一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基
阅读说明：本技术 一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基 (Culture medium for separating, purifying and amplifying culture of plateau microalgae ) 是由 布多 王金虎 李静 杨俊� 杜梅 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基,属于微藻生物技术领域,该培养基包括：Ca(NO-(3))-(2)·4H-(2)O、CaCl-(2)·2H-(2)O、NaNO-(3)、KNO-(3)、K-(2)HPO-(4)、MgSO-(4)·7H-(2)O、柠檬酸、柠檬酸铁铵、EDTA-2Na、Na-(2)CO-(3)、β-甘油磷酸钠、维生素B12、维生素H、维生素B1、痕量金属溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Na-(2)SiO-(3)·9H-(2)O和土壤提取液40-60mL/L；本发明采用先过滤后预培养,再稀释分离法,设备简单,操作简便,工作量小,尤其适用于从天然水域采取水样的初步分离。本发明具有针对性强、培养周期短、培养生物量大的特点,且不易受细菌干扰,取样操作简便。(The invention discloses a culture medium for separating, purifying and amplifying culture of plateau microalgae, belonging to the technical field of microalgae biology, and the culture medium comprises: ca (NO) 3 ) 2 ·4H 2 O、CaCl 2 ·2H 2 O、NaNO 3 、KNO 3 、K 2 HPO 4 、MgSO 4 ·7H 2 O, citric acid, ferric ammonium citrate, EDTA-2Na, Na 2 CO 3 Beta-sodium glycerophosphate, vitamin B12, vitamin H, vitamin B1, trace metal solution, 4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid and Na 2 SiO 3 ·9H 2 O and 40-60mL/L of soil extract; the invention adopts a method of filtering first, then pre-culturing and then diluting and separating, has simple equipment, simple and convenient operation and small workload, and is particularly suitable for the preliminary separation of the water sample collected from the natural water area. The invention has the characteristics of strong pertinence, short culture period and large culture biomass, andis not easy to be interfered by bacteria, and the sampling operation is simple and convenient.)
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，特别是涉及一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基。
背景技术
微藻是一类能进行光合作用的自养微生物，具有生长周期短、光合效率高、细胞代谢产物种类丰富等特点。同时，微藻细胞主要成分是多糖、蛋白质、色素和脂肪酸等有应用价值的活性物质。因此，微藻在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域都展现出很好的开发前景。微藻的纯种培养对研究海洋微藻的营养学、生理学及生物化学等方面是必不可少的，但在其培养过程中，微藻通常会受到其他微生物的污染，使得其生长速度和培养密度受到影响。无菌纯藻是深入开展藻类生理学和遗传学研究的基础,故而纯种培养和保存是其应用的基础和关键性环节，也是研究其生理、生化、营养价值、药理学、毒理学等必不可少的步骤。
目前，用于微藻分离的技术方法有以下几种：微细吸管(毛细管)分离法、水滴分离法、稀释分离法、琼脂平板法即固体培养基分离法。这些方法都存在一些不足：微细吸管(毛细管)分离法一般只适于分离个体较大的藻类，并对操作者要求有较高的技术熟练程度、需要足够的细心和耐心；水滴分离法操作简便，但比较适宜于分离预培养中出现的优势种类和受少量生物污染培养液中的藻类；稀释分离法操作简单易行，但有一定程度盲目性；水滴分离法和稀释法真正到达分离纯化的时间比较长。因此，采用目前这些技术方法，仍然有相当一部分微藻种质资源无法获得，许多优质藻种未能为人所知。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基，以解决上述现有技术存在的问题，该方法对于微藻的种类和大小没有限制，而且具有分离种类多、微藻生长速率快，不易被其他细菌污染的特点。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基，包括以下组分：
Ca(NO3)2·4H2O 0.1-0.2g/L，CaCl2·2H2O 4-8mg/L，NaNO3 1-2g/L，KNO3 0.05-0.15g/L，K2HPO4 0.03-0.05g/L，MgSO4·7H2O 44-52mg/L，柠檬酸6-10mg/L，柠檬酸铁铵6-10mg/L，EDTA-2Na 1-1.4mg/L，Na2CO3 0.01-0.03g/L，β-甘油磷酸钠20-30mg/L，维生素B120.05-0.15μg/L，维生素H 0.05-0.15μg/L，维生素B1 8-12μg/L，痕量金属溶液8-12mL/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.4-0.6g/L，Na2SiO3·9H2O 0.1-0.2g/L，土壤提取液40-60mL/L。
该培养基中含有N、P、CO3 2-、Si、Fe、Ca、Mg、微量元素和维生素等微藻生长所需要的营养成分，对微藻的正常生长尤其是细胞壁合成至关重要。
进一步地，所述培养基的pH为6.8-7.2。
进一步地，所述培养基的pH采用0.01mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液进行调节。
进一步地，所述痕量金属溶液，包括以下组分：
H3BO3 2.9g/L，MnCl2·4H2O 1.9g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.4g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.05g/L，ZnCl2·7H2O 0.005g/L，FeCl3·6H2O0.1g/L，CoCl2·6H2O 0.002g/L。
进一步地，所述土壤提取液的制备方法，包括以下步骤：
取未施过肥的土壤，加水混合，加热，冷却，沉淀，过滤，取上清液灭菌后，保存备用。
进一步地，还包括25-30g/L的营养琼脂培养基，以用于配制固态培养基。
所述营养琼脂培养基购于市场，其成分包含：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g。
本发明还提供一种上述的用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基在高原微藻分离、纯化和扩增中的应用。
本发明还提供一种高原微藻分离、纯化和扩增的方法，包括采用上述的培养基培养高原水样的步骤。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用先过滤后预培养，再稀释分离法，设备简单，操作简便，工作量小，尤其适用于从天然水域采取水样的初步分离，采用该培养基，可以加快微藻生长，菌类生长清洗，便于移取分离操作。
本发明具有针对性强、培养周期短、培养生物量大的特点，且不易受细菌干扰，取样操作简便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明分离纯化得到的高原的硅藻门的小环藻属照片；
图2为本发明分离纯化得到的高原的硅藻门的小环藻属照片；
图3为本发明的分离纯化的小环藻对数生长末期图片。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在以下实施例中，土壤提取液的制备方法，包括以下步骤：
取未施过肥的土壤200g置于三角瓶中，加1000mL蒸馏水混合，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3h，冷却，沉淀24h，此过程连续进行三次，然后过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后，于4℃冰箱中保存备用。
在本发明实施例中，所采用的土壤为采集自西藏大学的未施过肥的花园土壤，同时，发明人对多个地点的花园土壤进行了对比，证明各个地点的土壤效果相似，因此，本发明不对土壤提取液的土壤来源进行限定，只需为未进行过施肥的土壤即可。
对上述花园土壤的土壤提取液进行成分检测，发现其营养成分丰富，主要有常量矿物质和微量养分组成。常量矿物质主要有N、P、K、Ca、Mg、SO4 2-等，微量养分包括：Fe、Mn、Cu、Zn、B等元素，其中还有有一些痕量矿物质Co、Cr、Ga、Ge、Mo、Ni、Pb、Sn、V、W等。
在以下实施例中，痕量金属溶液，包括以下组分：
H3BO3 2.9g/L，MnCl2·4H2O 1.9g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.4g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.05g/L，ZnCl2·7H2O 0.005g/L，FeCl3·6H2O0.1g/L，CoCl2·6H2O 0.002g/L。
实施例1
一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基，包括以下组分：
Ca(NO3)2·4H2O 0.15g/L，CaCl2·2H2O 6mg/L，NaNO3 1.5g/L，KNO3 0.1g/L，K2HPO40.04g/L，MgSO4·7H2O 48mg/L，柠檬酸8mg/L，柠檬酸铁铵8mg/L，EDTA-2Na 1.2mg/L，Na2CO30.02g/L，β-甘油磷酸钠25mg/L，维生素B12 0.1μg/L，维生素H 0.1μg/L，维生素B1 10μg/L，痕量金属溶液10mL/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.5g/L，Na2SiO3·9H2O 0.15g/L，土壤提取液50mL/L。
采用0.01mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.0。
液体培养基配制方法：称取上述配比的药品，加入1000mL锥形瓶中，加水定容，振荡至完全溶解，利用1M HCl或NaOH调节pH至7.0，锥形瓶用橡胶塞盖住瓶口，然后在洁净工作台中用0.22μm的除菌膜过滤，过滤后备用。
固体培养基配制方法：将上述配制的液体培养基，加入营养琼脂培养基28g，用水浴锅加热至55℃，振荡至完全溶解。然后在洁净工作台中用0.22μm的除菌滤膜过滤，过滤后备用。待培养基冷却至38℃后，倒入无菌培养皿中，继续冷却得到固体培养基。
实施例2
一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基，包括以下组分：
Ca(NO3)2·4H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 4mg/L，NaNO3 2g/L，KNO3 0.05g/L，K2HPO40.05g/L，MgSO4·7H2O 44mg/L，柠檬酸10mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，EDTA-2Na 1.4mg/L，Na2CO3 0.01g/L，β-甘油磷酸钠30mg/L，维生素B12 0.05μg/L，维生素H 0.15μg/L，维生素B18μg/L，痕量金属溶液12mL/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.4g/L，Na2SiO3·9H2O 0.2g/L，土壤提取液40mL/L。
液体培养基配制方法：称取上述配比的药品，加入1000mL锥形瓶中，加水定容，振荡至完全溶解，利用1M HCl或NaOH调节pH至6.8，锥形瓶用橡胶塞盖住瓶口，然后在洁净工作台中用0.22μm的除菌膜过滤，过滤后备用。
固体培养基配制方法：将上述配制的液体培养基，加入营养琼脂培养基30g，用水浴锅加热至50℃，振荡至完全溶解。然后在洁净工作台中用0.22μm的除菌滤膜过滤，过滤后备用。待培养基冷却至40℃后，倒入无菌培养皿中，继续冷却得到固体培养基。
实施例3
一种用于高原微藻分离、纯化和扩增培养的培养基，包括以下组分：
Ca(NO3)2·4H2O 0.1g/L，CaCl2·2H2O 8mg/L，NaNO3 1g/L，KNO3 0.15g/L，K2HPO40.03g/L，MgSO4·7H2O 52mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵10mg/L，EDTA-2Na 1mg/L，Na2CO30.03g/L，β-甘油磷酸钠20mg/L，维生素B12 0.15μg/L，维生素H 0.05μg/L，维生素B1 12μg/L，痕量金属溶液8mL/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.6g/L，Na2SiO3·9H2O 0.1g/L，土壤提取液60mL/L。
液体培养基配制方法：称取上述配比的药品，加入1000mL锥形瓶中，加水定容，振荡至完全溶解，利用1M HCl或NaOH调节pH至7.2，锥形瓶用橡胶塞盖住瓶口，然后在洁净工作台中用0.22μm的除菌膜过滤，过滤后备用。
固体培养基配制方法：将上述配制的液体培养基，加入营养琼脂培养基25g，用水浴锅加热至60℃，振荡至完全溶解。然后在洁净工作台中用0.22μm的除菌滤膜过滤，过滤后备用。待培养基冷却至35℃后，倒入无菌培养皿中，继续冷却得到固体培养基。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，培养基组分中未加入土壤提取液。
试验例1高原微藻的分离、筛选与鉴定
分别采用实施例1和对比例1制备的培养基，样品先过滤、预培养后再稀释和平板涂布分离法。
(1)采用先过滤后预培养
在净化工作台开启的条件下，将采集到的水样依次倒入布氏漏斗，并在水环真空泵的抽滤下进行过滤，滤纸选用0.45μm水系滤膜。
总体积100L水样，分三次过滤，每次更换新的滤膜，更换下的滤膜投入到预先准备好的液体培养基中进行培养。分三次过滤可得到3组平行的培养液。水样桶中采回来的底泥不需要过滤，每组取约30g底泥单独放入液体培养基中进行培养，需要平行三组。锥形瓶的顶部使用透气封口膜进行密封，防止外界细菌进入。
在温度为25±1℃的光照培养箱中(光暗比12h：12h，光照强度2000Lx)，每天定时摇动3次，并将各个样品位置随机摆放，使之可以均匀受光。培养7-15天至整个溶液体系呈现黄绿色或者绿色后，再进行镜检和稀释分离藻株。
(2)预培养液稀释分离法和固体培养基涂布法分离得到生物量高的藻株的方法
将预培养的微藻培养液样品充分混匀，在超净工作台中，取混匀的样品0.5mL加入到含有4.5mL无菌水的试管中混匀，依次进行梯度稀释，稀释10～100倍，边稀释边在显微镜下镜检,直到视野中每滴样品只含1个细胞时,即停止稀释，开始分接培养。然后从相应浓度的试管中取200μL涂布于固体培养基上，放置在温度为25±1℃，2000Lx光照强度下进行光照。将分离纯化后的藻株接种于200mL液体培养基中，在2000Lx光照强度，25±1℃的光照培养箱中培养(光暗比12h：12h)，每日轻轻摇动三次，培养7-15天，发现试管中有藻色后进行镜检，如镜检到单种则表示分离成功，如图1和图2所示，图中为分离出的高原的硅藻门的小环藻属，此时已达到了分离、纯化的目的，可进行扩大培养。
试验结果如表1，由表1可以看出，未添加土壤提取液的对比例1培养周期增长，而且藻类出现生长缓慢，溶液中会出现白色的藻类固体，影响微藻的培养效果。
表1
试验例2微藻的实验室纯化培养
采用实施例2制备的固体培养基。
接种环蘸取藻液接种物(接种物的制备：取培养l0天左右的对数生长末期的新鲜藻液，经5000rpm离心5-10min，弃去上清，用培养液洗涤一次，再以培养液悬浮用于接种(实验操作在无菌条件下进行)，密密划线。
放置于25±1℃,2000Lx光照强度，光暗比12h：12h，光照培养箱中进行培养，培养周期为7-15天，在洁净工作台下用灭菌接种环移取培养皿中的单一藻落，然后在显微镜下镜检，如果呈现单一藻种，说明分离方法可靠，将分离纯化后的藻株接种于200mL液体培养基中，在2000Lx光照强度，25±1℃的光照培养箱中培养(光暗比12h：12h)，每日轻轻摇动三次，培养7-15天，发现试管中有藻色后进行镜检，如镜检到单种则表示分离成功。
试验例3实验室微藻扩大培养
采用实施例1制备的液体培养基。
(1)用灭菌的接种环挑取生长较好的微藻藻落放入装有lmL注射用水并灭菌过的离心管中，混合物用振荡器震荡。
(2)将吹打均匀的微藻移入装有50mL液体培养基中，25±1℃，光照2000Lx，培养20-30天，每日轻轻摇动三次，藻种生长状态好，生物量明显可见，再次转接。
(3)取50mL培养后的藻液加入到装有250mL液体培养基进行培养(按照1：5比例)，每日轻轻摇动三次。
(4)正常的培养条件：25±1℃，200r/min，3000Lx光照强度，光暗比12h：12h，培养周期为45天，然后通过紫外分光光度计检测微藻的特征吸收波长处对应的吸光度即光密度值是否达到0.7～0.8，如果未达到该吸光度数值，然后进行转接种，将藻液通过5000rpm，离心5～10min，将离心管底部的微藻取出合并后再放入离心前等量体积的液体培养基继续培养，培养周期为45天，一直到微藻达到生长末期生物量光密度值为0.7～0.8(微藻的特征吸收波长处对应的吸光度)，然后分离出微藻用于后续的其他实验用途。
试验例4微藻生物量扩增方案
开放式跑道池：有机玻璃材质，池高20cm，宽20cm，长40cm，培养液深5～10cm，搅拌速度300～500rpm，适宜的生物量范围是干重400～500mg/L，即藻液对数生长末期的光密度OD420为0.7～0.8，pH用碳酸氢钠来控制，但会出现钠离子增高的现象，可以通过通CO2的方式来解决。
在开放式跑道池中接种试验例1分离纯化得到的小环藻，培养45天后，然后通过紫外分光光度计检测OD420即光密度值是否达到0.7～0.8，如果未达到该吸光度数值，然后进行转接种，将藻液通过5000rpm，离心5～10min，将离心管底部的微藻取出合并后再放入离心前等量体积的液体培养基继续培养，培养周期为45天，一直到微藻达到生长末期生物量，如图3所示，其生物量0D420＝0.793。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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