH)-OH)(5.5g，33.707mmol)，碳酸氢钠(8.6g，102mmol)的水/1，4-二噁烷(50mL/130mL)溶液中于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(11.94g，35.396mmol)，搅拌4小时。在反应液中加入水，用叔丁基甲基醚洗涤2次之后，加入6N盐酸水溶液至达到水层的pH为3，用叔丁基甲基醚萃取。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa84，Fmoc-Ser(nPrOH)-OH)(8g，67％)。
LCMS(ESI)m/z＝386(M+H)+
保留时间：0.61分钟(分析条件SMD方法50)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝 氨酸(化合物aa85，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟丙基)-L-丝氨酸(化合物aa84，Fmoc-Ser(nPrOH)-OH)(1g，2.595mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(1.5g，17.83mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液中，加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(32.6mg，0.130mmol)，在50度搅拌4小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤之后，将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此以混合物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa85，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OTHP)(1.5g)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa85，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OTHP)的混合物(1.5g)中加入四氢呋喃(8mL)，1M磷酸缓冲液(8mL，pH8.0)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣利用二乙醚/庚烷重结晶，由此以钠盐(1g)形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa85，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa85，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH)的钠盐(5g)中加入叔丁基甲基醚(100mL)，0.05M磷酸水溶液(250mL)，于室温搅拌5分钟。将反应液用叔丁基甲基醚萃取2次之后，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此作为粗产物得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa85，Fmoc-Ser(nPrOTHP)-OH)(4.9g)。不对其进行进一步纯化而用于肽合成。
LCMS(ESI)m/z＝468(M-H)-
保留时间：0.84分钟(分析条件SQDFA05)
甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa86， Cbz-Ser(2-Me2-PrOH)-OMe)的合成
在氮气氛围中，将市售的2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(30g，127.53mmol)及2，2-二甲基丙烷-1，3-二醇(26.56g，255.06mmol)溶解于二氯甲烷(400mL)中，冷却至0度之后，滴加三氟化硼二乙醚络合物(BF3·Et2O)(2.72g，19.129mmol)-搅拌1小时。将反应液用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤之后，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa86，Cbz-Ser(2-Me2-PrOH)-OMe)(26.7g，62％)。
LCMS(ESI)m/z＝326(M+H)+
保留时间：1.12分钟(分析条件SMD方法13)
N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa87，Cbz- Ser(2-Me2-PrOH)-OH)的合成
在氮气氛围中，在氢氧化锂的一水合物(13.16g，313.505mmol)，氯化钙(130.48g，1175.646mmol)中于室温加入水(260mL)，2-丙醇(1050mL)，搅拌之后，于室温加入甲基N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸酯(化合物aa86，Cbz-Ser(2-Me2-PrOH)-OMe)(26.6g，78.376mmol)的四氢呋喃溶液(260mL)，搅拌2小时。在反应液中加入6N盐酸水溶液至达到pH3，减压下除去有机溶剂之后，用乙酸乙酯萃取水层。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤，进行减压蒸馏除去得到的溶剂，由此以粗产物形式得到了N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa87，Cbz-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)(25.0g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(化合 物aa88，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)的合成
在氢气氛围中(～3atm)，将如上所述得到的粗产物N-((苄氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa87，Cbz-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)(25.0g)，10％钯碳(5g，20％w/w)，甲醇(250mL)的混合物于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体用乙酸乙酯洗涤3次，由此得到了O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(H-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)(13.1g，2个工序87％)。
在氮气氛围中，将O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(H-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)(13g，67.982mmol)，碳酸氢钠(17.13g，203.946mmol)的水/1，4-二噁烷(260mL/104mL)溶液中于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(24.08g，71.381mmol)，搅拌2小时。在反应液中加入水，用叔丁基甲基醚洗涤2次之后，在水层中加入6N盐酸水溶液至达到pH3，用叔丁基甲基醚萃取。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa88，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)(26.5g，94％)。
LCMS(ESI)m/z＝414(M+H)+
保留时间：1.44分钟(分析条件SMD方法51)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa89，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)-L-丝氨酸(化合物aa88，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOH)-OH)(20g，48.371mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(28.48g，338.598mmol)的四氢呋喃(161mL)溶液中，加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(607.79mg，2.419mmol)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤之后，将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此以混合物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa89，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OTHP)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa89，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OTHP)的混合物中，加入四氢呋喃(161mL)，1M磷酸缓冲液(161mL，pH 8.0)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣利用二乙醚/庚烷重结晶，由此以钠盐(17.1g)形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa89，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa89，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH)的钠盐(8g)中加入叔丁基甲基醚(120mL)，0.05M磷酸水溶液(350mL)，于室温搅拌5分钟。将反应液用叔丁基甲基醚萃取，用饱和食盐水洗涤2次之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此作为粗产物得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2，2-二甲基-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-L-丝氨酸(化合物aa89，Fmoc-Ser(2-Me2-PrOTHP)-OH)(7g)。不对其进行进一步纯化而用于肽合成。
LCMS(ESI)m/z＝496(M-H)-
保留时间：0.97分钟(分析条件SQDFA05)
(4S)-4-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa90)的合成
在氮气氛围中，在(S)-丁烷-1，3-二醇(25g，277.407mmol，CAS#24621-61-2)和(二甲氧基甲基)苯(63.37g，416.688mmol)的氯仿(CHCl3)溶液(210mL)中在0度加入对甲苯磺酸(TsOH)(2.64g，13.880mmol)，于室温搅拌16小时。在反应液中加入二氯甲烷，碳酸钠水溶液，用水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣溶解于乙醇(EtOH)(135mL)中，加入硼氢化钠(NaBH4)(5.25g，138.778mmol)，于室温搅拌30分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(210mL)，于室温搅拌2小时之后，加入乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后之后，进行过滤，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(4S)-4-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa90)(42.7g，86％)。
LCMS(ESI)m/z＝179(M+H)+
保留时间：1.26分钟(分析条件SMD方法13)
(S)-3-(苄氧基)丁烷-1-醇(化合物aa91)的合成
在氮气氛围中，如上所述进行得到的(4S)-4-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa90)(35g，196.629mmol)的二氯甲烷溶液(960mL)中，在-50度滴加了1M氢化二异丁基铝(DIBAL)的己烷溶液(390mL，390mmol)。将反应液在-50度搅拌30分钟之后，于室温进一步搅拌2小时。在反应液中在-30度加入甲醇(MeOH)，使反应停止之后，加入水。加入6N盐酸水溶液至反应液达到pH＝2之后，用二氯甲烷萃取，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-3-(苄氧基)丁烷-1-醇(化合物aa91)(21.6g，61％)。
LCMS(ESI)m/z＝181(M+H)+
保留时间：1.16分钟(分析条件SMD方法13)
甲基O-((S)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa92， Cbz-Ser(S-2-BuOBn)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(18.8g，80.0mmol)及如上所述进行得到的(S)-3-(苄氧基)丁烷-1-醇(化合物aa91)(21.6g，120mmol)溶解于二氯甲烷(190mL)中，在0度加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·Et2O)(1.51mL，11.976mmol)于室温搅拌2小时。在反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了甲基O-((S)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa92，Cbz-Ser(S-2-BuOBn)-OMe)(15g，30％)。
LCMS(ESI)m/z＝416(M+H)+
保留时间：1.39分钟(分析条件SMD方法13)
O-((S)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa93，Cbz-Ser (S-2-BuOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，于室温加入氢氧化锂的一水合物(6.1g，145.238mmol)，氯化钙(60.2g，542.342mmol)中加入水(155mL)，2-丙醇(615mL)，搅拌之后，于室温加入如上所述进行得到的甲基O-((S)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa92，Cbz-Ser(S-2-BuOBn)-OMe)(15g，36.144mmol)的四氢呋喃溶液(155mL)。将反应液于室温搅拌5小时之后，加入6N盐酸水溶液至达到反应液的pH为3。减压下除去有机溶剂之后，将水层用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-((S)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa93，Cbz-Ser(S-2-BuOBn)-OH)(16.5g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(化合物aa94， Fmoc-Ser(S-2-BuOH)-OH)的合成
在氢气氛围中(～3atm)，将如上所述得到的粗产物O-((S)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa93，Cbz-Ser(S-2-BuOBn)-OH)(16.5g)，10％钯碳(8.25g，50％w/w)，甲醇(280mL)的混合物于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体用乙酸乙酯洗涤3次，由此得到了O-((S)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(H-Ser(S-2-BuOH)-OH)(5.85g)。
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的O-((S)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(H-Ser(S-2-BuOH)-OH)(5.85g，33.03mmol)，碳酸氢钠(8.30g，98.81mmol)的水/1，4-二噁烷(135mL/55mL)溶液中于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(11.7g，34.6815mmol)，搅拌2小时。在反应液中加入水，用叔丁基甲基醚洗涤2次之后，加入6N盐酸水溶液至达到水层的pH为3，用叔丁基甲基醚萃取。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(化合物aa94，Fmoc-Ser(S-2-BuOH)-OH)(8.1g，61％)。
LCMS(ESI)m/z＝400(M+H)+
保留时间：1.21分钟(分析条件SMD方法13)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁 基)-L-丝氨酸(化合物aa95，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((S)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(化合物aa94，Fmoc-Ser(S-2-BuOH)-OH)(8.10g，20.292mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(11.94g，141.94mmol)的四氢呋喃(90mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(255mg，1.014mmol)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤之后，将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此以混合物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa95，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OTHP)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa95，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OTHP)的混合物中加入四氢呋喃(90mL)，1M磷酸缓冲液(90mL，pH 8.0)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣利用二乙醚/庚烷重结晶，由此以钠盐(7.4g)形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa95，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH)。
如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa95，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH)的钠盐(7.4g)中加入叔丁基甲基醚(130mL)，0.05M磷酸水溶液(360mL)，于室温搅拌5分钟。将反应液用叔丁基甲基醚萃取，用饱和食盐水洗涤2次之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此作为粗产物得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3S)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa95，Fmoc-Ser(S-2-BuOTHP)-OH)(6.9g)。不对其进行进一步纯化而用于肽合成。
LCMS(ESI)m/z＝482(M-H)-
保留时间：0.87分钟，0.88分钟(分析条件SQDFA05)
(4R)-4-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa96)的合成
在氮气氛围中，将(R)-丁烷-1，3-二醇(20g，221.921mmol，CAS#6290-03-5)和(二甲氧基甲基)苯(50.66g，332.867mmol)的氯仿(CHCl3)溶液(200mL)中在0度加入对甲苯磺酸(TsOH)(1.91g，11.096mmol)，于室温搅拌16小时。在反应液中加入二氯甲烷，碳酸钠水溶液，用水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣溶解于乙醇(EtOH)(13mL)中，加入硼氢化钠(NaBH4)(4.20g，110.961mmol)，于室温搅拌30分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(13mL)，于室温搅拌2小时之后，加入乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后之后，进行过滤，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(4R)-4-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa96)(25g，63％)。
LCMS(ESI)m/z＝179(M+H)+
保留时间：1.29分钟(分析条件SMD方法13)
(R)-3-(苄氧基)丁烷-1-醇(化合物aa97)的合成
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的(4R)-4-甲基-2-苯基-1，3-二噁烷(化合物aa96)(20g，112.36mmol)的二氯甲烷溶液(561mL)中在-50度滴加了1M氢化二异丁基铝(DIBAL)的己烷溶液(225mL，225mmol)。将反应液在-50度搅拌30分钟之后，于室温进一步搅拌2小时。在反应液中在-30度加入甲醇(MeOH)，使反应停止之后，加入水。加入6N盐酸水溶液至反应液达到pH＝2之后，用二氯甲烷萃取，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(R)-3-(苄氧基)丁烷-1-醇(化合物aa97)(16.6g，82％)。
LCMS(ESI)m/z＝181(M+H)+
保留时间：1.11分钟(分析条件SMD方法13)
甲基O-((R)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa98， Cbz-Ser(R-2-BuOBn)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在2-甲基1-苄基(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(Cbz-Azy-OMe)(14.4g，61.481mmol)及如上所述进行得到的(R)-3-(苄氧基)丁烷-1-醇(化合物aa97)(16.6g，92.2mmol)溶解于二氯甲烷(145mL)中，在0度滴加三氟化硼二乙醚络合物(BF3·Et2O)(1.31g，9.222mmol)，于室温搅拌2小时。在反应液中加入二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了甲基O-((R)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa98，Cbz-Ser(R-2-BuOBn)-OMe)(13.4g，52％)。
LCMS(ESI)m/z＝416(M+H)+
保留时间：1.42分钟(分析条件SMD方法13)
O-((R)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa99，Cbz-Ser (R-2-BuOBn)-OH)的合成
在氮气氛围中，在氢氧化锂的一水合物(5.41g，128.92mmol)，氯化钙(53.69g，483.771mmol)中于室温加入水(134mL)，2-丙醇(538mL)，搅拌之后，于室温加入了如上所述进行得到的甲基O-((R)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸酯(化合物aa98，Cbz-Ser(R-2-BuOBn)-OMe)(13.4g，32.251mmol)的四氢呋喃溶液(134mL)。将反应液于室温搅拌5小时之后，加入6N盐酸水溶液至反应液达到pH为3。减压下除去有机溶剂之后，将水层用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵进行减压下干燥，以粗产物形式得到了O-((R)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa99，Cbz-Ser(R-2-BuOBn)-OH)(13.6g)。不对其进行纯化而用于下个工序。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(化合物aa100， Fmoc-Ser(R-2-BuOH)-OH)的合成
在氢气氛围中(～3atm)，将如上所述得到的粗产物O-((R)-3-(苄氧基)丁基)-N-((苄氧基)羰基)-L-丝氨酸(化合物aa99，Cbz-Ser(R-2-BuOBn)-OH)(13.6g)，10％钯碳(5.44g)，甲醇(270mL)的混合物于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，将得到的固体用乙酸乙酯洗涤3次，由此得到了O-((R)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(H-Ser(R-2-BuOH)-OH)(5.3g，2个工序93％)。
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的O-((R)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(H-Ser(R-2-BuOH)-OH)(5.3g，29.91mmol)，碳酸氢钠(7.54g，89.73mmol)的水/1，4-二噁烷(134mL/57mL)溶液中于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(10.58g，31.405mmol)，搅拌2小时。在反应液中加入水，用叔丁基甲基醚洗涤2次之后，加入6N盐酸水溶液至达到水层的pH为3，用叔丁基甲基醚萃取。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂，进一步利用减压泵在减压下进行干燥。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(化合物aa100，Fmoc-Ser(R-2-BuOH)-OH)(7.4g，62％)。
LCMS(ESI)m/z＝400(M+H)+
保留时间：1.20分钟(分析条件SMD方法13)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁 基)-L-丝氨酸(化合物aa101，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((R)-3-羟丁酯)-L-丝氨酸(化合物aa100，Fmoc-Ser(R-2-BuOH)-OH)(8.90g，22.281mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(13.12g，155.971mmol)的四氢呋喃(74mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(280mg，1.114mmol)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤之后，将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此以混合物形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa101，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OTHP)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa101，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH)和四氢-2H-吡喃-2-基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸酯(Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OTHP)的混合物中加入四氢呋喃(74mL)，1M磷酸缓冲液(74mL，pH 8.0)，在50度搅拌3小时。将反应液冷却，加入叔丁基甲基醚，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，进行减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣利用二乙醚/庚烷重结晶，由此以钠盐(10.2g)形式得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa101，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH)。
在如上所述进行得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa101，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH)的钠盐(10g)中加入叔丁基甲基醚(160mL)，0.05M磷酸水溶液(440mL)，于室温搅拌5分钟。将反应液用叔丁基甲基醚萃取，用饱和食盐水洗涤2次之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。进行减压蒸馏除去溶剂，由此作为粗产物得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((3R)-3-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丁基)-L-丝氨酸(化合物aa101，Fmoc-Ser(R-2-BuOTHP)-OH)(8.8g)。不对其进行进一步纯化而用于肽合成。
LCMS(ESI)m/z＝482(M-H)-
保留时间：0.86分钟，0.88分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸(化 合物aa102，Fmoc-Tyr(3-OMe)-OH)的合成
在市售的(S)-2-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸(H-Tyr(3-OMe)-OH)(2.5g，11.48mmol)中于室温加入水(49.9mL)，碳酸钠3.65g，34.4mmol)，1，4-二噁烷(14.9mL)。在反应液中在0度滴加N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(3.10g，9.18mmol)的1，4-二噁烷溶液(50mL)，在0度搅拌20分钟之后，在反应液中进一步加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(388mg，1.15mmol)搅拌20分钟。在反应液中在0度再次加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(388mg，1.15mmol)，搅拌40分钟。在反应液中加入水，叔丁基甲基醚(TBME)，将得到的水层使用1N盐酸水溶液变为酸性之后，用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层汇总并用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，进行过滤之后，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸(化合物aa102，Fmoc-Tyr(3-OMe)-OH)(3.53g，93％)。
LCMS(ESI)m/z＝434(M+H)+
保留时间：0.73分钟(分析条件SQD2FA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸甲 酯(化合物aa103，Fmoc-Tyr(3-OMe)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸(化合物aa102，Fmoc-Tyr(3-OMe)-OH)(2.29g，5.23mmol)中于室温加入甲醇(20.75mL)和乙腈(5.40mL)，在0度搅拌10分钟之后，在0度滴加了2.0M三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMS重氮甲烷)的己烷溶液(2.62mL，5.23mmol)。在反应液中再次在0度滴加2.0M三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMS重氮甲烷)的己烷溶液(2.62mL，5.23mmol)之后，在0度进一步滴加2.0M三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMS重氮甲烷)的己烷溶液(3.93mL，7.85mmol)。通过加入乙酸(2.0mL)使反应停止之后，加入50％饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯，用乙酸乙酯洗涤。将有机层用50％饱和碳酸氢钠水溶液萃取，将得到的水层汇总并用乙酸乙酯洗涤3次。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥后之后，进行过滤，减压蒸馏除去溶剂。作为粗产物得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸甲酯(化合物aa103，Fmoc-Tyr(3-OMe)-OMe)(2.39g)不进行进一步纯化而用于下个工序。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-((2-氯苯基)二苯基甲氧基)- 3-甲氧基苯基)丙酸(化合物aa104，Fmoc-Phe(4-OClt-3-OMe)-OH)的合成
在氮气氛围中，在粗产物(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸甲酯(化合物aa103，Fmoc-Tyr(3-OMe)-OMe)(2.39g)中加入乙腈(10.58mL)，2-氯三苯甲基氯(1.656g，5.29mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(0.906mL，5.29mmol)，于室温搅拌1小时。在反应液中加入水，加入叔丁基甲基醚，将有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-((2-氯苯基)二苯基甲氧基)-3-甲氧基苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(4-OClt-3-OMe)-OMe)(2.6g，68％)。
在氯化钙(5.98g，53.8mmol)中加入水(14.96mL)，加入氢氧化锂的一水合物(0.603g，14.36mmol)，于室温搅拌5分钟。在反应液中加入异丙醇(59.8mL)和(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-((2-氯苯基)二苯基甲氧基)-3-甲氧基苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(4-OClt-3-OMe)-OMe)(2.6g，3.59mmol)的四氢呋喃(THF)溶液(14.96mL)，搅拌4小时之后，加入0.05M磷酸水溶液和叔丁基甲基醚。将水层用叔丁基甲基醚萃取3次，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，减压蒸馏除去溶剂。作为粗产物得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-((2-氯苯基)二苯基甲氧基)-3-甲氧基苯基)丙酸(化合物aa104，Fmoc-Phe(4-OClt-3-OMe)-OH)(2.8g)不进行进一步纯化而用于下个工序。
LCMS(ESI)m/z＝708(M-H)-
保留时间：0.74分钟(分析条件SQD2AA50)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲 基)-L-丝氨酸(化合物aa109，Fmoc-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)的合成
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa109，Fmoc-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)依照下述方案合成。
在氮气氛围中，在市售的(叔丁氧羰基)-L-丝氨酸(Boc-Ser-OH)(50g，243.65mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(1000mL)中在0度加入氢化钠(34g，1420mmol，60％油分散)，搅拌1小时。在反应液中在0度滴加2-溴乙腈(37.2mL，536.03mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(50mL)，进一步搅拌1小时。在反应液中加入水之后，用乙酸乙酯萃取3次，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了N-(叔丁氧羰基)-O-(氰基甲基)-L-丝氨酸(化合物aa105，Boc-Ser(CH2CN)-OH)(29g，49％)。
在如上所述得到的N-(叔丁氧羰基)-O-(氰基甲基)-L-丝氨酸(化合物aa105，Boc-Ser(CH2CN)-OH)(38.5g，157.63mmol)的乙醇(EtOH)溶液(400mL)中，于室温加入盐酸羟胺(22.4g，315.26mmol)及三乙胺(58.8mL，425.60mmol)，在85度搅拌2小时。减压蒸馏除去溶剂，得到了粗产物N-(叔丁氧羰基)-O-(2-(羟基氨基)-2-亚氨基乙基)-L-丝氨酸(化合物aa106)(107g)。
在氮气氛围中，在得到的粗产物N-(叔丁氧羰基)-O-(2-(羟基氨基)-2-亚氨基乙基)-L-丝氨酸(化合物aa106)(12g)的1，4-二噁烷溶液(120mL)中于室温加入羰基二咪唑(CDI)(3.96g，24.42mmol)，1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)(4.92g，32.32mmol)，11在0度搅拌2小时。使用浓盐酸将反应液调节为pH＝2之后，用二氯甲烷(DCM)萃取2次。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩，由此作为粗产物得到了N-(叔丁氧羰基)-O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa107，Boc-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)(1.2g)。
在氮气氛围中，在得到的粗产物N-(叔丁氧羰基)-O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa107，Boc-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)(258mg)的1，4-二噁烷溶液(10mL)中于室温加入4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(15mL)，搅拌16小时。减压蒸馏除去溶剂，得到了粗产物O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa108，H-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)(160mg)。
在氮气氛围中，在如上得到的粗产物O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa108，H-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)(22.4g)和碳酸钾(18.8g，135.04mmol)的1.4-二噁烷/水(165mL/110mL)溶液中于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(23g，68.2mmol)，搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚/己烷(1/3)洗涤，将得到的水层使用浓盐酸调节至达到pH＝2之后，用二氯甲烷(DCM)萃取2次。将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥，进行了过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-((5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa109，Fmoc-Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)-OH)(5.69g)。
LCMS(ESI)m/z＝426(M+H)+
保留时间：0.72分钟(分析条件SQD2FA05)
((2S)-4-重氮-3-氧代-1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)丁烷-2-基)甲 基氨酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物aa110)的合成
在氮气氛围中，在N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-L-丝氨酸(化合物aa22，Fmoc-Ser(EtOTHP)-OH)(1.4g，3.07mmol)的四氢呋喃溶液(5.0mL)中在使用冰和食盐制备的冰浴冷却下加入4-甲基吗啉(0.355mL，3.23mmol)，氯甲酸乙酯(0.310mL，3.23mmol)，搅拌1小时10分钟。接下来，在使用冰和食盐制备的冰浴冷却下在反应液中滴加另外配制的重氮甲烷的二乙醚溶液，搅拌30分钟。在反应液中加入乙酸(0.88mL，15.37mmol)，搅拌10分钟之后，加入乙酸乙酯，水，用乙酸乙酯提取，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液通过减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了((2S)-4-重氮-3-氧代-1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)丁烷-2-基)甲基氨酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物aa110)(1.13g，77％)。
LCMS(ESI)m/z＝502(M+Na)+
保留时间：0.87分钟(分析条件SQDFA05)
重氮甲烷的二乙醚溶液的制备
在约包含50％的水的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(5.0g，购自东京化成或富士膜和光纯药)中加入二乙醚(17.0mL)，在0度滴加50％氢氧化钾水溶液(9.5mL)。将反应液搅拌1小时之后，使用平滑尖端的巴斯德吸管分离黄色的二乙醚层，将得到的溶液直接用在上述的反应中。
(3R)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)乙氧基)丁酸(化合物aa111，Fmoc-bAla(3R-MeOEtOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的((2S)-4-重氮-3-氧代-1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)丁烷-2-基)甲基氨酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物aa110)(1.7g，3.55mmol)的四氢呋喃/水(18mL/1.8mL)溶液中在0度加入4-甲基吗啉(0.974mL，8.86mmol)，三氟乙酸银(AgOCF3)(0.078mL，0.355mmol)之后，于室温搅拌2小时30分钟。在反应液中加入二甲亚砜(DMSO)，通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(3R)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)丁酸(化合物aa111，Fmoc-bAla(3R-MeOEtOTHP)-OH)(1.4g，84％)。
LCMS(ESI)m/z＝468(M-H)-
保留时间：0.78分钟(分析条件SQDFA05)
(2S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)甲基)丙酸(化合物aa117)根据以下方案合成。
(2S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)乙氧基)甲基)丙酸(化合物aa117，Fmoc-bAla(2S-MeOEtOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在用论文所述的方法(Beilstein Journal of OrganicChemistry，2017，13，2428-2441.)合成的2-(三苯甲基氧基)乙烷-1-醇(CAS.No.18325-45-6)(8.8g，28.9mmol)和市售的4-甲基苯磺酸(R)-环氧乙烷-2-基甲酯(6.0g，26.3mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(100mL)中在0度加入氢化钠(1.16g，28.9mmol，60％油分散)，于室温搅拌12小时。在反应液中加入水之后，用乙酸乙酯萃取2次，将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，由此得到了(R)-2-((2-(三苯甲基氧基)乙氧基)甲基)环氧乙烷(化合物aa112)(7.32g，77％)。
LCMS(ESI)m/z＝383(M+Na)+
保留时间：1.40分钟(分析条件SMD方法45)
如上所述得到的(R)-2-((2-(三苯甲基氧基)乙氧基)甲基)环氧乙烷(化合物aa112)(38.5g，157.63mmol)中于室温加入7M的氨的甲醇溶液(196mL)，于室温搅拌15小时。将反应液通过减压蒸馏除去溶剂，向得到的残渣中加入水，用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化。收集进一步得到的级分，在该溶液中加入饱和碳酸氢钠溶液(21.4mL)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)(5.55g)，于室温搅拌10分钟。将反应液通过减压蒸馏除去溶剂，向得到的残渣中加入水，用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯＝4/1)纯化，由此得到了(R)-(2-羟基-3-(2-(三苯甲基氧基)乙氧基)丙基)甲基氨酸叔丁酯(化合物aa113)(4.25g，70％)。
LCMS(ESI)m/z＝500(M+Na)+
保留时间：1.40分钟(分析条件SMD方法45)
在氮气氛围中，在得到的(R)-(2-羟基-3-(2-(三苯甲基氧基)乙氧基)丙基)甲基氨酸叔丁酯(化合物aa113)(4.53g，9.48mmol)的二氯甲烷溶液(47.4mL)中于室温加入三乙胺(3.97mL，28.5mmol)和甲磺酸酐(2.48g，14.2mmol)，于室温搅拌1小时。将反应液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(R)-12，12-二甲基-10-氧代-1，1，1-三苯基-2，5，11-三氧杂-9-氮杂三癸烷-7-基甲磺酸酯(化合物aa114)(4.62g，88％)。
LCMS(ESI)m/z＝578(M+Na)+
保留时间：1.47分钟(分析条件SMD方法45)
在氮气氛围中，在得到的(R)-12，12-二甲基-10-氧代-1，1，1-三苯基-2，5，11-三氧杂-9-氮杂三癸烷-7-基甲磺酸酯(化合物aa114)(4.41g，7.93mmol)的二甲亚砜(DMSO)溶液(39.6mL)中于室温加入氰化钠(1.95g，39.7mmol)，在80度搅拌10小时。在反应液中加入乙腈和水，通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(R)-(2-氰基-3-(2-(三苯甲基氧基)乙氧基)丙基)甲基氨酸叔丁酯(化合物aa115)(2.16g，53％)。
LCMS(ESI)m/z＝509(M+Na)+
保留时间：1.49分钟(分析条件SMD方法45)
在氮气氛围中，在得到的(R)-(2-氰基-3-(2-(三苯甲基氧基)乙氧基)丙基)甲基氨酸叔丁酯(化合物aa115)(3.63g，7.46mmol)的氯苯溶液(9.3mL)中在0度加入三氟甲磺酸(3.5mL，39.5mmol)，于室温搅拌1小时。接着于室温在反应液中加入水(3.6mL，201mmol)，在110度搅拌3小时。在反应液中加入水(20mL)和己烷(7mL)和甲苯(20mL)，除去水层。向得到的有机层中加入水(12mL)，洗涤。收集得到的水层，加入乙腈(37.3mL)和碳酸氢钠(6.27g，74.6mmol)，于室温加入(1-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(3.77g，11.2mmol)，搅拌30分钟。进一步于室温加入Fmoc-OSu(1.26g，3.73mmol)，搅拌过夜。将反应液过滤之后，用叔丁基甲基醚萃取。向得到的水层中加入6N浓盐酸至达到pH＝1之后，通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((2-羟基乙氧基)甲基)丙酸(化合物aa116)(1.31g，46％)。
LCMS(ESI)m/z＝386(M+H)+
保留时间：1.78分钟(分析条件SMD方法47)
在氮气氛围中，在上述得到的(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((2-羟基乙氧基)甲基)丙酸(化合物aa116)(1.03g，2.67mmol)和3，4-二氢-2H-吡喃(0.73mL，8.02mmol)的二氯甲烷溶液(13.4mL)溶液中于室温加入对甲苯磺酸吡啶(PPTS)(67mg，0.27mmol)，在40度搅拌10小时。向反应液添加水，利用二氯甲烷进行萃取。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。在得到的粗产物的四氢呋喃溶液(13.4mL)中加入另外制备的磷酸缓冲液(pH＝8，13.4mL)，在50度搅拌20小时。在反应液中加入水(50mL)，用叔丁基甲基醚/己烷(40mL/10mL)萃取。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(2S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)甲基)丙酸(化合物aa117)(1.04g，83％)。
LCMS(ESI)m/z＝492(M+Na)+
保留时间：0.95分钟(分析条件SQDAA05-2)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-((R)-1-((烯丙氧基)羰基)-4，4-二氟吡咯烷-2-基)戊酸(化合物aa122，Fmoc-Nva(2-R-4-F2-Pyrro(N-Alloc))-OH)根据以下方案合成。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-((R)-1-((烯丙氧基)羰基)-4，4- 二氟吡咯烷-2-基)戊酸(化合物aa122，Fmoc-Nva(2-R-4-F2-Pyrro(N-Alloc))-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的(S)-4，4-二氟吡咯烷-2-羧酸甲基盐酸盐(CAS.No.156046-05-8)(6.9g，34.2mmol)的二氯甲烷溶液(68.5mL)中于室温加入三乙胺(11.9mL，86mmol)。在反应液中于室温加入二碳酸二叔丁酯(Boc2O)(11.2g，51.3mmol)，搅拌1小时。在反应液中加入水之后，用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-4，4-二氟吡咯烷-1，2-二羧酸2-甲基1-(叔丁基)酯(化合物aa118)(6.85g，75％)。
在如上所述得到的(S)-4，4-二氟吡咯烷-1，2-二羧酸2-甲基1-(叔丁基)酯(化合物aa118)(6.43g，24.2mmol)的四氢呋喃(THF)溶液(121mL)中在0度加入硼氢化锂/四氢呋喃(THF)溶液(6.67mL，26.7mmol)，于室温搅拌1.5小时。进一步在0度加入硼氢化锂/四氢呋喃(THF)溶液(1.5mL，6.0mmol)，于室温搅拌1小时。在0度在反应液中加入10％氯化钠水溶液之后，用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-4，4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(化合物aa119)(5.70g，99％)。
在氮气氛围中，在得到的(S)-4，4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(335mg，1.41mmol)的二氯甲烷溶液(7.0mL)中在0度加入市售的1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2--苯并碘醇(benzoiodoxol)-3(1H)-酮(Dess-Martinreagent)(719mg，1.69mmol)，于室温搅拌30分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液之后，用乙酸乙酯提取，将得到的有机层用水洗涤。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了醛中间体。
在氮气氛围中，在甲基三苯基溴化鏻(562mg，1.57mmol)的二乙醚溶液(3.1mL)中于室温加入2-甲基丙-2-醇钾(potassium 2-methylpropan-2-olate)(tBuOK)(177mg，1.57mmol)，于室温搅拌2小时。在反应液中，加入另外制备的醛中间体(185mg，0.786mmol)的二乙醚溶液(0.79mL)，于室温搅拌1小时。在反应液中加入10％氯化铵水溶液之后，用乙酸乙酯提取，将得到的有机层用水洗涤。将得到的有机层在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-4，4-二氟-2-乙烯基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(化合物aa120)(135mg，74％)。
在氮气氛围中，将得到的(S)-4，4-二氟-2-乙烯基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(化合物aa120)(3.50g，15.0mmol)和(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)五-4-烯酸(CAS#：146549-21-5，Fmoc-Algly-OH)(9.52g，28.2mmol)溶解于2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)(60mL)中。在该溶液中加入第2代Hoveyda-Grubbs催化剂(0.94g，1.50mmol)，在60度搅拌过夜。冷却至室温之后，用硅藻土过滤，将滤液在减压下浓缩。将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了粗产物(7.58g)。
将得到的粗产物(7.58g)溶解于甲醇(186mL)中，加入10％钯碳(1.6g)，在氢气氛围中于室温搅拌2天。将反应液用硅藻土过滤，将滤液在减压下浓缩。将得到的残渣溶解于甲醇(34.9mL)中，加入饱和碳酸氢钠水溶液(34.9mL)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(7.07g，20.95mmol)于室温搅拌2小时。过滤分离不溶物，将滤液利用1M盐酸水溶液变为酸性之后，用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-((R)-1-(叔丁氧羰基)-4，4-二氟吡咯烷-2-基)戊酸(化合物aa121)(2.54g，33％)。
LCMS(ESI)m/z＝567(M+Na)+
保留时间：1.32分钟(分析条件SMD方法45)
将得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-((R)-1-(叔丁氧羰基)-4，4-二氟吡咯烷-2-基)戊酸(化合物aa121)(2.17g，3.98mmol)溶解于二氯甲烷(DCM)(53.1mL)中，加入三氟乙酸(9.15mL，119.8mmol)于室温搅拌1小时30分钟。将反应液在减压下浓缩，在残渣中加入甲苯再次减压浓缩，得到了粗产物(2.66g)。
将得到的粗产物(2.66g)溶解于1，4-二噁烷/水(12.67mL/12.67mL)溶液，于室温加入碳酸氢钠(1.92g，22.80mmol)和N-(烯丙氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Alloc-OSu)(0.61mL，3.91mmol)，搅拌30分钟。在反应液中加入甲酸和二甲亚砜通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-((R)-1-((烯丙氧基)羰基)-4，4-二氟吡咯烷-2-基)戊酸(化合物aa122，Fmoc-Nva(2-R-4-F2-Pyrro(N-Alloc))-OH)(1.97g，94％)。
LCMS(ESI)m/z＝529(M+H)+
保留时间：2.75分钟(分析条件SMD方法47)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(((S)-1-((烯丙氧基)羰基)-4，4-二氟吡咯烷-2-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa126，Fmoc-Ser(S-4-F2-Pyrro(N-Alloc)-Me)-OH)根据以下方案合成。
在氮气氛围中，在市售的(S)-4，4-二氟吡咯烷-2-羧酸甲基盐酸盐(CAS.No.156046-05-8)(5.08g，25.2mmol)的水溶液(11.43mL)中于室温加入碳酸氢钠(5.29g，63.0mmol)。在反应液中于室温滴加氯甲酸烯丙酯(4.0mL，37.8mmol)的1，4-二噁烷溶液(22.9mL)，进一步搅拌1.5小时。在反应液中加入水之后，用乙酸乙酯萃取2次，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-4，4-二氟吡咯烷-1，2-二羧酸2-甲基1-烯丙基酯(化合物aa123)(6.21g，99％)。
LCMS(ESI)m/z＝250(M+H)+
保留时间：0.91分钟(分析条件SMD方法45)
在如上所述得到的(S)-4，4-二氟吡咯烷-1，2-二羧酸2-甲基1-烯丙基酯(化合物aa123)(6.81g，27.3mmol)的四氢呋喃(THF)溶液(82.0mL)中在0度滴加硼氢化锂/四氢呋喃(THF)溶液(10.24mL，41.0mmol)，于室温搅拌2小时。在反应液中在0度加入水和2N盐酸水溶液(20.5mL，41.0mmol)之后，用乙酸乙酯提取，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-4，4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羧酸烯丙基酯(化合物aa124)(5.13g，85％)。
LCMS(ESI)m/z＝222(M+H)+
保留时间：0.76分钟(分析条件SMD方法45)
在氮气氛围中，在得到的(S)-4，4-二氟-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羧酸烯丙基酯(化合物aa124)(5.1g，23.06mmol)和2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(化合物aa73，Fmoc-Azy-OMe)(4.97g，15.37mmol)的二氯甲烷溶液(36mL)中在0度滴加三氟化硼-乙醚complex(0.876mL，6.92mmol)的二氯甲烷溶液，进一步搅拌1.5小时。在反应液中加入水之后，用二氯甲烷萃取，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(正己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙氧基)甲基)-4，4-二氟吡咯烷-1-羧酸烯丙基酯(化合物125，Fmoc-Ser(S-4-F2-Pyrro(N-Alloc)-Me)-OMe)(5.68g，68％)。
LCMS(ESI)m/z＝545(M+H)+
保留时间：3.02分钟(分析条件SMD方法47)
在氮气氛围中，在氯化钙(18.7g，168mmol)的水溶液(46.8mL)中于室温加入氢氧化锂一水合物(1.89g，44.9mmol)，于室温搅拌5分钟。于室温加入异丙醇(187mL)和(S)-2-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙氧基)甲基)-4，4-二氟吡咯烷-1-羧酸烯丙基酯(化合物125，Fmoc-Ser(S-4-F2-Pyrro(N-Alloc)-Me)-OMe)(6.12g，11.23mmol)的四氢呋喃溶液(46.8mL)，搅拌6.5小时。加入2N盐酸(33.7mL，67.4mmol)之后，减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(((S)-1-((烯丙氧基)羰基)-4，4-二氟吡咯烷-2-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa126，Fmoc-Ser(S-4-F2-Pyrro(N-Alloc)-Me)-OH)(3.76g，63％)。
LCMS(ESI)m/z＝531(M+H)+
保留时间：2.69分钟(分析条件SMD方法47)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa127，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONMe)-OH)及(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-甲氧基-3-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa128，Fmoc-Phe(4-OMe-3-CONMe)-OH)及(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-((甲基磺酰)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa129，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHMs)-OH)依照以下方案合成。
4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L- 天冬氨酸(化合物aa130)的合成
在氮气氛围中，在市售的(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧)-4-氧代丁酸(Fmoc-Asp-OtBu)(300g，729.12mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(130.8g，801.8mmol)的四氢呋喃溶液(3000mL)中于室温滴加N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)(181.8g，1.10mmol)，搅拌3小时。将反应液在减压下浓缩，向得到的残渣中加入甲苯，进行过滤，之后将得到的固体用甲苯洗涤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(化合物aa130)(272g，67％)。
LCMS(ESI)m/z＝574(M+NH4)+
保留时间：1.00分钟(分析条件SQD2FA05)
4-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa131)的合成
在氮气氛围中，在市售的4-碘-2-甲氧基苯甲酸(5g，17.983mmol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)(4.15g，21.148mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(4.15g，21.148mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(50mL)中于室温加入2M的甲基胺的四氢呋喃(THF)溶液(22.5mL，45.0mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(12.53mL，94.942mmol)，搅拌16小时。在反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取3次之后，将得到的有机层用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过正相柱层析(己烷/乙酸乙酯)纯化，由此得到了4-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa131)(3.3g，63％)。
LCMS(ESI)m/z＝292(M+H)+
保留时间：0.78分钟(分析条件SMD方法50)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯 基)丙酸(化合物aa127，Fmoc-Phr(3-OMe-4-CONMe)-OH)的合成
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(2.15g，7.59mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(2.15g，7.59mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(120mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，将锌粉(8.61g，134.5mmol)，4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(化合物aa130)(14.6g，26.3mmol)，4-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa131)(11.5g，39.5mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(120mL)于室温搅拌30分钟之后，于室温滴加上述镍催化剂溶液，搅拌16小时。在反应液中加入10％EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。将有机层用饱和食盐水洗涤，减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-CONMe)-OtBu)(9.2g，84％)。
在氮气氛围中，将如上所述得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-CONMe)-OtBu)(11g，20.8mmol)和三甲基氯硅烷(TMSCl)(7.96mL，62.3mmol)的2，2，2-三氟乙醇(TFE)溶液(104mL)于室温搅拌1小时。将反应液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa127，Fmoc-Phr(3-OMe-4-CONMe)-OH)(5.0g，51％)。
LCMS(ESI)m/z＝475(M+H)+
保留时间：0.68分钟(分析条件SQDFA05)
5-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa132)的合成
在氮气氛围中，在市售的5-碘-2-甲氧基苯甲酸(5g，17.983mmol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)(4.15g，21.148mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(4.15g，21.148mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(50mL)中，于室温加入2M的甲基胺的四氢呋喃(THF)溶液(22.5mL，45.0mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(12.5mL，94.942mmol)，搅拌16小时。在反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取2次之后，将得到的有机层用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了5-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa132)(3.3g，63％)。
LCMS(ESI)m/z＝292(M+H)+
保留时间：0.79分钟(分析条件SMD方法50)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-甲氧基-3-(甲基氨基甲酰)苯 基)丙酸(化合物aa128，Fmoc-Phe(4-OMe-3-CONMe)-OH)的合成
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(2.86g，10.50mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(2.86g，10.66mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(161mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，将锌粉(11.4g，174mmol)，4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(化合物aa130)(19.74g，35.47mmol)，5-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa132)(15.5g，53.2mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(161mL)于室温搅拌30分钟之后，于室温滴加上述镍催化剂溶液，搅拌16小时。在反应液中加入10％EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，用硅藻土进行过滤之后，将得到的滤液的有机层分离，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。将混合物过滤之后，将滤液通过减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-甲氧基-3-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(4-OMe-3-CONMe)-OtBu)(10.2g，36％)。
在氮气氛围中，将如上所述得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-甲氧基-3-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(4-OMe-3-CONMe)-OtBu)(10.2g，19.22mmol)和三甲基氯硅烷(TMSCl)(7.26mL，56.8mmol)的2，2，2-三氟乙醇(TFE)溶液(96mL)于室温搅拌1小时。将反应液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-甲氧基-3-(甲基氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa128，Fmoc-Phe(4-OMe-3-CONMe)-OH)(6.12g，36％)。
LCMS(ESI)m/z＝475(M+H)+
保留时间：0.71分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-((甲基磺酰)氨基 甲酰)苯基)丙酸(化合物aa129，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHMs)-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的4-溴-2-甲氧基苯甲酸(45g，194.767mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(220mL)中于室温加入羰基二咪唑(CDI)(47.37g，292.151mmol)，搅拌2小时。在反应液中加入甲磺酰胺(55.58g，584.315mmol)，1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)(88.95g，584.302mmol)，搅拌16小时之后，加入乙酸乙酯。在混合物中加入2N的盐酸水溶液至达到pH 5之后，将得到的有机层用水，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了4-溴-2-甲氧基-N-(甲基磺酰)苯甲酰胺(57.5g，95％)。
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(2.93g，10.78mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(2.89g，10.78mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(100mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，将锌粉(11.75g，179.672mmol)，4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(化合物aa130)(20.0g，35.934mmol)，4-溴-2-甲氧基-N-(甲基磺酰)苯甲酰胺(33.22g，107.803mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(100mL)于室温搅拌之后，于室温滴加上述镍催化剂溶液，搅拌16小时。在反应液中加入10％EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后之后，过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-((甲基磺酰)氨基甲酰)苯基)丙酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-CONHMs)-OtBu)(5.05g，19％)。
在氮气氛围中，将如上所述得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-((甲基磺酰)氨基甲酰)苯基)丙酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-CONHMs)-OtBu)(10.1g，16.984mmol)和三甲基氯硅烷(TMSCl)(5.54g，50.952mmol)的2，2，2-三氟乙醇(TFE)溶液(100mL)于室温搅拌1小时。将反应液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-((甲基磺酰)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa129，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHMs)-OH)(5.06g，55％)。
LCMS(ESI)m/z＝539(M+H)+
保留时间：0.72分钟(分析条件SQDFA05)
(2S，4R)-1-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙 氧基)吡咯烷-2-羧酸(化合物aa133，Fmoc-Hyp(2-EtOTHP)-OH)的合成
在氮气氛围中，在-10℃在市售的(2S，4R)-1-((苄氧基)羰基)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸(Cbz-Hyp-OH)(12.0g，45.2mmol)的二甲基甲酰胺溶液(120mL)中一点一点加入氢化钠(NaH)(18.1g，451.9mmol，60wt％)，在-10℃搅拌1小时。在反应液中在-10℃滴加2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(28.3g，135.7mmol)，将反应液在30℃搅拌3小时。利用碳酸氢钠水溶液(120mL)停止反应，加入乙酸乙酯(120mL)洗涤。向得到的水层中加入1N盐酸水溶液至达到pH＝6之后，用乙酸乙酯(120mL)萃取2次。将得到的有机层用饱和食盐水，5％硫代硫酸钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，由此以粗产物形式得到了(2S，4R)-1-((苄氧基)羰基)-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)吡咯烷-2-羧酸(Cbz-Hyp(2-EtOTHP)-OH)(10.4g)。
在氢气氛围中，将得到的粗产物(2S，4R)-1-((苄氧基)羰基)-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)吡咯烷-2-羧酸(Cbz-Hyp(2-EtOTHP)-OH)(10.1g)和钯碳(Pd/C)(3.0g)的甲醇溶液(100mL)于室温搅拌2小时。将反应液过滤，之后将得到的固体用甲醇(100mL)洗涤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣用醚洗涤，由此以粗产物形式得到了(2S，4R)-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)吡咯烷-2-羧酸(H-Hyp(2-EtOTHP)-OH)(6.1g)。
在得到的粗产物(2S，4R)4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)吡咯烷-2-羧酸(H-Hyp(2-EtOTHP)-OH)(6.1g)和碳酸氢钠(5.9g，70.5mmol)的1，4-二噁烷/水＝1/1溶液(130mL)中加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(7.9g，23.5mmol)，于室温搅拌2小时。在反应液中加入叔丁基甲基醚(TBME)/己烷＝1/3溶液(100mL)，进行3次洗涤操作之后，向得到的水层中加入1N盐酸水溶液至达到pH＝6，用叔丁基甲基醚(TBME)(100mL)萃取。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(2S，4R)-1-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)吡咯烷-2-羧酸(化合物aa133，Fmoc-Hyp(2-EtOTHP)-OH)(1.88g，3个工序30％)。
LCMS(ESI)m/z＝482(M+H)+
保留时间：0.80分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯乙基)甘氨 酸(化合物aa134，Fmoc-(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly-OH)的合成
步骤1
在根据文献所述的方法(Journal of Medicinal Chemistry(1991)，34(4)，1297-1301)制备的3-((2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)丙酸甲酯(31.0g，142.683mmol)和N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(48.13g，142.683mmol)的1，4-二噁烷溶液(200mL)中于室温加入碳酸钠30.25g，285.366mmol)的水溶液(200mL)，搅拌16小时。在反应液中加入乙腈，过滤之后，将滤液在减压下浓缩。向得到的残渣中加入乙酸乙酯，用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。
将得到的滤液在减压下浓缩，由此作为粗产物得到了3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)丙酸甲酯(62g，36％)。
步骤2
在氯化钙(84.54g，761.761mmol)和氢氧化锂的一水合物(8.52g，203.136mmol)中加入水(250mL)和异丙醇(1000mL)之后，在0℃加入上述粗产物3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)丙酸甲酯(62g，50.784mmol)的四氢呋喃溶液(250mL)，搅拌16小时。将反应液在减压下浓缩之后，向得到的残渣中加入水，用叔丁基甲基醚(TBME)洗涤。向得到的水层中加入1N盐酸水溶液至溶液的pH达到酸性之后，用乙酸乙酯萃取。将得到的有机层用水，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，由此作为粗产物得到了3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)丙酸(14g，58％)。
步骤3
在氮气氛围中，将上述粗产物3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)丙酸(14g，32.904mmol)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(5.90g，36.194mmol)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)(7.47g，36.194mmol)的四氢呋喃溶液(140mL)于室温搅拌16小时。将反应液过滤之后，在减压下浓缩，向得到的残渣中加入乙酸乙酯，用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将得到的滤液在减压下浓缩，作为粗产物得到了3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基丙酸酯(14g，75％)。
步骤4
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(5.73g，21.031mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(5.64g，21.031mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(200mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，将锌粉(22.93g，350.509mmol)，如上述进行得到的粗产物3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(2-(叔丁氧)-2-氧代乙基)氨基)1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基丙酸酯(40.0g，70.102mmol)，实施例中如记载的那样合成的4-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa131)(40.81g，140.204mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(200mL)于室温搅拌10分钟之后，于室温滴加上述镍催化剂溶液，搅拌16小时。在反应液中加入10％EDTA.2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，过滤之后，用乙酸乙酯萃取3次。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过正相柱层析纯化，由此得到了叔丁基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯乙基)甘氨酸酯(14g，37％)。
步骤5
将上述叔丁基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯乙基)甘氨酸酯(14.0g，25.705mmol)的4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(65mL)于室温搅拌48小时。将反应液在减压下浓缩，之后将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯乙基)甘氨酸(化合物aa134，Fmoc-(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly-OH)(6g，47％)。
LCMS(ESI)m/z＝489(M+H)+
保留时间：0.70分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯 基)丁酸(化合物aa135，Fmoc-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH)的合成
步骤1
在氮气氛围中，将市售的(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu-OtBu)(175g，411.299mmol)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(67.1g，411.299mmol)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)(78.85g，411.299mmol)，N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)(2.51g，20.565mmol)的二甲基甲酰胺溶液(2000mL)于室温搅拌16小时。在反应液中加入1M盐酸水溶液之后，用叔丁基甲基醚(TBME)萃取。将得到的有机层用水，50％饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸5-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(105g，45％)。
步骤2
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(141mg，0.526mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(140mg，0.526mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(5mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，将锌粉(617mg，8.75mmol)，如上述进行得到的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸5-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)1-(叔丁基)(1.0g，1.75mmol)，实施例中如记载的那样合成的4-碘-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(化合物aa131)(1.19g，3.50mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(5mL)于室温搅拌1小时之后，于室温滴加上述镍催化剂溶液，搅拌16小时。在反应液中加入10％EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，过滤之后，用乙酸乙酯萃取3次。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丁酸叔丁酯(550mg，57％)。
步骤3
在如上述进行得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丁酸叔丁酯(3.00g，5.508mmol)的三氟乙醇(TFE)溶液(30mL)中于室温加入三甲基氯硅烷(TMS-Cl)(1.80g，16.568mmol)，搅拌3小时。将反应液在减压下浓缩，之后将得到的残渣用乙酸乙酯纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丁酸(化合物aa135，Fmoc-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH)(1.9g，70％)。
LCMS(ESI)m/z＝489(M+H)+
保留时间：0.71分钟(分析条件SQDFA05)
(R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯 基)丁酸(化合物aa136，Fmoc-D-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH)的合成
采用与使用市售的(R)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(Fmoc-D-Glu-OtBu)的化合物aa135的合成相同的办法，合成了(R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丁酸(化合物aa136，Fmoc-D-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH)(5g，3个工序20％)。
LCMS(ESI)m/z＝487(M-H)-
保留时间：0.83分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基 甲酰)苯基)丁酸(化合物aa137，Fmoc-MeHph(3-OMe-4-CONMe)-OH)的合成
采用与使用另外合成的(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(化合物aa138，Fmoc-MeGlu-OtBu)的化合物aa135的合成相同的办法，合成了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3-甲氧基-4-(甲基氨基甲酰)苯基)丁酸(化合物aa137，Fmoc-MeHph(3-OMe-4-CONMe)-OH)(2.8g，3个工序20％)。
LCMS(ESI)m/z＝503(M+H)+
保留时间：0.73分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(化 合物aa138，Fmoc-MeGlu-OtBu)的合成
在氮气氛围中，将市售的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu(OAll)-OH)(100g，244.237mmol)，多聚甲醛(22g，733.333mmol)，对甲苯磺酸(TsOH)(0.42g，2.438mmol)的甲苯溶液(1000mL)在110℃搅拌1.5小时。将反应液于室温冷却之后，在减压下浓缩，向得到的残渣中加入乙酸乙酯，用碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，在减压下浓缩，作为粗产物，得到了(S)-4-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(110g)。
在氮气氛围中，在上述作为粗产物得到的(S)-4-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(110g)，三乙基硅烷(Et3SiH)(60.6g，522.565mmol)，水(4.7mL，264.282mmol)的二氯甲烷溶液(1100mL)中在0℃加入三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(74.2g，522.565mmol)，搅拌16小时。在反应液中加入氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取2次之后，将得到的有机层在减压下浓缩。在残渣中加入碳酸氢钠水溶液使其溶解之后，用己烷/乙酸乙酯(5/1)洗涤3次。在水层中加入6N盐酸水溶液至达到pH＝2，用乙酸乙酯萃取2次。将有机层用水，饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩。将得到的残渣使用1％三氟乙酸(TFA)的乙腈/水(1/5)溶液重结晶，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-MeGlu(OAll)-OH)(95g，2个工序86％)。
在氮气氛围中，在如上述得到的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-MeGlu(OAll)-OH)(100g，236.406mmol)和三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(0.16g，2.364mmol)的二氯甲烷溶液(260mL)中在0℃加入2，2，2-三氯乙酰亚胺叔丁酯(51g，472.813mmol)的环己烷溶液之后，搅拌1小时。在反应液中加入吡啶，进行过滤之后，将滤液用碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣使用乙腈/水(1/5)溶液重结晶，由此定量地得到了1-(叔丁基)5-烯丙基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-L-谷氨酸(102g)。
在氮气氛围中，在如上述进行得到的1-(叔丁基)5-烯丙基N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基-L-谷氨酸(290g，605.427mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)(7.0g，6.054mmol)的二氯甲烷溶液(1450mL)中于室温滴加苯基硅烷(PhSiH3)(45.77g，423.799mmol)，搅拌。通过LC-MS确认原料消失后，将反应液过滤，将得到的滤液在减压下浓缩。在残渣中加入碳酸钠水溶液使其溶解之后，用己烷/叔丁基甲基醚(1/3)溶液洗涤3次。在水层中加入磷酸至-达到pH＝2之后，用叔丁基甲基醚萃取2次。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将得到的滤液在减压下浓缩，由此得到了(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(化合物aa138，Fmoc-MeGlu-OtBu)(247g，93％)。
LCMS(ESI)m/z＝462(M+Na)+
保留时间：1.380分钟(分析条件SMD方法52)
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(甲基((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa139，Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OH)，(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa140，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OH)依照以下方案合成。
1-甲基4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬 氨酸的合成
在氮气氛围中，于室温将市售的(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-甲氧基-4-氧代丁酸(Fmoc-Asp-OMe)(15.0g，40.6mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(7.3g，44.7mmol)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)(8.4g，40.6mmol)的四氢呋喃溶液(225mL)在25℃搅拌2小时。将反应液在减压下浓缩，向得到的残渣中加入乙酸乙酯，进行过滤，之后将得到的固体用乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩，向得到的残渣中加入乙酸乙酯(1.5L)，在50℃搅拌16小时。冷却至室温之后，进行过滤，将固体用乙酸乙酯洗涤之后，将滤液在减压下浓缩，由此得到了粗产物1-甲基4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(10.4g)。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯甲酸 叔丁酯(Fmoc-Phehe(4-COtBu)-OMe)的合成
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(1.649g，6.064mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(1.627g，6.064mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(50mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，在锌粉(6.61g，101.071mmol)，1-甲基4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(10.4g，20.214mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(50mL)中在0℃滴加4-溴苯甲酸叔丁酯(10.4g，40.447mmol)，于室温搅拌16小时。在反应液中在0℃加入10％EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，进行过滤，固体用乙酸乙酯洗涤之后，将滤液用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯甲酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(4-COtBu)-OMe)(11.9g，76％)。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯甲酸 (Fmoc-Phe(4-COOH)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在上述(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯甲酸叔丁酯(11.9g，23.7mmol)的二氯甲烷溶液(238mL)中加入三氟乙酸(TFA)(71.4mL)，于室温搅拌3小时。在反应液中加入水(250mL)之后，用二氯甲烷(250mL)萃取。将有机层用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩，由此作为粗产物得到了(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯甲酸(Fmoc-Phe(4-COOH)-OMe)(10.1g)。
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(甲基((四氢-2H-吡喃-2- 基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在上述粗产物(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯甲酸(10.1g，22.6mmol)和采用文献所述的方法(Journal ofOrganic Chemistry，2014，79(20)，9699-9703)另外合成的N-甲基-O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟胺(14.9g，113.5mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)中，于室温加入O-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(12.9g，34.0mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(4.4g，34.0mmol)，搅拌16小时。在反应液中加入水(100mL)，用乙酸乙酯(200mL)萃取之后，用水(100mL)，饱和食盐水(100mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(甲基((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OMe)(7.2g，55％)。
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(甲基((四氢-2H-吡喃-2- 基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa139，Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OH)的合成
氯化钙(21.46g，193.33mmol)和氢氧化锂的一水合物(2.16g，51.47mmol)中加入水(72mL)，于室温搅拌15分钟之后，于室温加入上述(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(甲基((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OMe)(7.20g，12.89mmol)的四氢呋喃/叔丁醇(72mL/288mL)溶液，搅拌16小时。将反应液过滤，将固体用四氢呋喃(200mL)洗涤之后，将滤液在减压下浓缩，加入水(50mL)，用乙酸乙酯(200mL)萃取2次。将有机层用0.05N磷酸水溶液(350mL)洗涤之后，将得到的水层再次用乙酸乙酯(200mL)萃取。将有机层合并，在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(甲基((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa139，Fmoc-Phe(4-CONMeOTHP)-OH)(5.1g，71％)。
LCMS(ESI)m/z＝545(M+H)+
保留时间：0.79分钟(分析条件SQDFA05)
4-碘-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯的合成
在氮气氛围中，在市售的4-碘-2-甲氧基苯甲酸(15.0g，53.948mmol)的二氯甲烷溶液(60.0mL)中于室温滴加2，2，2-三氯乙酰亚胺叔丁酯(23.58g，107.896mmol)的环己烷溶液(120mL)之后，滴加三氟化硼二乙醚络合物(BF3·OEt2)(76.57mg，0.539mmol)，于室温搅拌2小时。将反应液在减压下浓缩，向得到的残渣中加入己烷，搅拌1小时，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩，由此作为粗产物得到了4-碘-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(21g)。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)-2-甲氧 基苯甲酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-COtBu)-OMe)的合成
在氮气氛围中，将溴化镍(II)3水合物(NiBr2·3H2O)(4.28g，15.711mmol)和4，4′-二-叔丁基-2，2′-双吡啶(dtbbpy)(4.22g，15.711mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(150mL)在50℃搅拌3小时之后，冷却至室温，由此得到了镍催化剂溶液。在氮气氛围中，将锌粉(17.13g，261.856mmol)，如上述合成的1-甲基4-(1，3-二氧代异二氢吲哚-2-基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-天冬氨酸(26.94g，52.371mmol)，如上述合成的粗产物4-碘-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(35.0g，104.742mmol)的二甲基乙酰胺(DMA)溶液(150mL)于室温搅拌10分钟之后，于室温滴加上述镍催化剂溶液，搅拌16小时。在反应液中加入10％EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)水溶液，进行过滤之后，得到的滤液用乙酸乙酯萃取2次。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后之后，过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-COtBu)-OMe)(8.4g，13％)。
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)-2-甲氧 基苯甲酸(Fmoc-Phe(3-OMe-4-COOH)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在如上所述得到的(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)-2-甲氧基苯甲酸叔丁酯(Fmoc-Phehe(3-OMe-4-COtBu)-OMe)(26.8g，50.4mmol)的1，4-二噁烷溶液(30.0mL)中于室温加入4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(268mL)，搅拌1小时。将反应液在减压下浓缩，将得到的残渣用己烷/乙酸乙酯(5/1)洗涤，由此作为粗产物得到了(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)-2-甲氧基苯甲酸(Fmoc-Phe(3-OMe-4-COOH)-OMe)(22g)。
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡 喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OMe)的合成
在氮气氛围中，在上述粗产物(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)-2-甲氧基苯甲酸(Fmoc-Phe(3-OMe-4-COOH)-OMe)(22.0g，46.267mmol)和市售的O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟胺(27.1g，231.337mmol)的二氯甲烷溶液(400mL)中于室温加入O-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(21.11g，55.521mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(7.18g，55.521mmol)，搅拌16小时。在反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取2次之后，用饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将滤液在减压下浓缩，作为粗产物得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OMe)(35.0g)。
(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡 喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa140，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OH)的 合成
在氯化钙(101.40g，913.631mmol)和氢氧化锂的一水合物(5.83g，243.635mmol)中在0℃加入水(360mL)，异丙醇(1440mL)，滴加上述粗产物(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸甲酯(Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OMe)(35.0g，60.909mmol)的四氢呋喃溶液(360mL)之后，于室温搅拌16小时。将反应液在减压下浓缩，有机溶剂除去之后，向得到的水层中加入2M盐酸水溶液至达到pH＝7，用乙酸乙酯萃取2次。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，将得到的滤液在减压下浓缩，残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(2S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(3-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基甲酰)苯基)丙酸(化合物aa140，Fmoc-Phe(3-OMe-4-CONHOTHP)-OH)(7.3g，40％)。
LCMS(ESI)m/z＝561(M+H)+
保留时间：0.77分钟(分析条件SQDFA05)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(((S)-4-((烯丙氧基)羰基)吗啉-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa141，Fmoc-Ser(S-(Alloc)Mor-3-Me)-OH)根据下述方案合成。
步骤1
在氮气氛围中，在市售的(S)-吗啉-3-羧酸(CAS.No.741288-31-3)(14.0g，107mmol)的水溶液(100mL)中于室温加入碳酸氢钠(20.26g，241.172mmol)。在反应液中于室温滴加氯甲酸烯丙酯(Alloc-Cl)(17.44g，120.53mmol)的1，4-二噁烷溶液(100mL)，搅拌2小时。在反应液中加入水之后，用乙酸乙酯提取，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了3-甲基4-烯丙基(S)-吗啉-3，4-二羧酸酯(19g，86％)。
步骤2
在如上述进行得到的3-甲基4-烯丙基(S)-吗啉-3，4-二羧酸酯(19.5g，85.067mmol)的四氢呋喃(THF)溶液(283mL)中在0度滴加硼氢化锂(5.56g，255.233)/四氢呋喃(THF)溶液，于室温搅拌2小时。在反应液中在0度加入水和2N盐酸水溶液之后，用乙酸乙酯提取，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(R)-3-(羟基甲基)吗啉-4-羧酸烯丙酯(10.1g，59％)。
步骤3
在氮气氛围中，在上述(R)-3-(羟基甲基)吗啉-4-羧酸烯丙酯(7.0g，34.8mmol)和采用专利所述的方法(WO2015/179823)合成的2-甲基1-((9H-芴-9-基)甲基)(S)-氮丙啶-1，2-二羧酸酯(7.50g，23.2mmol)的二氯甲烷溶液(47mL)中，在0度滴加了三氟化硼-乙醚络合物(1.48g，10.45mmol)的二氯甲烷溶液，搅拌2小时。在反应液中加入水之后，用二氯甲烷萃取，将得到的有机层用饱和食盐水洗涤之后，用无水硫酸钠干燥，进行过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(S)-3-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙氧基)甲基)吗啉-4-羧酸烯丙酯(4.5g，37％)。
步骤4
在氮气氛围中，在氯化钙(15.87g，142.974mmol)的水溶液(50mL)中于室温加入氢氧化锂一水合物(0.91g，37.999mmol)，于室温搅拌10分钟。在反应液中在0℃加入如上述进行得到的(S)-3-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙氧基)甲基)吗啉-4-羧酸烯丙酯(5.0g，9.532mmol)的四氢呋喃溶液(50mL)，异丙醇(200mL)，于室温搅拌9小时之后，加入1M盐酸水溶液，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(((S)-4-((烯丙氧基)羰基)吗啉-3-基)甲基)-L-丝氨酸(化合物aa141，Fmoc-Ser(S-(Alloc)Mor-3-Me)-OH)(2.4g，49％)。
LCMS(ESI)m/z＝511(M+H)+
保留时间：0.77分钟(分析条件SQDFA05)
1-3.在基于肽合成仪的肽合成中使用的树脂合成
基于肽合成仪的肽合成中使用的树脂，如下所述合成。2-氯三苯甲基氯化树脂(100-200mesh，1％DVB)购自渡边化学工业及Chem-Impex公司。
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯 三苯甲基树脂(化合物pd01，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)的合成
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd01，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)通过WO2013/100132中记载的方法合成。
需要说明的是，在本说明书中，在聚合物或树脂与化合物发生了结合的情况下，有时将聚合物、树脂部位用○进行标记。另外，出于使树脂部位的反应点明确的目的，有时与○连接而标记反应部位的化学结构。在以上的结构中，示出了在Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip(化合物pd01)中，树脂上的2-氯三苯甲基利用Asp的侧链羧酸与酯键进行结合的情形。
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁 酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd07，Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)的合成
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd07，Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)通过下述途径合成。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(烯丙氧基)-4-氧代丁酸 (化合物pd04，Fmoc-MeAsp(OAl)-OH)的合成
在氮气氛围中，在(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(烯丙氧基)-4-氧代丁酸(化合物pd02，Fmoc-Asp(OAl)-OH)(10.0g，25.3mmol)的甲苯溶液(100mL)中于室温加入多聚甲醛(1.52g)，甲苯磺酸(TsOH)(260mg，1.51mmol)，在110℃搅拌16小时。之后，将反应液冷却至室温，进行了2次利用饱和碳酸氢钠水溶液的洗涤。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，作为粗产物得到了(S)-4-(2-(烯丙氧基)-2-氧代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物pd03)(8.0g)。
在氮气氛围中，将通过前面工序得到的(S)-4-(2-(烯丙氧基)-2-氧代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物pd03)(5.0g，12.3mmol)和三乙基硅烷(Et3SiH)(4.3g，37.0mmol)的二氯甲烷/三氟乙酸(TFA)＝1/1(80mL/80mL)的溶液于室温搅拌2天之后，将反应液减压浓缩。向得到的残渣中加入碳酸钾(K2CO3)水溶液，用石油醚洗涤3次之后，使用盐酸调整至pH3，使用乙酸乙酯萃取3次。将有机层汇总并用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(烯丙氧基)-4-氧代丁酸(化合物pd04，Fmoc-MeAsp(OAl)-OH)(3.0g，46％，2个工序)。
LCMS(ESI)m/z＝410(M+H)+
保留时间：0.84分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸 烯丙基酯(化合物pd05，Fmoc-MeAsp(OAl)-pip)的合成
在氮气氛围中，在0℃加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSCI·HCl)(16.5g，86mmol)的DMF溶液(143mL)中1-羟基苯并三唑(HOBt)(10.6g，79mmol)，接着在0℃滴加(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(烯丙氧基)-4-氧代丁酸(化合物pd04，Fmoc-MeAsp(OAl)-OH)(29.3g，71.6mmol)的DMF/DCM＝1/1的混合溶液(117mL)，搅拌30分钟。之后，在0℃滴加哌啶(8.49mL，86mmol)，搅拌30分钟。通过LC-MS确认反应的进行后，向反应液中加入乙酸乙酯，升温至室温。将得到的有机层利用2M的盐酸水溶液洗涤2次，利用5％碳酸氢钠水溶液洗涤2次，利用饱和食盐水洗涤2次之后，利用硫酸镁进行干燥。将得到的混合物过滤，减压浓缩，得到了(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸烯丙基酯(化合物pd05，Fmoc-MeAsp(OAl)-pip)(33.7g，99％)。
LCMS(ESI)m/z＝477(M+H)+
保留时间：1.32分钟(分析条件SMDmethod6)
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸 (化合物pd06，Fmoc-MeAsp-pip)的合成
在氮气氛围中，在(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸烯丙基酯(化合物pd05，Fmoc-MeAsp(OAl)-pip)(31.4g，65.9mmol)，4-甲基苯磺酸钠(11.2g，62.6mmol)，四三苯基膦钯(Pd(PPh3)4)(761mg，0.659mmol)中加入二氯甲烷(132mL)，于室温搅拌1.5小时。之后，在反应液中加入5％碳酸氢钠水溶液，用叔丁基甲基醚(TBME)洗涤2次。使用6M盐酸水溶液将得到的水层的pH调成酸性之后，利用乙酸乙酯进行萃取。将得到的有机层用50％食盐水洗涤2次，利用无水硫酸镁进行干燥之后，对得到的混合物进行过滤，在减压下浓缩。将得到的残渣通过反相硅胶柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈)纯化，进一步通过正相硅胶柱层析(CO2H硅胶，己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸(化合物pd06，Fmoc-MeAsp-pip)(17.1g，60％)。
LCMS(ESI)m/z＝437(M+H)+
保留时间：1.10分钟(分析条件SMDmethod6)
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁 酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd07，Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)的合成
在带过滤器的反应容器中放入2-氯三苯甲基氯化树脂(1.60mmol/g，100-200mesh，1％DVB，购自渡边化学，25g，40.0mmol)和脱水二氯甲烷(400mL)，于室温振荡10分钟。施加氮压除去二氯甲烷之后，在反应容器中添加向(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸(化合物pd06，Fmoc-MeAsp-pip)(8.37g，20.0mmol)和脱水二氯甲烷(400mL)中加入了脱水甲醇(6.48mL)及二异丙基乙基胺(DIPEA)(16.7mL)的混合液，振荡30分钟。施加氮压除去反应液之后，在反应容器中添加向脱水二氯甲烷(400mL)中加入了脱水甲醇(50.0mL)和二异丙基乙基胺(DIPEA)(16.7mL)而成的混合液，振荡1小时30分钟。施加氮压除去反应液之后，放入二氯甲烷，振荡5分钟。施加氮压除去反应液。将该利用二氯甲烷的树脂的洗涤重复2次，将得到的树脂在减压下干燥过夜，得到了(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd07，Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)(29.9g)。
将得到的(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd07，Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)(10.7mg)放入反应容器，加入DMF(200μL)，哌啶(200μL)，于室温振荡1小时。之后，向反应混合液中加入DMF(1.6mL)，取出400μL，测定其吸光度(301.2nm)(使用岛津，UV-1600PC(单元长1.0cm)测定)，算出(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd07，Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip)的上样量为0.416mmol/g。
需要说明的是，对于同样地合成的上样量不同的其他批次而言，也用于肽合成中。
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(甲基((S)-1-氧代-1-(((S)-1- 氧代-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸-2-氯三苯甲 基树脂(化合物pd08，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-MePhe-Ala-pip)的合成
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(甲基((S)-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd08，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-MePhe-Ala-pip)通过文献所述的方法合成(文献：国际公开编号：WO2013/100132A1)。
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(甲基((S)-1-氧代-1-(((S)-1- 氧代-3-苯基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸-2- 氯三苯甲基树脂(化合物pd09，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-MePhe-Phe-pip)的合成
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(甲基((S)-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-苯基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd09，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-MePhe-Phe-pip)使用文献所述的方法，通过与化合物pd08相同的办法合成(文献：国际公开编号：WO2013/100132A1)。
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(甲基((S)-1-氧代-1-(((S)-1- 氧代-1-(((S)-1-氧代-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-3-苯基 丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd10，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)- 树脂)-MePhe-MePhe-Ala-pip)的合成
(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(甲基((S)-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd10，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-MePhe-MePhe-Ala-pip)通过WO2013/100132中记载的方法合成。
1-4.肽的化学合成
在没有特别记载的情况下，A01-A10，B01-B10，C01-C17，D01-D17，E01-E08，F01-F08，G01-G11，H01-H11，I01-I06，J01-J06，AP01-AP143，pd30-pd36，pd50-pd70，pd100-pd129，pd162，pd163，pd167，pd177-pd247，pd386-pd395，pd452-pd454，pd482-pd487的肽化合物的合成通过在实施例1的开始记载的基本途径，通过以下方法进行。
1)基于自动合成仪的固相肽合成
使用肽合成仪(Multipep RS；Intavis公司制)通过WO2013/100132中记载的方法，利用Fmoc法进行肽合成。需要说明的是，对于操作的具体顺序，遵循了合成仪附带的手册。
在合成仪中设置了结合了N末端利用Fmoc保护的天冬氨酸的侧链羧酸部位的2-氯三苯甲基树脂(例如(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-氧代-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd01，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-树脂)-pip))(每根柱100mg)和，各种Fmoc-氨基酸(0.6mol/L)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或者oxyma(0.375mol/L)的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液，以及二异丙基碳二亚胺(DIC)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液(10％v/v)。使Fmoc-Thr(THP)-OH(化合物aa01)与oxyma共存于NMP溶液中，进一步添加分子筛4A1/8(和光纯药工业)或分子筛4A1/16(和光纯药工业)并放置于合成仪中。也使与Fmoc-Thr(THP)-OH(化合物aa01)同样在氨基酸侧链的保护基具有THP基的氨基酸(例如，Fmoc-Ser(EtOTHP)-OH(化合物aa22)等)与oxyma在NMP溶液中共存，进一步添加分子筛4A1/8(和光纯药工业)或者分子筛4A1/16(和光纯药工业)并放置于合成仪中。在使用氨基酸为盐酸盐等盐的情况下，设置DIPEA/DMF＝3/1的溶液，对于在肽延长时使用的氨基酸，将0.96等量分量的DIPEA作为上述DMF溶液而单独添加。另外，在包含在侧链中具有酸性官能团的氨基酸的肽化合物中，为了抑制脱保护剂的残留引起的肽的过量延长，因此，在肽延长反应时的树脂洗涤中使用了0.08M三乙胺盐酸盐的二氯甲烷溶液。
2)从树脂切割延长的肽
通过WO2013/100132中记载的方法，上相对于在根据上述方法得到的固相上担载的链状肽，加入DCM使树脂再溶胀后，向树脂中加入2，2，2-三氟乙醇(TFE)/DCM(1/1，v/v，2mL)，于室温振荡2小时。接着将管内的溶液利用合成用柱进行过滤，由此除去树脂，将残留的树脂进一步利用2，2，2-三氟乙醇(TFE)/DCM(1/1，v/v，1mL)洗涤2次。将得到的全部切割溶液进行混合而成的溶液，或者将该溶液进一步用二氯乙烷(DCE)(4mL)稀释而成的溶液在减压下浓缩。需要说明的是，在进行利用2，2，2-三氟乙醇(TFE)/DCM(1/1，v/v，2mL)的切割时，也可以添加相对于在使用的树脂上的摩尔数(由上样量(mmol/g)加上使用了的树脂量(通常为0.10g)而成)为1.8等量的容量的DIPEA。
3)切割的肽的环化方法
将切割后减压浓缩而成的残渣溶解于DMF/DCM(1/1，v/v，8mL)中。加入0.5M的O-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)/DMF溶液(相对于使用的树脂上的摩尔数(上样量(mmol/g)加上使用了的树脂量(通常为0.10g)而成)为1.5等量的容量)和，DIPEA(相对于使用的树脂上的摩尔数为1.8等量)，于室温搅拌2小时以上。之后，减压蒸馏除去溶剂。目标的环状肽的生成通过LCMS测定确认。
4)5)环状肽具有的侧链官能团的保护基的脱保护
加入制备的0.05M的四甲基硫酸氢铵/1，1，1，3，3，3-六氟异丙醇(HFIP)溶液(2％三异丙基硅烷(TIPS))4mL，使残渣溶解之后，于室温搅拌4小时以上。静置一定时间之后，加入二异丙基乙基胺(DIPEA)(70μL)，减压蒸馏除去溶剂。
需要说明的是，对包含在侧链具有Alloc基的氨基酸的肽(在序列中包含例如Nva(2-R-4-F2-Pyrro)，Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)等的肽)而言，使用氯化锌(相对于使用树脂上的摩尔数为1.0等量)，四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)(相对于使用树脂上的摩尔数为1.0等量)，聚(甲基氢硅氧烷)(PMHS，CAS#63148-57-2)(相对于使用树脂上的摩尔数为0.9M)，四氢呋喃(相对于使用树脂上的摩尔数为0.1M)于室温搅拌3小时30分钟以上，由此进行Alloc基的脱保护之后，在反应液中加入制备的0.05M的四甲基硫酸氢铵/1，1，1，3，3，3-六氟异丙醇(HFIP)溶液(2％三异丙基硅烷(TIPS))4mL，于室温搅拌4小时以上。静置一定时间之后，加入二异丙基乙基胺(DIPEA)(70μL)，减压蒸馏除去溶剂。Alloc基的脱保护中，可以取代使用上述的PMHS而使用四甲基二硅氧烷(TMDS，CAS#3277-26-7)(相对于使用树脂上的摩尔数为4.0等量)。
在任一种情况下，均在减压蒸馏除去溶剂之后加入DMF，DMSO，或者20％甲醇水溶液，通过过滤器过滤而除去不溶物后，利用制备-HPLC进行纯化。
0.05M的四甲基硫酸氢铵/HFIP溶液(2％TIPS)为从HFIP(11.66mL)，TIPS(0.24mL)，DCE(0.10mL)的混合溶液中取样4mL，向其中溶解34.3mg的硫酸四丁基硫酸氢铵而制备。对该溶液(0.05M的四甲基硫酸氢铵/HFIP溶液(2％TIPS))而言，也可以取代HFIP而使用另外的氟醇，例如2，2，2-三氟乙醇(TFE)等。
实施例2在侧链具有供体(donor)，在该供体部分具有分子内氢键的氨基酸的膜透过性评价
2-1比较在侧链具有供体的氨基酸中在供体部分具有分子内氢键的那些，和不具有的那些的膜透过性
为了确认在侧链具有供体的氨基酸中在供体部分具有分子内氢键的那些比不具有的那些具有更良好的膜透过性，合成了含有每种氨基酸的2个环状肽，通过国际公开第2018/124162号中记载的改良法比较了膜透过性。合成了多个如上所述的2个环状肽的组合，通过评价确认了一般性。结果，确认了在(1)Ser(EtOH)和Nle(6-OH)，(2)Ser(1-CF3-EtOH)和Hnl(7-F3-6-OH)，(3)Tyr(3-OMe)和Tyr，(4)Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)和Nva(2-R-4-F2-Pyrro)，(5)Ser(NMe-Aca)和Gln(Me)的组合中，在侧链具有供体的氨基酸中，含有在供体部分具有分子内氢键的那些的肽比包含不具有的那些的肽具有更良好膜透过性。
进行比较的2个环状肽的序列设计，以使得与将除了具有供体的侧链部分结构以外的膜透过性有关联的原因的影响在最小限度。
例如，分别进行插入，使得进行比较的氨基酸彼此处于2个环状肽的相同位置，使构成环状部及直链部的氨基酸的数目相同(结果，使总AA为相同)。以2个环状肽全部的侧链部分的供体的数目成为相同的方式进行了对齐(作为除了期望评价氨基酸以外的，在侧链具有供体的氨基酸的例子，可列举Thr等)。当除了期望比较的氨基酸以外进一步存在在侧链具有供体的氨基酸时，设计使得其位置相同。另外，将2个环状肽主链上的酰胺基部分的N-烷基的数目凑齐。通过进一步使得2个环状肽主链上的酰胺基的N-烷基(例如NMe基)和NH基的出现模式(N-烷基模式)，Gly衍生物(也包含例如MeGly，nBuGly等烷基-Gly)的位置、环状氨基酸如Pro的位置相同，由此设计使得进行比较的2个环状肽的构象为相同。如参考例4中记载的那样，调节使得进行比较的2个肽的ClogP/总AA的值为±0.03之间，且不包含Trp。如参考例6中记载的那样，凑齐了芳环数目(Aromatic Ring Count：ARC)。
另外，本说明书中的ClogP为用计算机计算的分配系数，可以使用DaylightChemical Information Systems，Inc.的Daylight Version 4.9计算。
(1)Ser(EtOH)和Nle(6-OH)的比较(表4)
合成基于上述的概念设计的包含Ser(EtOH)或者Nle(6-OH)的环状肽，通过国际公开第2018/124162号中记载的改良法比较了膜透过性。包含Ser(EtOH)的序列的化合物编号为AXX(XX表示数字)，包含Nle(6-OH)的序列的化合物编号为BXX(XX表示数字)。化合物编号A01和B01为分别对应的化合物，以下同样地，AXX，BXX和XX的部分为将相同的序列彼此分别对应的组合。比较10个组合时，在全部组合中，含有Ser(EtOH)的环状肽的膜透过性优于含有Nle(6-OH)的环状肽。
下文中，如果没有特殊说明，则通过同样的方法分析。
需要说明的是，以A01为例，对表4，表6，表8，表10，表12及表14的栏进行说明。A01为包含11个残基的环状肽，以11个残基的氨基酸形成环。将环化部分定义为第1位氨基酸，在A01的情况下对应于Asp。将Asp相邻的构成环状部的氨基酸定义为第2位氨基酸，(在A01的情况下对应于MeLeu)，以下第3位，第4位到N末端同样迭代(A01的情况下成为第3位MePhe，第4位Ser(iPen)，由于环状部包含11个残基，因此N末端为第11位D-Val)。另外，C-term的栏指与C末端的氨基酸的羧酸部位缩合的官能团，pip指哌啶。然后，在表4，表6，表8，表10，表12及表14中显示将N末端的氨基与环化部的氨基酸的侧链羧酸通过酰胺键进行环化而成的肽。例如，A01为N末端的D-Val的氨基与环化部的Asp的侧链羧酸通过酰胺键环化而成。关于正文中记载的环状肽，在没有特别记载的情况下，全部以同样的方法表现。
(2)Ser(1-CF3-EtOH)与Hnl(7-F3-6-OH)的比较(表6)
包含Ser(1-CF3-EtOH)的序列的化合物编号为CXX，包含Hnl(7-F3-6-OH)的序列的化合物编号为DXX。比较17个组合时，在15个组合中，含有Ser(1-CF3-EtOH)的环状肽的膜透过性优于含有Hnl(7-F3-6-OH)的环状肽。
(3)Tyr(3-OMe)和Tyr的比较(表8)
包含Tyr(3-OMe)的序列的化合物编号为EXX，包含Tyr的序列的化合物编号为FXX。比较8个组合时，在全部组合中含有Tyr(3-OMe)的环状肽的膜透过性优于含有Tyr的环状肽。
(4)Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)和Nva(2-R-4-F2-Pyrro)的比较(表10)
包含Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)的序列的化合物编号为GXX，包含Nva(2-R-4-F2-Pyrro)的序列的化合物编号为HXX。比较11个组合时，在10个组合中，含有Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)的环状肽的膜透过性优于含有Nva(2-R-4-F2-Pyrro)的环状肽。
(5)Ser(NMe-Aca)和Gln(Me)的比较(表12)
包含Ser(NMe-Aca)的序列的化合物编号为IXX，包含Gln(Me)的序列的化合物编号为JXX。比较6个组合时，在全部组合中含有Ser(NtBu-Aca)的环状肽的膜透过性优于含有Gln(Me)的环状肽。
[表4]
Ser(EtOH)与Nle(6-OH)的比较
将环状肽A01～B10的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表5]
[表6]
Ser(1-CF3-EtOH)与Hnl(7-F3-6-OH)的比较
将环状肽C01～D17的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表7]
[表8]
Tyr(3-OMe)与Tyr的比较
将环状肽E01～F08的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表9]
[表10]
Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)与Nva(2-R-4-F2-Pyrro)的比较
将环状肽G01～H10的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表11]
[表12]
Ser(NMe-Aca)与Gln(Me)的比较
将环状肽I01～J06的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表13]
通过实施例3中记载的低能量构象(Low energy conformation)的计算方法计算了Ser(EtOH)，Ser(1-CF3-EtOH)，Tyr(3-OMe)，Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)，Ser(NMe-Aca)的侧链部分结构，它们最稳定的构象均为具有分子内氢键的构象。结果，通过计算结果确认，膜透过性的改善是由在侧链存在的供体被分子内氢键掩蔽引起的。
2-2在侧链具有供体(donor)的氨基酸中，含有在供体部分具有分子内氢键的那些的肽的膜透过性的结果
对Ser(tBuOH)，Ser(NtBu-Aca)，bAla(3R-MeOEtOH)，Phe(3-OMe-4-CONMe)，Phe(4-OMe-3-CONMe)，Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)，Ser(2-Me-2-BuOH)，Ser(S-2-PrOH)，Ser(R-2-PrOH)，Ser(nPrOH)，Ser(S-2-BuOH)，Ser(R-2-BuOH)，Ser(2-Me2-PrOH)，bAla(2S-MeOEtOH)，Phe(3-OMe-4-CONHMs)，Hph(3-OMe-4-CONMe)，D-Hph(3-OMe-4-CONMe)，(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly，MeHph(3-OMe-4-CONMe)，Hyp(2-EtOH)，Ser(S-Mor-3-Me)，Phe(4-CONMeOH)，Phe(3-OMe-4-CONHOH)的膜透过性进行了评价。结果如下所述。比较一起形成伪6元环的Ser(nPrOH)和Ser(2-Me2-PrOH)的膜透过性时，观察到存在偕甲基的Ser(2-Me2-PrOH)的膜透过性优于不具有偕甲基的Ser(nPrOH)的倾向。作为其原因，可认为是基于Thorpe-Ingold效果的构象自由度的减少，在供体部分附近存在立体上较大的脂溶性取代基如二甲基，由此极性表面积(Polar Surface Area：PSA)发生减少等等。
将对环状肽AP01～AP143，AP200～AP266的膜透过性进行评价的结果示于以下。
[表14]
通过实施例3中记载的低能量构象的计算方法计算了Ser(tBuOH)，Ser(NtBu-Aca)，bAla(3R-MeOEtOH)，Phe(3-OMe-4-CONMe)，Phe(4-OMe-3-CONMe)，Ser(2-Me-2-BuOH)，Ser(S-2-PrOH)，Ser(R-2-PrOH)，Ser(nPrOH)，Ser(S-2-BuOH)，Ser(R-2-BuOH)，Ser(2-Me2-PrOH)，bAla(2S-MeOEtOH)，Phe(3-OMe-4-CONHMs)，Hph(3-OMe-4-CONMe)，D-Hph(3-OMe-4-CONMe)，(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly，MeHph(3-OMe-4-CONMe)，Hyp(2-EtOH)，Ser(S-Mor-3-Me)，Phe(4-CONMeOH)，Phe(3-OMe-4-CONHOH)的侧链部分结构，它们最稳定的构象均为具有分子内氢键的构象。另外，计算了Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)的侧链部分结构时，具有分子内氢键的构象为距离最稳定构象为0.89kJ/mol的构象。因此，认为这些氨基酸也在进行膜透过时形成分子内氢键，膜透过性优于不具有分子内氢键的氨基酸。
将对膜透过性进行了评价的环状肽AP01～AP143，AP200～AP266的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表15]
将上述实施例中对膜透过性进行了评价的环状肽的分析信息示于以下。
[表16]
实施例3侧链部分结构的构象分析
实施例3-1侧链部分结构的低能量构象的计算方法
对侧链部分结构的低能量构象而言，使用从侧链β位(直接与主链连接的碳)抽去氨基酸的侧链部分的部分结构而计算。下列方案显示了Ser(EtOH)，bAla(3R-MeOEtOH)，bAla(2S-MeOEtOH)，Phe(3-OMe-4-CONMe)的实例。
另外，关于具有环状部如Hyp(2-EtOH)(在Hyp(2-EtOH)的情况下为吡咯烷环)的氨基酸，使用了从直接与环状部结合的原子抽出氨基酸的侧链部分的部分结构进行了计算。下列方案显示了Hyp(2-EtOH)的实例。
对例如Ser(EtOH)，bAla(3R-MeOEtOH)，bAla(2S-MeOEtOH)，Hyp(2-EtOH)而言，可以认为作为侧链部分结构而具有相同的结构。
另外，对在氨基酸的氨基具有取代基类型的氨基酸如(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly而言，使用从直接与N原子结合的原子抽出氨基酸的侧链部分的部分结构进行计算。
低能量构象通过以下顺序计算。
(1)初期结构产生
关于可旋转的单键，给予了0，90，180，270度的初期二面角。关于酰胺键以及C和OH之间的键，给予了0，180度的初期二面角。计算Ser(EtOH)的侧链的部分结构时，考虑了2个单键中每一个有4个初期二面角，C和OH之间的键有2个初期二面角，因此合计产生32个初期构象。
(2)结构最优化
使用Gaussian09对(1)产生的全部的构象的结构进行了最优化。在B3LYP/6-31G(d)水平应用极化连续模型(Polarizable Continuum Model)(PCM)，进行了模拟水中的结构最优化。
(3)低能量构象的选择
从(2)中得到的最小化构象(minimized conformation)的能量低顺序中选择了独特的低能量构象。对构象的独特而言，利用在结构产生时考虑的二面角中构象之间的距离(差异)进行判断。将二面角空间中的构象之间的距离(定义式参考下述)与其它全部的低能量构象为60°以上的构象定义为独特。
[数学式1]
：第i个构象的第k个二面角
：第j个构象的第k个二面角
实施例3-2势能面(Potential energy surface)的计算方法
1)下述部分结构(例如Ser(NMe-Aca)的侧链部分结构)中的势能面(图3-1)的情况下
(1)低能量构象按上述顺序计算。
(2)各构象(网格点，grid point)的能量计算
作为初期值为180° 为0°，15°，……以15°为间隔直到345°，生成了24x24＝576个初期构象(网格点)。
将和固定于初期值，将使用Gaussian09产生的全部构象的结构进行最优化。在B3LYP/6-31G(d)水平应用极化连续模型(Polarizable Continuum Model)(PCM)，进行了模拟水中的结构最优化。结果，求出了和以15°为间隔计算出的576个构象的能量图3-1为对从下述式求出的作图而成。
E最低：最低能量构象的能量
2)下述部分结构(例如，Ser(EtOH)，bAla(3R-MeOEtOH)，bAla(2S-MeOEtOH)，Hyp(2-EtOH)的侧链部分结构)中的势能面(图4-1)的情况
(1)低能量构象按上述顺序计算。
(2)各构象(网格点)的能量计算
作为初期值为0°，90°，180°，270°，为0°，15°，……以15°为间隔直到345°，为0°和180°，生成了4x24x2＝192个初期构象(网格点)。其中，时，进一步使90°，180°，270°，90°，180°，270°而产生了4x4＝16个构象。
将固定于初期值，将使用Gaussian09产生的全部构象的结构进行最优化。在B3LYP/6-31G(d)水平应用极化连续模型(Polarizable Continuum Model)(PCM)，进行了模拟水中的结构最优化。其结果，对于各可得到4x2＝8个将在该中能量最低的作为通过下述式求出将以15°为间隔计算的24个构象的能量图4-1为将作图而成。
E最低：最低能量构象的能量
实施例3-3使用在CSD(剑桥结构数据库，The Cambridge Structural Database) 中登记的X射线结构分析结果的，晶体结构(Crystal structures)的构象分布(图3-2，图4- 2)的调查
使用CSD(剑桥结构数据库)5.39+2更新，将下列信息作为query进行检索。
作为检索条件，分别以3D坐标确定(3D coordinates determined)，Rfactor≤0.05，无序(Not disordered)，无错误(No errors)，非聚合物(Not polymeric)，无离子(Noions)，无粉末结构(No powder structures)，仅有机物(Only Organics)进行检索。图3-2，图4-2为将其结果作图而成。作为分析结果，图3-2，图4-2与计算结果图3-1及图4-1没有明显分歧。即，确认任一种部分结构均为容易形成分子内氢键的结构。进一步，对图3-2的在附近存在的2个晶体结构(CSD code：MAPPAV及MUVJOE)进行分析时，确认了作为形成分子内氢键的供体部分的酰胺NH基与自身以外的其它分子形成分子间氢键，用于相互作用。由此确认，图3-1中分析的结构能够形成相应于周围环境的构象，如在进行膜透过时形成对膜透过有利的分子内氢键的构象，与目标相互作用时形成对结合有利的分子间氢键的构象等。
实施例3-4侧链部分结构的低能量构象计算结果
计算示出在下文记载的任一种氨基酸中，侧链部分结构均为容易形成具有分子内氢键的构象的结构。
Ser(EtOH)，bAla(3R-MeOEtOH)，bAla(2S-MeOEtOH)，Hyp(2-EtOH)：这3个氨基酸在侧链部分结构上是相同的。计算结果为具有分子内氢键的构象为最稳定构象。
Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH，D-Hph(3-OMe-4-CONMe)-OH，MeHph(3-OMe-4-CONMe)-OH，(Ph(3-OMe-4-CONMe)Et)Gly：这4个氨基酸在侧链部分结构上是相同的。计算结果为具有分子内氢键的构象为最稳定构象。
表17的计算结果栏中仅记载了最稳定构象。
[表17]
Ser(S-2-PrOH)，Ser(R-2-PrOH)，Ser(tBuOH)，Ser(nPrOH)，Ser(S-2-BuOH)，Ser(R-2-BuOH)，Ser(2-Me2-PrOH)，Ser(2-Me-2-BuOH)，Ser(NMe-Aca)，Ser(NtBu-Aca)，Phe(3-OMe-4-CONMe)，Phe(4-OMe-3-CONMe)，Tyr(3-OMe)，Phe(3-OMe-4-CONHMs)，Phe(4-CONMeOH)，Phe(3-OMe-4-CONHOH)：中任一种的计算结果均为具有分子内氢键的构象为最稳定构象。表18的计算结果栏中仅记载了最稳定构象。
Ser(1-CF3-EtOH)：本氨基酸由于与CF3基结合的碳部分为外消旋体，因此，分别对R体-Ser(R-1-CF3-EtOH)，S体-Ser(S-1-CF3-EtOH)计算了稳定构象。任一的计算结果均为具有分子内氢键的构象为最稳定构象。表18的计算结果栏中仅记载了最稳定构象。
Ser(3-Me-5-Oxo-Odz)：计算结果为具有分子内氢键构象为距离最稳定构象为0.89kJ/mol的构象。表的计算结果的栏记载了距离最稳定构象为0.89kJ/mol的构象。
Ser(S-4-F2-Pyrro-Me)，Ser(S-Mor-3-Me)：这些氨基酸由于在侧链部位具有仲氨基，因此可能带电荷。对不带电荷情况(中性的)，带电荷的情况(带电)的2种情况分别进行计算，任一的计算结果均为具有分子内氢键的构象为最稳定构象。表18的计算结果栏中仅记载了最稳定构象。
[表18]
(参考例1)氨基酸侧链的长度的求算方法
在本说明书的氨基酸的侧链中，包括在与氨基酸中包含的碳原子(例如，α、β、或γ-碳原子)结合的链，及与氮原子结合的链。在本说明书中，氨基酸的侧链的长度可以通过以下方法求出。即，可以通过将氨基酸单位的N末端利用乙酰基，C末端利用甲基氨基加帽，通过分子建模软件MOE(Chemical Computing Group公司)的LowModeMD使其产生构象，测定离侧链部位结合的原子(为天然氨基酸的情况，为α-碳原子(Cα碳))最远的同一侧链的原子(不包括氢原子)的距离而求出。作为例子，将Phe或nBuGly的侧链的长度的求算方法示于以下。
氨基酸侧链的长度的求算方法Phe(左)、nBuGly(右)
另外，在氨基酸侧链与主链结构的一部分形成了环的情况下，变为存在多个与侧链部分结合的原子。在该情况下的侧链的长度，作为针对与各个的侧链部分结合的原子相距最远的侧链的原子(氢原子除外)进行与上述相同的计算，而求出的距离中最长的距离。以Hyp(Et)为例，从氮原子获得的侧链的距离为从Cα碳求出的侧链的距离为因此，Hyp(Et)的侧链的距离为
氨基酸侧链的长度的求算方法Hyp(Et)
将根据上述方法算出的氨基酸的侧链的长度示于以下。
[表19]
氨基酸
侧链的长度(埃)
Ser(EtOH)
6.00
Phe(3-OMe-4-CONHMs)
10.01
(参考例2)pKa的求算方法
在本说明书中，氨基酸的侧链或环状肽化合物的环状部的侧链的计算pKa及碱性计算pKa可以使用ADMETPredictor(Simulations Plus Inc.公司，ver.8.0)求出。对计算pKa及碱性计算pKa而言，使用从侧链β位(直接与主链结合的碳)抽去侧链部分的部分结构而计算。作为例子，以下示出Lys的情况。使用包含侧链β位(直接与主链结合的碳)的部分结构计算碱性计算pKa时为10.5。同样地计算时，作为酸，Asp的侧链羧基的计算pKa为4.3，Tyr的侧差酚性羟基的计算pKa为9.9，3-氟酪氨酸(Tyr(3-F))的侧差酚性羟基的计算pKa为8.7，四唑基的计算pKa为3.7。另一方面，作为碱，Arg的侧链胍基的碱性计算pKa为12.7，His的咪唑基的碱性计算pKa为7.6，吡啶的碱性计算pKa为5.4。
将具有利用本说明书中记载的方法进行了碱性pKa的计算的碱性侧链的氨基酸的一部分示于下述表。
[表20]
将具有利用本说明书中记载的方法进行了pKa的计算的酸性侧链的氨基酸的一部分示于下述表。
[表21]
(参考例3-1)氨基酸侧链的pKa的实测
在本说明书中，氨基酸侧链的pKa的实测按照以下顺序进行。
(使用装置)
Sirius T3(Sirius Analytical Instruments Ltd.，Forest Row，East Sussex，RH18 5DW，UK)
[表22]
pH电极：
Ag/AgCl，双液接(double junction)参比
吹扫气体：
氩气
pH范围：
1.8-12.2
设定条件
设定温度
25℃
离子浓度
0.15M
用于滴定的溶液
0.5M KOH，0.5M HCl
(实施顺序)
向被测物质约1mg的粉体或10mM的DMSO溶液约100uL中添加0.15M的KCl，在为碱性化合物的情况下添加0.5M的HCl至达到pH2后，利用0.5M的KOH进行滴定至pH12。
在为酸性化合物的情况下，添加0.5M的KOH至达到pH12后，利用0.5M的HCl进行滴定至pH2。
滴定操作利用Sirius公司制T3自动进行，使用sirius T3 Refinement软件根据得到的滴定曲线求出了pKa。
另外，作为参照化合物使用了盐酸丙咪嗪，盐酸普萘洛尔，华法林而同样地求出pKa，确认了处于利用Sirius公司得到的试验结果范围内。
对氨基酸侧基的pKa而言，通过合成了将期望评价的氨基酸导入至包含下述所示的3个残基的肽的第2个残基(下述表的X的位置)的序列而求出。
[表23]
3
2
1
C-term
ZMeGly
X
MeGly
pip
以下示出其结果。
[表24]
(参考例3-2)在pKa实测中使用的3残基肽的合成
在使用与实施例1中记载的肽化合物的化学合成相同的手段进行了肽的延长，从树脂上的切割之后，将C末端的羧酸和哌啶缩合，由此合成了pd30-pd36。另外，肽合成中使用的Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-树脂(化合物pd11)如下述所述合成。ZMeGly(Cbz-MeGly-OH，CAS#39608-31-6)购自东京化成工业。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘氨酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物 pd11，Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-树脂)的合成
在带过滤器的反应容器中放入2-氯三苯甲基氯化树脂(1.58mmol/g，100-200mesh，1％DVB，购自渡边化学，10g，15.8mmol)和脱水二氯甲烷，于室温振荡1小时。施加氮压下除去二氯甲烷之后，在反应容器中添加市售的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘氨酸(Fmoc-MeGly-OH)(3.54g，11.39mmol)和二异丙基乙基胺(DIPEA)(5.29mL，30.4mmol)的脱水二氯甲烷(130mL)溶液，振荡30分钟。施加氮压除去反应液之后，在反应容器中添加向脱水二氯甲烷(130mL)中加入了脱水甲醇(5.76mL)和二异丙基乙基胺(DIPEA)(5.29mL，30.4mmol)的混合液，振荡1小时。施加氮压除去反应液之后，放入二氯甲烷，振荡5分钟。施加氮压除去反应液之后，放入二氯甲烷，振荡5分钟。施加氮压除去反应液。将得到的树脂在减压下干燥过夜，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘氨酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd11，Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-树脂)(13.2g)。
得到的树脂的上样量使用文献记载(Letters in Peptie Science，2002，9，203)的方法算出。将N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘氨酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd11，Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-树脂)(14.4mg)放入反应容器，加入DMF(2mL)振荡1小时。在反应液中加入DBU(0.04mL)，振荡30分钟之后，加入DMF(10mL)，取出1mL，进一步用DMF稀释至溶液量达到12.5mL。测定得到的溶液的吸光度(294nM)(岛津，使用UV-1600PC(单元长1.0cm)测定)，算出N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘氨酸-2-氯三苯甲基树脂(化合物pd11，Fmoc-MeGly-Trt(2-Cl)-树脂)的上样量为0.789mmol/g。
(参考例3-3)实测了pKa的肽化合物的分析信息
[表25]
(参考例3-4)实测的pKa的肽化合物的结构信息
[表26]
对包含实测值的碱性pKa为9.1，计算值的碱性pKa为8.9的氨基酸的Ser(Et-2-NMe2)的序列在1.21≤ClogP/总aa≤1.36的范围内，对包含实测值的pKa为3.8，计算值的pKa为5.3的氨基酸-Gln(Ms)的序列在1.20≤ClogP/总aa≤1.33的范围内进行了膜透过性的评价(pd50～pd70)。另一方面，将包含MeAbu(pip-4-F2)，MeAbu(Mor)，Ser(Et-2-Mor)，MeAbu(pip-3-F2)，Abu(5-Oxo-Odz)的序列中实现了膜透过性Papp≥1.0x10-6cm/秒的实例示于以下(pd386-pd395，pd452-pd454，pd482-pd487)。
(参考例3-5)包含Ser(Et-2-NMe2)或Gln(Ms)的环状肽化合物的膜透过性
[表27]
将环状肽pd50～pd70的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表28]
(参考例3-6)包含MeAbu(pip-4-F2)，MeAbu(Mor)，Ser(Et-2-Mor)，MeAbu(pip-3-F2)，Abu(5-Oxo-Odz)的环状肽化合物中实现了Papp≥1.0x10-6cm/秒的实例
[表29]
将环状肽pd386～pd395，pd452～pd454，pd482～487的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表30]
(参考例3-7)Fmoc氨基酸的合成
为了合成在pKa实测中使用的3残基肽，及用于评价膜透过性评价的环状肽而使用的Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH(化合物tm01)，Fmoc-MeAbu(pip-4-F2)-OH(化合物tm04)，Fmoc-MeAbu(pip-3-F2)-OH(化合物tm10)，Fmoc-MeAbu(Mor)-OH(化合物tm19)，Fmoc-Ser(Et-2-Mor)-OH(化合物tm20)，Fmoc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH(化合物tm21)，Fmoc-Gln(Ms)-OH(化合物tm22)如下合成。
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(二甲基氨基)乙基)-L-丝氨酸(化合物 tm01，Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser-OH)的三乙胺盐(5g，11.15mmol)中加入二甲基甲酰胺(DMF)(40mL)之后，于室温加入叔戊醇钠(7.36g，66.9mmol)，搅拌30分钟。在反应液中于室温加入2-氯-N，N-二甲基乙烷-1-胺盐酸盐(4.01g，27.9mmol)，搅拌过夜。在反应液中加入甲酸(6.41mL，167mmol)，通过反相柱层析(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)纯化，得到了O-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser(Et-2-NMe2)-OH)(4.1g)。
得到的O-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-三苯甲基-L-丝氨酸(Trt-Ser(Et-2-NMe2)-OH)(4.1g，9.80mmol)中加入二氯甲烷(10mL)之后，加入4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(40mL，160mmol)，水(4mL)，于室温搅拌3小时。在反应液中加入水(80mL)，用己烷洗涤2次，向得到的水层中在0度碳酸钠26.0g，245mmol)，1，4-二噁烷(120mL)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)加入琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(3.97g，11.76mmol)，于室温搅拌2小时。在反应液中加入甲酸(11.28mL，294mmol)之后，在减压下蒸馏除去1，4-二噁烷，将得到的水层通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(二甲基氨基)乙基)-L-丝氨酸(化合物tm01，Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH)的甲酸盐(3.07g，3个工序69％)。得到的N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(二甲基氨基)乙基)-L-丝氨酸(化合物tm01，Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH)的甲酸盐(3.0g，7.53mmol)中加入二氯甲烷(4mL)，4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(9.411mL，37.6mmol)，于室温搅拌20分钟。将反应液减压浓缩，由此得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-(二甲基氨基)乙基)-L-丝氨酸(化合物tm01，Fmoc-Ser(Et-2-NMe2)-OH)的盐酸盐(2.7g，82％)。
LCMS(ESI)m/z＝399(M+H)+
保留时间：0.50分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)-4-氧代丁 酸叔丁酯(化合物tm02，Fmoc-Asp(pip-4-F2)-OtBu)的合成
在氮气氛围中，向1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(WSC·HCl)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(12mL)中在0度加入1-羟基苯并三唑(HOBt)(723mg，5.35mmol)和通过市售购买的(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧)-4-氧代丁酸(Fmoc-Asp-OtBu)(2g，4.86mmol)，搅拌1小时。在反应液中加入4，4-二氟哌啶盐酸盐(843mg，5.35mmol)和N-乙基-N-异丙基丙烷-2-胺(DIPEA)(931μL，5.35mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(2mL)，在0度搅拌3小时。向反应液中加入水，利用乙酸乙酯萃取2次。将有机层合并所得用0.5M盐酸水溶液，水，50％碳酸氢钠水溶液，50％食盐水洗涤之后，将得到的有机层减压浓缩，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm02，Fmoc-Asp(pip-4-F2)-OtBu)(2.635g)。
LCMS(ESI)m/z＝515(M+H)+
保留时间：0.97分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)丁酸(化合 物tm03，Fmoc-Abu(pip-4-F2)-OH)的合成
在氮气氛围中，在十二羰基三钌(62mg，0.097mmol)的四氢呋喃溶液(5mL)中加入1，1，3，3-四甲基二硅氧烷(2.76mL，15.55mmol)，于室温搅拌10分钟。向反应液中加入溶解于四氢呋喃(7mL)中的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm02，Fmoc-Asp(pip-4-F2)-OtBu)(1.0g，1.943mmol)，在50度搅拌3小时之后，将反应液减压浓缩。将得到的残渣溶解于2，2，2-三氟乙醇(10mL)中，加入三甲基氯硅烷(745μL，5.83mmol)，于室温搅拌1小时。将反应液减压浓缩，之后将得到的残渣溶解于1，4-二噁烷(5mL)和2N盐酸水溶液(10mL)中，于室温搅拌1小时。将反应液用叔丁基甲基醚萃取2次，将有机层减压浓缩。将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)丁酸(化合物tm03，Fmoc-Abu(pip-4-F2)-OH))(540mg，63％)。
LCMS(ESI)m/z＝445(M+H)+
保留时间：0.56分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)丁 酸(化合物tm04，Fmoc-MeAbu(pip-4-F2)-OH)的合成
在氮气氛围中，将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)丁酸(化合物tm03，Fmoc-Abu(pip-4-F2)-OH))(13g，9.25mmol)，多聚甲醛(2.6g，28.86mmol)和三氟乙酸(30.59g，263.71mmol)的甲苯溶液(60mL)于室温搅拌16小时。将反应液减压浓缩之后，溶解于二氯甲烷，利用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水进行洗涤后，将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压浓缩。将得到的残渣通过正相硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了中间体(S)-4-(2-(4，4-二氟哌啶-1-基)乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(10.9g，82％)。将得到的中间体(6g，13.14mmol)溶解于三氟乙酸(65ml)和二氯乙烷(65ml)，于室温加入三乙基硅烷(13.5g，116.1mmol)，于70度搅拌4小时。将当反应液恢复室温之后，减压浓缩而得到的残渣溶解于二氯甲烷。将有机层用水洗涤后，利用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压浓缩。将得到的残渣通过反相柱层析(0.5％盐酸水溶液/0.5％盐酸乙腈溶液)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(4，4-二氟哌啶-1-基)丁酸(化合物tm04，Fmoc-MeAbu(pip-4-F2)-OH)(4.0g，66％)。
LCMS(ESI)m/z＝459(M+H)+
保留时间：2.71分钟(分析条件SMD方法28)
1-苄基-3，3-二氟哌啶(化合物tm05)的合成
在氮气氛围中，向1-苄基哌啶-3-酮(60g，317.03mmol)的二氯甲烷溶液中在0度加入二甲基氨基三氟化硫磺(DAST)(150g，4.04mol)，搅拌2小时。之后，向反应液中加入300ml的饱和碳酸氢钠水溶液，利用乙酸乙酯进行3次萃取，将有机层合并而成物用饱和食盐水洗涤。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥之后，进行过滤，将得到的有机层减压浓缩，得到了粗产物1-苄基-3，3-二氟哌啶(化合物tm05)(31g，46％)。
LCMS(ESI)m/z＝212(M+H)+
保留时间：0.94分钟(分析条件SMD方法31)
(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)丁酸苄基酯(化合 物tm07，Cbz-MeAbu(pip-3-F2)-OBn)的合成
将得到的粗产物1-苄基-3，3-二氟哌啶(化合物tm05)溶解于200mL的甲醇，加入10％钯/碳(1g)，在氢气氛围中于室温搅拌48小时。将反应液过滤，将得到的滤液在减压浓缩，以粗产物形式得到了3，3-二氟哌啶(化合物tm06)(19g)。
向另外合成的(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸苄基酯(化合物tm08，Cbz-MeAsp(SEt)-OBn)(20g，48.13mmol)，3，3-二氟哌啶(化合物tm06)(8.26g，68.19mmol)，三乙基硅烷(40mL)，10％钯/碳(2.6g)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(20mL)中，在0度加入三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)(20.4g，204mmol)，于室温搅拌30分钟。将反应液过滤，减压浓缩，将得到的粗产物通过你正相硅胶柱层析法(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)丁酸苄基酯(化合物tm07，Cbz-MeAbu(pip-3-F2)-OBn)(11g，50％)。
LCMS(ESI)m/z＝461(M+H)+
保留时间：1.42分钟(分析条件SMD方法32)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)丁 酸(化合物tm10，Fmoc-MeAbu(pip-3-F2)-OH)的合成
将(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)丁酸苄基酯(化合物tm07，Cbz-MeAbu(pip-3-F2)-OBn)(20g，43.43mmol)溶解于33％溴化氢乙酸溶液中，于室温搅拌2小时之后，在50度进一步搅拌1小时。将反应溶液减压浓缩，将由此得到的残渣利用乙醚进行沉淀，以粗产物的形式得到了(2S)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)-2-(甲基氨基)丁酸的溴化物(化合物tm09)(29g)。
将上述粗产物(2S)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)-2-(甲基氨基)丁酸的溴化物(化合物tm09)(7.08g，29.97mmol)和N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(16g，47.48mmol)溶解于碳酸钾的水/1，4-二噁烷溶液＝1/1(300mL)中，于室温搅拌4小时。之后将反应液利用乙醚洗涤3次，利用盐酸将水层的pH调节至3，利用乙酸乙酯萃取两次。将得到的有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(10mmol碳酸氢铵水溶液/乙腈)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(3，3-二氟哌啶-1-基)丁酸(化合物tm10，Fmoc-MeAbu(pip-3-F2)-OH))(7.2g，71％)。
LCMS(ESI)m/z＝459(M+H)+
保留时间：1.61分钟(分析条件SMD方法5)
(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸(化合物tm13， Cbz-MeAsp(SEt)-OH)的合成
在氮气氛围中，将((苄氧基)羰基)-L-天冬氨酸(Cbz-Asp-OH)(200g，748.41mmol)和多聚甲醛(67.5g，749.35mmol)和对甲苯磺酸(7.74g，44.95mmol)的甲苯溶液(2000mL)升温至110度，搅拌3天。使反应液为室温之后，加入水，利用乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥后之后，过滤，减压浓缩，由此以粗产物形式得到了(S)-2-(3-((苄氧基)羰基)-5-氧代噁唑烷-4-基)乙酸(化合物tm11)(200g)。
向利用与上述同样的方法合成的(S)-2-(3-((苄氧基)羰基)-5-氧代噁唑烷-4-基)乙酸(化合物tm11)(265g，948.99mmol)的粗产物和乙烷硫醇(88.3g，1.42mol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(11.59g，95mmol)的二氯甲烷溶液中在0度加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(214g，1.04mol)，于室温搅拌5小时。将反应溶液过滤，得到的滤液用饱和食盐水洗涤，将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥后，过滤，减压浓缩。将得到的粗产物通过正相硅胶柱层析法(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-4-(2-(乙基硫基)-2-氧代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物tm12)(167g)的混合物。
向得到的(S)-4-(2-(乙基硫基)-2-氧代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸苄基酯(化合物tm12)(139g，1.20mol)的二氯甲烷(DCM)和三氟乙酸溶液(1500mL/1500mL)中加入三乙基硅烷(139g，1.2mol)，于室温搅拌3天。将反应液减压浓缩，向得到的残渣加入碳酸钾水溶液，用乙醚洗涤3次。将得到的水层用2N盐酸水溶液将pH调节至3，对其利用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，将有机层用无水硫酸钠干燥后之后，过滤，减压浓缩，得到了(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸(化合物tm13，Cbz-MeAsp(SEt)-OH)(75g)的粗产物。
LCMS(ESI)m/z＝326(M+H)+
保留时间：1.00分钟(分析条件SMD方法16)
(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸苄基酯(化合物 tm08，Cbz-MeAsp(SEt)-OBn)的合成
室温下，向(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸(化合物tm13，Cbz-MeAsp(SEt)-OH)(3g，9.22mmol)的粗产物和碳酸钾(1.9g，13.65mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(46mL)中加入苄基溴(1.73g，10.11mmol)，搅拌16小时之后过滤。将得到的滤液在减压浓缩，将得到的残渣通过正相硅胶柱层析法(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-2-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸苄基酯(化合物tm08，Cbz-MeAsp(SEt)-OBn)(1.5g)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.36-7.31(m，10H)，5.19-4.89(m，5H)，3.34-2.85(m，7H)，1.30-1.21(m，3H)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm17，Fmoc-Abu(Mor)-OH)的合成按照以下方案进行。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸叔丁酯 (化合物tm14，Fmoc-Asp(SEt)-OtBu)的合成
将(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧)-4-氧代丁酸(Fmoc-Asp-OtBu)(5g，12.15mmol)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(148mg，1.22mmol)及乙烷硫醇(EtSH)(1.13g，18.19mmol)溶解于二氯甲烷(DCM)(50mL)中，在冰冷却下加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(2.756g，1.337mmol)。于室温搅拌5小时之后，通过过滤除去固体。滤液用二氯甲烷(DCM)稀释之后，利用饱和食盐水进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥之后，过滤，减压浓缩。将得到的残渣通过正相柱层析(0～40％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm14，Fmoc-Asp(SEt)-OtBu)(3.9g，70％)。
LCMS(ESI)m/z＝478(M+Na)+
保留时间：3.13分钟(分析条件SMD方法14)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm15)的 合成
将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(乙基硫基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm14，Fmoc-Asp(SEt)-OtBu)(1g，2.20mmol)溶解于丙酮(4.4mL)中，加入Pd/C(wet，10％，44mg)。冰冷却下，加入三乙基硅烷(1.276g，10.97mmol)搅拌1小时。之后，通过过滤除去Pd/C，将滤液减压浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(0～60％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm15)(680mg，78％)。
LCMS(ESI)m/z＝418(M+Na)+
保留时间：2.07分钟(分析条件SMD方法40)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸叔丁酯(化合物tm16， Fmoc-Abu(Mor)-OtBu)的合成
将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯(化合物tm15)(1.6g，4.05mmol)及吗啉(387mg，4.44mmol)溶解于二氯乙烷(DCE)(8mL)中，于室温搅拌1小时。之后，在冰冷却下加入三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)(1.717g，8.10mmol)的二氯乙烷(DCE)(8mL)溶液，搅拌4小时。之后，将反应液利用二氯甲烷稀释，利用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，之后将有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤之后，减压浓缩。将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸叔丁酯(化合物tm16，Fmoc-Abu(Mor)-OtBu)(1.7g，98％)。
LCMS(ESI)m/z＝467(M+H)+
保留时间：2.02分钟(分析条件SMD方法41)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm17，Fmoc- Abu(Mor)-OH)的合成
将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸叔丁酯(化合物tm16，Fmoc-Abu(Mor)-OtBu)(9g，19.29mmol)溶解于三氟乙酸(TFA)/二氯乙烷(DCE)(25mL/25mL)中，在40度搅拌2小时。冷却至室温，之后将反应液利用二氯甲烷稀释，用水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥之后，过滤，减压浓缩，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm17，Fmoc-Abu(Mor)-OH)(7g，90％)。
LCMS(ESI)m/z＝411(M+H)+
保留时间：1.20分钟(分析条件SMD方法42)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm19，Fmoc-MeAbu(Mor)-OH)的合成按照以下方案进行。
(S)-4-(2-吗啉代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物tm18) 的合成
使(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm17，Fmoc-Abu(Mor)-OH)(600mg，1.46mmol)及多聚甲醛(131.4mg，1.46mmol)悬浮于甲苯(3mL)及三氟乙酸(TFA)(1.527g，13.16mmol)中，于室温搅拌16小时。之后，将反应液减压浓缩，将得到的残渣用二氯甲烷稀释，饱和碳酸氢钠水溶液，水，用饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥之后，过滤，将滤液减压浓缩，将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到了(S)-4-(2-吗啉代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物tm18)(486mg，79％)。
LCMS(ESI)m/z＝423(M+H)+
保留时间：1.14分钟(分析条件SMD方法40)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm19， Fmoc-MeAbu(Mor)-OH)的合成
将(S)-4-(2-吗啉代乙基)-5-氧代噁唑烷-3-羧酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物tm18)(486mg，1.15mmol)及三乙基硅烷(1.5mL，10.35mmol)溶解于三氟乙酸/二氯乙烷(1/1，12mL)中，在70度搅拌4小时。冷却至室温，之后将反应液减压浓缩而得到的残渣利用二氯甲烷稀释，用水洗涤后，将有机层利用无水硫酸钠进行干燥，过滤，之后将滤液减压浓缩。将得到的残渣通过反相柱层析(5～70％0.5％盐酸水溶液/0.5％盐酸乙腈溶液)纯化，得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)-4-吗啉代丁酸(化合物tm19，Fmoc-MeAbu(Mor)-OH)(400mg，82％)。
LCMS(ESI)m/z＝425(M+H)+
保留时间：1.40分钟(分析条件SMD方法34)
N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-吗啉代乙基)-L-丝氨酸(化合物tm20， Fmoc-Ser(Et-2-Mor)-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的(叔丁氧羰基)-L-丝氨酸(Boc-Ser-OH)(20g，97.46mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(100mL)中于室温加入氢化钠(7.718g，321.62mmol，60％油分散)，搅拌1小时。将反应液冷却至0度，滴加4-(2-氯乙基)吗啉(16.040g，107.21mmol)，于室温搅拌16小时。在反应液中在0度加入50％甲酸水溶液，进行过滤之后，得到的滤液通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，得到了N-(叔丁氧羰基)-O-(2-吗啉代乙基)-L-丝氨酸(Boc-Ser(Et-2-Mor)-OH)(5.6g，18％)。
在N-(叔丁氧羰基)-O-(2-吗啉代乙基)-L-丝氨酸(Boc-Ser(Et-2-Mor)-OH)(5.6g，17.59mmol)中于室温加入4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(28.0mL，921.53mmol)，搅拌1小时。在减压下蒸馏除去溶剂，将得到的残渣利用二氯甲烷洗涤后，加入水(10ml)制成溶液。向得到的溶液中加入碳酸钾调节至pH7，加入水(100mL)和1.4-二噁烷(150mL)之后，于室温加入碳酸钾(4.465g，32.07mmol)，N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(5.68g，16.84mmol)，搅拌16小时。将反应液用乙醚洗涤，使用浓盐酸将水层的pH调节为1，利用二氯甲烷萃取3次。将得到的有机层用水洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥，进行了过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(0.1％盐酸水溶液/0.1％盐酸乙腈溶液)纯化，得到了N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-O-(2-吗啉代乙基)-L-丝氨酸(化合物tm20，Fmoc-Ser(Et-2-Mor)-OH)的盐酸盐(3.2g，2个工序48％)。
LCMS(ESI)m/z＝441(M+H)+
保留时间：0.50分钟(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二 唑-3-基)丁酸(化合物tm21，Fmoc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的(叔丁氧羰基)-L-谷氨酰胺(Boc-Gln-OH)(50g，203.03mmol)的吡啶溶液(350mL)中于室温加入N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(46.1g，223.43mmol)，搅拌2小时。将反应液过滤，向通过将滤液浓缩而得到的残渣中同时加入二氯甲烷，浓盐酸而调整使得为pH＝3，利用二氯甲烷萃取2次。将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥，进行过滤之后，减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-氰基丁酸(45.5g，98％)。
如上所述得到的(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-氰基丁酸(50g，219.06mmol)的乙醇溶液(500mL)中于室温加入盐酸羟胺(32g，460.50mmol)和三乙胺(83mL)，在80度搅拌2小时。将反应液在减压下浓缩，由此以粗产物形式得到了(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(羟基氨基)-5-亚氨基戊酸(107g)。
在氮气氛围中，在上述粗产物(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(羟基氨基)-5-亚氨基戊酸(44g，168.40mmol)的1，4-二噁烷溶液(500mL)中于室温加入1，1’-羰基二咪唑(CDI)(39g，240.52mmol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)(55g，361.27mmol)，在110度搅拌4小时。将反应液于室温冷却之后，加入浓盐酸调整使得pH＝2，利用二氯甲烷萃取2次。将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，进行过滤之后，减压蒸馏除去溶剂，由此以粗产物形式得到了(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-(5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)丁酸(Boc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH)(11g)。
在氮气氛围中，向如上所述得到的(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-(5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)丁酸(Boc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH)(13.5g，46.99mmol)的1，4-二噁烷溶液(10mL)中于室温加入4N盐酸/1，4-二噁烷溶液(140mL)，搅拌16小时。将反应液在减压下浓缩，由此以粗产物形式得到了(S)-2-氨基-4-(5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)丁酸(H-Abu(5-Oxo-Odz)-OH)(8.8g)。
在氮气氛围中，向得到的粗产物(S)-2-氨基-4-(5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)丁酸(H-Abu(5-Oxo-Odz)-OH)(8.8g，47.02mmol)和碳酸钾(13g，94.06mmol)的水/1，4-二噁烷溶液(100mL/100mL)中于室温加入N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(14.3g，42.4mmol)，搅拌3小时。将反应液用叔丁基甲基醚/己烷(1/3)洗涤，使用浓盐酸将水层的pH调节为2，用二氯甲烷萃取2次。将得到的有机层利用无水硫酸钠进行干燥，进行了过滤。将滤液在减压下浓缩，将得到的残渣通过反相柱层析(水/乙腈)纯化，由此得到了(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)丁酸(化合物tm21，Fmoc-Abu(5-Oxo-Odz)-OH)(2.67g)。
LCMS(ESI)m/z＝410(M+H)+
保留时间：0.66分钟(分析条件SQDFA05)
N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-(甲基磺酰)-L-谷氨酰胺(化合物tm22， Fmoc-Gln(Ms)-OH)的合成
在氮气氛围中，在市售的(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu-OtBu)(20g，47mmol)，甲磺酰胺(20g，210mmol)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(1.3g，10.6mmol)的二氯甲烷溶液(360mL)中于室温加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(WSC·HCl)(9.64g，50.3mmol)，搅拌16小时。将反应液在减压下浓缩，加入乙酸乙酯，用0.1％盐酸水溶液洗涤3次，用水洗涤1次之后，利用无水硫酸钠进行干燥，进行了过滤。将得到的溶液减压浓缩，残渣通过正相柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，由此得到了叔丁基N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-(甲基磺酰)-L-谷氨酸酯(Fmoc-Gln(Ms)-OtBu)(9.3g，39％)。
在氮气氛围中，在如上所述进行得到的叔丁基N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-(甲基磺酰)-L-谷氨酸酯(Fmoc-Gln(Ms)-OtBu)(5.5g，10.9mmol)的2，2，2-三氟乙醇(TFE)溶液(100mL)中在0度加入三甲基氯硅烷(TMSCl)(3.57g，32.861mmol))，搅拌1小时。将反应液在减压下浓缩，向得到的残渣加入叔丁基甲基醚而再次浓缩。将该操作再重复2次，利用乙腈/二氯甲烷进行重结晶，由此以白色固体形式得到了N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N5-(甲基磺酰)-L-谷氨酰胺(化合物tm22，Fmoc-Gln(Ms)-OH)(3.8178g，77％)。
LCMS(ESI)m/z＝447(M+H)+
保留时间：0.65分钟(分析条件SQDFA05)
(参考例4)ClogP对膜透过性给予的影响
合成了具有Trp侧链的环状肽化合物、及不具有该侧链的环状肽化合物，通过改良方法进行了膜透过性试验。需要说明的是，由于MeTrp包含Trp侧链，因此，在具有Trp侧链的环状肽化合物中，也包括在构成氨基酸中包含MeTrp的环状肽化合物。其结果，不具有Trp侧链的环状肽化合物可能通过使ClogP升高而实现Papp≥1.0×10-6cm/秒(图1-1)。另一方面，如果具有1个以上的Trp侧链，则即使使ClogP升高，膜透过性也难以提高至Papp≥1.0×10- 6cm/秒(图1-2)。例如，虽然将改变了Trp侧链的位置，N烷基的模式的那些而处于1.06≤ClogP/总aa≤1.43的范围的环状肽化合物的序列示于表31中，但这些难以实现Papp≥1.0×10-6cm/秒的膜透过性。
从以上可知，对不具有Trp侧链的环状肽化合物的膜透过性进行评价时，确认通过使ClogP升高而提高了膜透过性(图1-1)，因此调节使得进行比较的2个肽的ClogP/总AA的值为±0.03之间。
[表31]
具有Trp侧链的环状肽化合物的膜透过性
将环状肽pd100～pd111的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表32]
(参考例5)具有Tyr(3-F)或Tyr的侧链的环状肽化合物的膜透过性测试
合成了具有Tyr(3-F)或Tyr的侧链的环状肽化合物，通过改良方法进行了膜透过性试验。其结果，具有Tyr(3-F)或Tyr侧链的环状肽化合物也与具有Trp侧链的侧链的环状肽化合物为相同倾向。虽然将处于1.06≤ClogP/总aa≤1.29的范围的环状肽化合物的序列示于表33，但与Trp的情况相同地，这些也难以实现Papp≥1.0×10-6cm/秒。
[表33]
具有Tyr(3-F)或Tyr侧链的环状肽化合物的膜透过性
将环状肽pd112～pd129的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表34]
(参考例6)环状肽中芳环数目(ARC)对膜透过性给予的影响
确认了随着ARC增加，存在环状肽化合物的Papp降低，即膜透过性降低的倾向(图2)。因此，将进行比较的2个肽的芳环数目(Aromatic Ring Count：ARC)凑齐。
需要说明的是，在本分析中，将在环状部的侧链具有稠环结构的那些，以及具有取代及未取代的羟苯基的环状肽化合物从分析对象中除外。在ARC＝3的情况下，在ClogP/总AA为0.88以上的序列中确认了Papp为1.0×10-6以上。另一方面，ARC＝4时，即使是与上述ARC＝3的化合物组为同程度的ClogP/总AA(0.88以上)的化合物，也几乎不存在Papp为1.0×10-6以上的情况。由此显示，尽管为同程度的脂溶性的序列组，将ARC＝3与ARC＝4进行比较时，ARC＝3者显示了良好的膜透过性(表35、表36、表37)。
另外，以pd198为例，对于表35，表36及表37的栏进行说明。pd198为包含12个残基的环状肽，以10个残基的氨基酸形成环。将环化部分定义为第1位的氨基酸，在pd198的情况下对应于Asp。将Asp相邻的构成环状部的氨基酸定义为第2位氨基酸(在pd198的情况下对应于Phe)，以下第3位，第4位到N末端同样迭代(在pd198的情况下成为第3位MeVal，第4位MeLeu，由于环状部包含10个残基，因此N末端为第10位g-MeAbu)。另外，以接近环化部的氨基酸的C末端的顺序依次用H-1，H-2，H-3表示。pd198的情况下，由于H-1为MePhe，H-2为Ala，因此Asp的C末端与MePhe结合，接着与Ala结合。另外，在C-term的栏中表示与C末端的氨基酸的羧酸部位缩合的官能团，pip表示哌啶，pyrro指吡咯烷(在pd198的情况下，C末端的氨基酸为H-2的Ala，其羧酸部位为与pip(哌啶)发生缩合的结构)。然后，在表35，表36及表37中显示了将N末端的氨基和环化部的氨基酸的侧链羧酸通过酰胺键环化而成的肽。例如，在pd198中，N末端g-MeAbu的氨基与环化部的Asp的侧链羧酸通过酰胺键环化。关于正文中记载的环状肽，在没有特别记载的情况下，全部以同样的方法表现。
[表35]
ARC＝3且Papp≥1.0×10-6的序列
[表36]
[表37]
ARC＝4且Papp＜1.0×10-6的序列
将上述记载的环状肽的结构示于以下。(需要说明的是，在环状肽的结构式中，为了使结构清晰明了，有时省略了与杂原子结合的氢原子)
[表38]
将参考例中对膜透过性进行了评价环状肽的分析信息示于以下。
[表39]
工业实用性
本发明可以提供改善肽的膜透过性的氨基酸，及包含该氨基酸的肽化合物。
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