阅读说明：本技术 离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用 (Ion-modified protoporphyrin gallium compound and preparation method and application thereof ) 是由 张雷 朱迎男 张�浩 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于有机合成和药物领域,具体涉及一种离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用。离子修饰的原卟啉镓化合物具有以下结构：其中m为1,2或3；n为1,2或3；R1为乙基或乙烯基；R2为H,COO<Sup>-</Sup>或SO<Sup>3-</Sup>；M-X为Ga-Cl或者Ga-NO3；当原卟啉类化合物络合镓之后,除了具有原卟啉类光敏剂光动力抗菌的性能,同时又赋予化合物阻断铁代谢的抗菌机制,双管齐下,协同抗菌,有利于降低最小抑菌浓度,提高抗菌效率,增强对细菌的靶向性,克服细菌耐药性。(The invention belongs to the field of organic synthesis and medicines, and particularly relates to an ion-modified gallium protoporphyrin compound, and a preparation method and application thereof. The ion-modified gallium protoporphyrin compound has the following structure: wherein m is 1, 2 or 3; n is 1, 2 or 3; r1 is ethyl or vinyl; r2 is H, COO ‑ Or SO 3‑ (ii) a M-X is Ga-Cl or Ga-NO 3; after the protoporphyrin compound is complexed with gallium, the protoporphyrin photosensitizer has photodynamic antibacterial performance, and simultaneously endows the compound with an antibacterial mechanism for blocking iron metabolism, so that the compound can synergistically resist bacteria under double conditions, thereby being beneficial to reducing the minimum antibacterial concentration, improving the antibacterial efficiency, enhancing the targeting property of bacteria and overcoming the drug resistance of the bacteria.)

离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成和药物领域，具体涉及一种离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用。

背景技术

细菌感染已经成为威胁人类健康的重要问题之一。自1928年，弗莱明首次发现青霉素以来，抗生素在人类和致病菌的斗争中做出了巨大的贡献，挽救了无数人的生命。但是，由于长期以来人们对抗生素的滥用，导致了全球范围内多重耐药菌的出现，甚至出现了“超级细菌”。随着多黏菌素耐药菌的出现，抗生素构筑的“最后一道防线”也岌岌可危。我国是抗生素消费大国，也是细菌耐药最严重的国家之一。多重耐药菌的出现和潜在的爆发性流行趋势引起了世界各国的恐慌，许多国家都致力于寻求战胜多重耐药菌的新药物和新方法，而光动力抗菌疗法就是其中最具前景的方法之一。

光敏剂是光动力抗菌疗法成功的关键。理想的光敏剂，应具备高效低毒，抗菌谱广，活性氧产率高，不伤害正常细胞等特点。其中，卟啉化合物及其衍生物是一类天然来源的光敏剂，在生物体内广泛存在，具有良好的光谱特性和较高的单线态氧产量，其独特的结构赋予了其很好的生物相容性和无真核细胞毒性等优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种离子修饰的原卟啉镓化合物，其特征在于，具有以下结构：

其中m为1，2或3；n为1，2或3；R1为乙基或乙烯基；R2为H，COO^-或 SO^3-；M-X为Ga-Cl或者Ga-NO3。

本发明还包括一种所述的离子修饰的原卟啉镓化合物的制备方法合成路线如下：

其中m为1，2或3；n为1，2或3；R₁为乙基或乙烯基；R₂为H，COO^-或SO₃ ^-； M-X为Ga-Cl或者Ga-NO₃。

具体包括下述步骤：

1)将化合物C₁用有机溶剂溶解，-5～5℃下加入草酰氯，搅拌1～6h，真空蒸发得到化合物C₂；

2)将化合物C₂用有机溶剂溶解，-5～5℃下加入化合物C₆，搅拌6～12h，真空蒸发，固体加水搅拌6～12h，抽滤，干燥，得到化合物C₃；

3)将化合物C₃用有机溶剂溶解，25～60℃下加入化合物C₇，搅拌6～12h，抽滤，有机溶剂淋洗，干燥，得到化合物C₄；

4)将化合物C₄用N，N-二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜溶解，100～160℃下加入化合物C₈，搅拌12～24h，透析，冷冻干燥，得到化合物C₅；

5.根据权利要求4所述的离子修饰的原卟啉镓化合物的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或丙酮。

步骤1)中所述的化合物C1和草酰氯的摩尔比为1:1～2；步骤2)中所述的化合物C2和C6的摩尔比为1:1～1.5；步骤3)中所述的化合物C3和C7的摩尔比为1:1～1.5；步骤4)中所述的化合物C4和C8的摩尔比为1:1～1.5。

本发明还包括一种所述的离子修饰的原卟啉镓化合物的应用，作为抗菌剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

当原卟啉类化合物络合镓之后，除了具有原卟啉类光敏剂光动力抗菌的性能，同时又赋予化合物阻断铁代谢的抗菌机制，双管齐下，协同抗菌，有利于降低最小抑菌浓度，提高抗菌效率，增强对细菌的靶向性，克服细菌耐药性。

本发明以生物体内大量存在的原卟啉或Meso-原卟啉为原料，选择原卟啉上的两个羧基为修饰基团，与带有叔胺和伯胺的基团进行酰胺化反应，再进行阳离子或两性离子修饰，然后和镓盐络合后，则得到了一系列新型原卟啉镓类光敏剂。

本发明制备的离子修饰原卟啉镓化合物，合成操作简单，产品纯度高，有较好的光热稳定性；能很好的溶解于去离子水和生理盐水中，避免了光敏剂在生理条件下的团聚光猝灭，有较高的活性氧产生量；将原卟啉和镓结合起来，利用光动力—铁阻断协同抗菌的机理，在光照和黑暗条件下都能高效的杀灭细菌；阳离子修饰的原卟啉镓，利用季铵基团上的正电荷和细菌表面的负电荷静电吸附的机理，进一步促进了光敏剂对细菌的杀灭作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中CMP-Ga的合成路线。

图2为本发明实施例1中CMP的核磁共振氢谱图。

图3为本发明实施例1中CMP的高分辨质谱图。

图4为本发明实施例1中CMP-Ga在络合过程的紫外-可见光分析图。

图5为本发明实施例2中ZMP-Ga的合成路线。

图6为本发明实施例2中ZMP的核磁共振氢谱图。

图7为本发明实施例2中ZMP的高分辨质谱图。

图8为本发明实施例2中ZMP-Ga在络合过程的紫外-可见光分析图。

图9为本发明实施例3中SMP-Ga的合成路线。

图10为本发明实施例4中CMP-Ga在光照条件下的抗菌效果图。

图11为本发明实施例4中CMP-Ga在黑暗条件下的抗菌效果图。

图12为本发明实施例5中ZMP-Ga在光照条件下的抗菌效果图。

图13为本发明实施例5中ZMP-Ga在黑暗条件下的抗菌效果图。

图14为本发明实施例6中SMP-Ga在光照条件下的抗菌效果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：镓(Ⅲ)二甲基-8，13-二乙烯基-3，7，12，17-四甲基-21H， 23H-卟啉-2，18-双[-N，N，N-三甲基-2-(丙酰铵)](CMP-Ga)的制备

合成路线见图1。

称取100.0mg的原卟啉到反应瓶中，加入200mL的二氯甲烷，搅拌溶解，降温至-5℃，缓慢滴加22.6mg的草酰氯，搅拌1h，旋转蒸发掉溶剂和多余的草酰氯；重新加入200mL的二氯甲烷，搅拌溶解，降温至-5℃，缓慢滴加15.7mg的 N，N-二甲基乙二胺，搅拌6h，旋转蒸发掉溶剂，加入400mL的去离子水，搅拌 6h，过滤，用去离子水淋洗，滤饼60℃真空干燥；所得滤饼用200mL的二氯甲烷溶解，室温缓慢滴加25.2mg的碘甲烷，25℃反应6h，过滤，用二氯甲烷淋洗，滤饼40℃真空干燥得到阳离子修饰的原卟啉(CMP，表征图谱见图2-3)；阳离子修饰的原卟啉用200mL的超干N,N-二甲基甲酰胺溶解，抽排三次以上，加入 31.3mg的三氯化镓，120℃反应12h，反应体系降至室温，用500Da的透析袋透析，冷冻干燥，得到红褐色的阳离子修饰的原卟啉镓化合物(表征图谱见图4)。

实施例2：镓(Ⅲ)二甲基-8，13-二乙烯基-3，7，12，17-四甲基-21H， 23H-卟啉-2，18-双[-N-(羧甲基)-N，N-二甲基-2-(丙酰基铵)]，内盐(ZMP-Ga) 的制备:合成路线见图5。

称取100mg的原卟啉到反应瓶中，加入200mL的四氢呋喃，搅拌溶解，降温至5℃，缓慢滴加45.1mg的草酰氯，搅拌6h，旋转蒸发掉溶剂和多余的草酰氯；重新加入200mL的四氢呋喃，搅拌溶解，降温至5℃，缓慢滴加23.5mL的 N，N-二甲基乙二胺，搅拌12h，旋转蒸发掉溶剂，加入400mL的去离子水，搅拌6h，过滤，用去离子水淋洗，滤饼60℃真空干燥；所得滤饼用200mL的四氢呋喃溶解，室温缓慢滴加37.0mg的溴乙酸，60℃反应12h，过滤，用四氢呋喃淋洗，滤饼40℃真空干燥得到两性离子修饰的原卟啉(ZMP,表征图谱见图6-7)。两性离子修饰的原卟啉用200mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，抽排三次以上，加入46.9mg的氯化镓，160℃反应24h，反应体系降至室温，用500Da的透析袋透析，冷冻干燥，得到红褐色的两性离子修饰的原卟啉镓化合物(表征图谱见图8)。

实施例3：镓(Ⅲ)二甲基-8，13-二乙基-3，7，12，17-四甲基-21H，23H- 卟啉-2，18-双[-N-(磺丙基)-N，N-二甲基-2-(丁酰基铵)]，内盐(SMP-Ga) 的制备：合成路线见图9。

称取100mg的Meso-原卟啉到反应瓶中，加入200mL的丙酮，搅拌溶解，降温至0℃，缓慢滴加33.6mg的草酰氯，搅拌3h，旋转蒸发掉溶剂和多余的草酰氯；重新加入200mL的丙酮，搅拌溶解，降温至0℃，缓慢滴加21.6mL的N， N-二甲基丙二胺，搅拌8h，旋转蒸发掉溶剂，加入400mL的去离子水，搅拌6h，过滤，用去离子水淋洗，滤饼60℃真空干燥；所得滤饼用200mL的丙酮溶解，室温缓慢滴加42.8mg的3-溴-1-丙磺酸，40℃反应8h，过滤，用丙酮淋洗，滤饼40℃真空干燥得到两性离子修饰的Meso-原卟啉。两性离子修饰的Meso-原卟啉用200mL的超干二甲基亚砜溶解，抽排三次以上，加入54.2mg的硝酸镓，130℃反应18h，反应体系降至室温，用500Da的透析袋透析，冷冻干燥，得到红褐色的两性离子修饰的Meso-原卟啉镓化合物(SMP-Ga)。

实施例4：实施例1所得的CMP-Ga的光动力和铁阻断抗菌评价

(1)实验菌株：革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(E.coli)。

(2)实验方法：

菌悬液配制：在超净台中，取冻存的标准菌种恢复常温后，在LB固体培养基平板上划线，37℃培养18h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，在220rpm 的摇床上37℃培养18h，再将此菌液稀释成1×10⁵CFU/mL备用。

药液配置：在超净台中，取本发明实施例1中制备的CMP-Ga，溶于生理盐水中，配置成20μM的CMP-Ga标准溶液，用0.22μm的微滤膜除菌备用。

光动力抗菌测试：在超净台中，向48孔板中的每个孔中加入450μL的1× 10⁵CFU/mL的菌液，再向每个孔中依次加入50μL的抗菌剂标准溶液，同时设置加入50μL生理盐水的孔作为空白对照组。每个孔用405nm波长的汞灯光照射 10s，然后用生理盐水稀释100倍，取100μL涂LB培养基，在37℃的黑暗培养箱中培养12h，菌落计数观察。每个浓度的样品设三组平行试验，每组试验重复三次。

铁阻断抗菌测试：在超净台中，向48孔板中的每个孔中加入450μL的1× 10⁵CFU/mL的菌液，再向每个孔中依次加入50μL的抗菌剂标准溶液，同时设置加入50μL生理盐水的孔作为空白对照组。在37℃的黑暗培养箱中培养12h，然后用生理盐水稀释100倍，取100μL涂LB培养基，在37℃的黑暗培养箱中培养12h，菌落计数观察。每个浓度的样品设三组平行试验，每组试验重复三次。

(3)实验结果

光动力抗菌结果见图10。

图10中的体外光动力抗菌结果说明：本发明实施例1中的CMP-Ga在光照时间(10s)极短的条件下就能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有很好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好，以2.0μM的浓度就能杀死几乎全部的金黄色葡萄球菌和80％以上的大肠杆菌。可见阳离子修饰的原卟啉镓有作为光动力抗菌光敏剂的巨大潜力。

铁阻断抗菌结果见图11。

图11中的铁阻断抗菌结果说明：本发明实施例1中的CMP-Ga即使在无光照的黑暗条件下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也有很好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好，以2.0μM的浓度就能杀死约95％的金黄色葡萄球菌和80％以上的大肠杆菌。可见阳离子修饰的原卟啉镓不仅有作为光动力抗菌光敏剂的巨大潜力，而且也是铁阻断抗菌剂的优异候选者，将光动力抗菌和铁阻断抗菌协同发挥作用，可能会有更好的抗菌效果。

实施例5：实施例2所得的ZMP-Ga的光动力和铁阻断抗菌评价

(1)实验菌株

革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌 (E.coli)。

(2)实验方法

菌悬液配制：在超净台中，取冻存的标准菌种恢复常温后，在LB固体培养基平板上划线，37℃培养18h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，在220rpm 的摇床上37℃培养18h，再将此菌液稀释成1×10⁵CFU/mL备用。

药液配置：在超净台中，取本发明实施例2中制备的ZMP-Ga，溶于生理盐水中，配置成20μM的ZMP-Ga标准溶液，用0.22μm的微滤膜除菌备用。

光动力抗菌测试：在超净台中，向48孔板中的每个孔中加入450μL的1× 10⁵CFU/mL的菌液，再向每个孔中依次加入50μL的梯度稀释好的抗菌剂标准溶液，同时设置加入50μL生理盐水的孔作为空白对照组。每个孔用405nm波长的汞灯光照射10s，然后用生理盐水稀释100倍，取100μL涂LB培养基，在 37℃的黑暗培养箱中培养12h，菌落计数观察。每个浓度的样品设三组平行试验，每组试验重复三次。

铁阻断抗菌测试：在超净台中，向48孔板中的每个孔中加入450μL的1× 10⁵CFU/mL的菌液，再向每个孔中依次加入50μL的梯度稀释好的抗菌剂标准溶液，同时设置加入50μL生理盐水的孔作为空白对照组。在37℃的黑暗培养箱中培养12h，然后用生理盐水稀释100倍，取100μL涂LB培养基，在37℃的黑暗培养箱中培养12h，菌落计数观察。每个浓度的样品设三组平行试验，每组试验重复三次。

(3)实验结果

体外光动力抗菌结果见图12。

图12中的体外光动力抗菌结果说明：本发明实施例2中的ZMP-Ga在光照时间(10s)极短的条件下就能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有很好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好，以2.0μM的浓度就能杀死95％以上的金黄色葡萄球菌。可见两性离子修饰的原卟啉镓有作为光动力抗菌光敏剂的巨大潜力。

铁阻断抗菌结果见图13。

图13中的铁阻断抗菌结果说明：本发明实施例2中的ZMP-Ga即使在无光照的黑暗条件下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也有很好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好，以2.0μM的浓度就能杀死约95％的金黄色葡萄球菌。可见阳离子修饰的原卟啉镓不仅有作为光动力抗菌光敏剂的巨大潜力，而且也是铁阻断抗菌剂的优异候选者，将光动力抗菌和铁阻断抗菌协同发挥作用，可能会有更好的抗菌效果。

实施例6：实施例3所得的SMP-Ga的光动力和铁阻断抗菌评价:

(1)实验菌株

革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌 (E.coli)。

(2)实验方法

菌悬液配制：在超净台中，取冻存的标准菌种恢复常温后，在LB固体培养基平板上划线，37℃培养18h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，在220rpm 的摇床上37℃培养18h，再将此菌液稀释成1×10⁵CFU/mL备用。

药液配置：在超净台中，取本发明实施例3中制备的SMP-Ga，溶于生理盐水中，配置成20μM的SMP-Ga标准溶液，用0.22μm的微滤膜除菌备用。

光动力抗菌测试：在超净台中，向48孔板中的每个孔中加入450μL的1× 10⁵CFU/mL的菌液，再向每个孔中依次加入50μL的梯度稀释好的抗菌剂标准溶液，同时设置加入50μL生理盐水的孔作为空白对照组。每个孔用405nm波长的汞灯光照射10s，然后用生理盐水稀释100倍，取100μL涂LB培养基，在 37℃的黑暗培养箱中培养12h，菌落计数观察。每个浓度的样品设三组平行试验，每组试验重复三次。

铁阻断抗菌测试：在超净台中，向48孔板中的每个孔中加入450μL的1×10⁵CFU/mL的菌液，再向每个孔中依次加入50μL的梯度稀释好的抗菌剂标准溶液，同时设置加入50μL生理盐水的孔作为空白对照组。在37℃的黑暗培养箱中培养12h，然后用生理盐水稀释100倍，取100μL涂LB培养基，在37℃的黑暗培养箱中培养12h，菌落计数观察。每个浓度的样品设三组平行试验，每组试验重复三次。

(3)实验结果

体外光动力抗菌结果见图14。

图14中的体外光动力抗菌结果说明：本发明实施例3中的SMP-Ga在光照时间(10s)极短的条件下就能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有很好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好，以2.0μM的浓度就能杀死几乎全部的金黄色葡萄球菌和70％以上的大肠杆菌。可见两性离子修饰的Meso-原卟啉镓有作为光动力抗菌光敏剂的巨大潜力。

铁阻断抗菌结果说明：本发明实施例3中的SMP-Ga即使在无光照的黑暗条件下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也有很好的抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好，以2.0μM的浓度就能杀死约95％的金黄色葡萄球菌。可见两性离子修饰的Meso-原卟啉镓不仅有作为光动力抗菌光敏剂的巨大潜力，而且也是铁阻断抗菌剂的优异候选者，将光动力抗菌和铁阻断抗菌协同发挥作用，可能会有更好的抗菌效果。

此外，光动力抗菌和铁阻断抗菌的机理决定了本发明中的离子修饰原卟啉镓对耐药菌有广谱的抗菌活性，且细菌很难对其产生耐药性。本发明中的离子修饰的原卟啉镓有很好的水溶性，有作为体内注射用抗菌剂的巨大潜力。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。