阅读说明：本技术 用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法 (Magnetic-responsive exosome for peripheral nerve injury repair and preparation method thereof ) 是由 刘鐘阳 唐佩福 张阳 张里程 李建涛 刘建恒 李明 崔翔 邓俊豪 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于神经修复技术领域,本发明公开了一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及制备方法,其中,制备方法包括如下步骤：用脂肪间充质干细胞内吞磁性纳米微粒,然后通过梯度超速离心法提取磁性生物材料得到所述的磁力响应型外泌体。本发明的外泌体具有生物相容性好的优点。(The invention belongs to the technical field of nerve repair, and discloses a magnetic-responsive exosome for repairing peripheral nerve injury and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: and (2) endocytosing the magnetic nanoparticles by using adipose-derived mesenchymal stem cells, and then extracting the magnetic biomaterial by using a gradient ultracentrifugation method to obtain the magnetic response type exosome. The exosome has the advantage of good biocompatibility.)

用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法

技术领域

本发明涉及神经修复技术领域，具体涉及一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的

发明内容

，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

周围及中枢神经损伤发病率高、危害严重，患者常出现感觉和运动功能障碍、肢体功能性毁损、甚至终身残疾，其治疗是尚未解决的世界性难题。报道显示，全球每年约有1000万-1500万创伤患者，其中15％-40％为周围及中枢神经损伤患者，所占比例极高，美国每年治疗的费用高达150亿美元，平均费用约47000美元/人。国内约有2000万患者，治疗费用巨大，给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担。因此，探索其治疗新策略具有重要的临床意义和社会价值。细胞移植是神经损伤修复的有效方法。其中，雪旺细胞(Schwanncells，SCs)具有分泌多种神经营养因子、促髓鞘形成、改善神经再生微环境等多种促神经再生特性，一直是细胞移植的研究重点。然而，SCs经体外原代分离培养后，移植活性和迁移效能下降，不能在神经再生过程中高效精准释放神经营养因子、进行有效定向迁移与改善再生微环境，在很大程度上限制了其促神经再生功能的进一步发挥。因此，如何通过改善SC移植后活性，实现更好的神经损伤修复效果，是国内外研究的热点。

当前，改善SCs细胞细胞活性的方法包括添加活性因子、进行基因修饰、电刺激、磁场刺激等。其中，添加活性因子往往存在爆发性释放问题，且活性因子局部浓度往往高于生理浓度，难以避免产生副作用；基因修饰的SCs存在潜在的生物安全性问题；电刺激在体内无创条件下难以实现等问题。磁场刺激可以克服以上问题，促进神经营养因子分泌、活性蛋白合成、改善神经再生微环境。此外，目前一些单纯使用磁性纳米微粒(Magneticnanoparticles，MNPs)创造磁力微环境改善再生的方法，生物相容性不够好。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及制备方法具有生物相容性好的优点。

第一方面，本发明实施例提供了一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体的制备方法，包括如下步骤：用脂肪间充质干细胞内吞磁性纳米微粒，然后通过梯度超速离心法提取磁性生物材料得到所述的磁力响应型外泌体。

进一步的，包括如下步骤：

(1)原代提取和培养脂肪间充质干细胞；

(2)合成磁性纳米微粒：将浓度为0.01M硫酸加入到七水硫酸铁中，所述的硫酸与七水硫酸铁的体积质量比为：48.7vol:1wt，在氮气流充填下充分混合，制成硫酸亚铁硫酸溶液；硝酸钾与氢氧化钠按照质量比2.8:1混合得到混合物，然后将所述的混合物在氮气状态下溶于去离子水得到混合物溶液；将所述的硫酸亚铁硫酸溶液在持续搅拌下逐滴加入所述的混合物溶液；沉淀析出后，再通入氮气状态下将温度加热至85-95℃，持续24-36小时得到黑色沉淀物；冰浴法将所述的黑色沉淀产物冷却至室温；通过磁倾析分离所合成黑色产物，然后用去离子水冲洗数次以去除残留杂质得到所述的磁性纳米微粒；

(3)用多聚赖氨酸溶液浸泡所述的磁性纳米微粒20-24小时，实现磁性纳米微粒的表面修饰；

(4)将表面修饰后的磁性纳米微粒按照10μg/mL浓度磁转染入脂肪间充质干细胞，以无血清培养后采用梯度超速离心法提取上清液内外泌体得到所述的用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体。

第二方面，本发明提供了一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体，所述的用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体由上述的制备方法制备而得。

本发明实施例具有如下有益效果：

(1)制备的磁性外泌体具有外泌体的生物学功能，能够在神经再生中发挥生物活性；

(2)制备的磁性外泌体能够在外部磁场作用下进行靶向聚集，在靶区域进行富集，发挥功能，同时能够定向引导再生神经再生。

附图说明

图1为本发明用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法中MNPs的TEM图像；

图2为本发明用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法中ADSCs分泌的外泌体与含有MNPs的外泌体TEM图像；

图3为本发明用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法中一实施例外泌体应用实际效果图；

图4为本发明用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法中另一实施例外泌体应用实际效果图；

图5为本发明用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法中又一实施例外泌体应用实际效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体的制备方法，包括如下步骤：用脂肪间充质干细胞内吞磁性纳米微粒，然后通过梯度超速离心法提取磁性生物材料得到所述的磁力响应型外泌体。

进一步的，包括如下步骤：

(1)原代提取和培养脂肪间充质干细胞；

(2)合成磁性纳米微粒：将浓度为0.01M硫酸加入到七水硫酸铁中，所述的硫酸与七水硫酸铁的体积质量比为：48.7vol:1wt，在氮气流充填下充分混合，制成硫酸亚铁硫酸溶液；硝酸钾与氢氧化钠按照质量比2.8:1混合得到混合物，然后将所述的混合物在氮气状态下溶于去离子水得到混合物溶液；将所述的硫酸亚铁硫酸溶液在持续搅拌下逐滴加入所述的混合物溶液；沉淀析出后，再通入氮气状态下将温度加热至85-95℃，持续24-36小时得到黑色沉淀物；冰浴法将所述的黑色沉淀产物冷却至室温；通过磁倾析分离所合成黑色产物，然后用去离子水冲洗数次以去除残留杂质得到所述的磁性纳米微粒；

(3)用多聚赖氨酸溶液浸泡所述的磁性纳米微粒20-24小时，实现磁性纳米微粒的表面修饰；

(4)将表面修饰后的磁性纳米微粒按照10μg/mL浓度磁转染入脂肪间充质干细胞，以无血清培养后采用梯度超速离心法提取上清液内外泌体得到所述的用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体。

一种用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体，所述的用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体由上述的制备方法制备而得。

制备方法：用脂肪间充质干细胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)内吞MNPs，然后通过梯度超速离心法提取制备新型磁性生物材料--“磁力响应型外泌体(Magnetically responsive exosome，Mag-exo)”。

具体步骤：

(1)原代提取和培养ADSCs，即取3周龄SD大鼠2只，脱颈处死后剔除腹股沟处毛发，取腹股沟区域脂肪组织置于4℃无菌PBS溶液中，同样方法取第二只，仔细去除脂肪组织内血管、筋膜等杂质，眼科剪仔细剪碎脂肪组织后，消化、离心后原代培养。每2-3天全量换液，待细胞融合至85％-90％，进行传代，P3-P5代用于实验；

(2)合成MNPs。15mL，0.01M硫酸加入到0.308g七水硫酸铁中，在氮气流充填下充分混合，制成硫酸亚铁硫酸溶液。1.364g硝酸钾与0.486g氢氧化钠混合，然后将上述混合物在氮气状态下溶于去离子水。混合物全部溶解后，将制备好的硫酸亚铁硫酸溶液在持续搅拌下逐滴加入上述混合物。沉淀析出后，再通入氮气状态下将温度加热至90℃，持续24小时。最后，冰浴法将获得的黑色产物冷却至室温。通过磁倾析分离所合成黑色产物，然后用去离子水冲洗数次以去除残留杂质。

(3)用多聚赖氨酸(PLL)溶液浸泡20小时，实现MNPs的表面修饰，以利于磁转染。

(4)将MNPs按照10μg/mL浓度磁转染入ADSCs，培养后以无血清培养后采用梯度超速离心法提取上清液内外泌体，具体步骤如下：去血清培养采用梯度超速离心技术提取上清液内外泌体，将最佳浓度的MNPs作用后的ADSCs继续培养24小时，无菌0.01MPBS溶液洗涤细胞，去除未结合的MNPs，然后加入去血清新鲜培养基培养72小时。收集细胞上清液，每管40mL，4℃下进行梯度离心300g(10min，去除活细胞)、2000g(15min，去除死细胞)，10000g(30min，去除细胞碎片等)、120000g(120min，提取Mag-exo)。最后进行磁性分选，收集Mag-exo。利用TEM观察超微结构。并进行表征检测。

(5)将磁性外泌体注射到损伤的周围神经区域，有效促进周围神经再生。

图1为制备的磁性纳米微粒，TEM观察制备的纳米微粒大小相对一致，粒径分布较为均一。纳米微粒的平均粒径大小为13.87±6.44nm。

图2为制备的外泌体和磁性外泌体。TEM观察显示两组所得囊泡状物呈典型的外泌体杯状结构，Mag-exo内可见MNPs。

应用效果实例1

将磁性外泌体按照1×10⁹particles/mL浓度注射到坐骨神经挤压伤区域，术后4周通过免疫荧光染色观察神经再生，结果显示(图3)再生神经纤维成功长入。

应用效果实例2

将磁性外泌体按照1×10⁹particles/mL浓度与壳聚糖-胶原神经导管复合，移植修复坐骨神经10mm缺损，术后8周通过免疫荧光染色观察神经再生，结果显示(图4)再生神经纤维成功长入。

应用效果实例3

将磁性外泌体按照1×10⁹particles/mL浓度与PCL神经导管复合，移植修复坐骨神经10mm缺损，术后8周通过免疫荧光染色观察神经再生，结果显示(图5)再生神经纤维成功长入。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。