阅读说明：本技术 一种结核分枝杆菌特异性t细胞表位肽及其应用 (Mycobacterium tuberculosis specific T cell epitope peptide and application thereof ) 是由 张万江 刘静 陈雪峰 张舜文 王菊 吴芳 吴江东 张�杰 董江涛 柳小玲 梁粟 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位多肽及应用,公开了表位肽P<Sub>39</Sub>的氨基酸序列为LQGQWRGAAGTAAQA,分子量为1485.63。本发明筛选出的表位肽P<Sub>39</Sub>与HLA分子之间具有高亲和力,该表位产生了较强抗原特异性的外周血单个核细胞增殖,同时该表位肽P<Sub>39</Sub>的敏感性为75％,特异性为67.71％,AUC值为0.8435,具有较好的临床诊断价值。表位肽P<Sub>39</Sub>未见文献报道及研究,本发明的优点在于首次报道了表位肽P<Sub>39</Sub>用于结核病的血清学诊断,具有较高的敏感性和特异性。本发明表位肽P<Sub>39</Sub>的确定,可应用于T细胞表位肽疫苗的制备,为结核病特异诊断试剂和新型结核病表位疫苗的研发提供了潜在的候选表位多肽,在结核病特异性免疫预防和治疗领域中有着良好的开发应用前景。(The invention relates to a mycobacterium tuberculosis specific T cell epitope polypeptide and application thereof, and discloses an epitope peptide P 39 Has the amino acid sequence of LQGQWRGAAGTAAQA and the molecular weight of 1485.63. Epitope peptide P screened by the invention 39 Has high affinity with HLA molecules, and the epitope generates peripheral blood mononuclear cell proliferation with strong antigen specificity, and the epitope peptide P 39 The sensitivity is 75%, the specificity is 67.71%, the AUC value is 0.8435, and the clinical diagnosis value is better. Epitope peptide P 39 No literature report and research is found, and the invention has the advantages that the epitope peptide P is reported for the first time 39 It is used for serological diagnosis of tuberculosis, and has high sensitivity and specificity. Epitope peptide P of the invention 39 Can be applied to the preparation of T cell epitope peptide vaccines, namely knotsThe research and development of the specific diagnostic reagent for the tuberculosis and the novel tuberculosis epitope vaccine provide potential candidate epitope polypeptides, and have good development and application prospects in the field of tuberculosis specific immunity prevention and treatment.)

一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位肽及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位肽及其应用，具体是涉及一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位制备方法及其在结核病诊断中的应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，全球每年新发结核病患者人数约有800万，死亡人数超过200万，是全球重要的卫生问题。面对如此高的发病率及死亡率，传统的卡介苗已经不能满足人类预防结核病的需求，各国研究人员均在不断努力开发新型结核病疫苗，但到目前为止仍没有一种疫苗可以成功替代卡介苗而广泛应用于临床预防。结核病感染的快速诊断方法、适合中国人群的结核病疫苗和治疗药物对目前结核病的防控起着至关重要的作用，可以对结核病进行及时且正确的治疗；新的结核感染诊断方法及疫苗药物研发刻不容缓。

基于传统细菌学和免疫学的结核病诊断技术已经无法适应当前疾病流行形势，尤其是在结核病感染人数多、感染规模大的结核病流行态势下，快速准确的诊断方法是控制疾病流行蔓延的关键手段，也是进行抗结核治疗的重要前提与基础。酶联免疫吸附试验（ELISA）因具有快速、简便、高灵敏度等优点，且该技术所需设备简单、操作容易、一次可检测多个样品，现已成为部分抗体检测的首选方法。对现有商品化试剂盒的meta分析表明，在结核病的诊断中，现有的商品化血清学检测方法均未达到理想的诊断效果。

培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)是血清学检测活动性结核的标志物，为目前诊断结核病领域研究范围最广、最重要的抗原，它是从结核分枝杆菌短期培养的滤液中分离的一种低分子质量蛋白质, 含100个氨基酸。CFP10为一种有效的T细胞抗原, 能刺激机体产生特异性细胞免疫应答, 可以诱发PPD皮肤试验阳性者的外周血单个核细胞出现增殖反应和产生IFN-γ, 而IFN-γ能显著活化巨噬细胞, 提高巨噬细胞对胞内结核菌的生长抑制作用和杀伤能力。抗原表位是免疫原抗原性的物质基础，开展对抗原表位的研究将对抗原的诊断以及分子疫苗的设计等具有重要的意义，表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了表位肽以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。目前已知的结核菌表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用，而CFP10蛋白存在多个T细胞表位多肽，其多肽混合物中的每一个多肽都具有广泛的识别类型，这在疫苗的设计中具有重要意义, 有效的疫苗应该含有多个抗原决定簇, 而且可以被不同遗传背景的人群所识别。

尽管CFP10被研究人员公认为是新型结核免疫诊断试剂的候选抗原，但其本身在其他分枝杆菌菌株中可能不存在，编码蛋白大分子的基因可能含有一些有限的区段（可能具有B或T细胞表位），其可能与缺失区域外的基因同源，这可能导致免疫反应水平的交叉反应，从而可能使实验结果的特异性受损，因此，临床上需要使用蛋白来源多肽混合物或其截短形式来代替蛋白大分子作为可用的诊断试剂。考虑到不同结核病患者的抗体反应不同，因此有必要设计具有高灵敏度和特异性的结核病血清学诊断试剂的多种表位多肽组合的混合抗原，考虑结合使用多种表位多肽以改善提高其抗原性，这项研究的结果为开发高灵敏度和特异性的TB检测组合表位肽提供了基础。因此鉴定CFP10 蛋白T细胞表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。

基于传统细菌学和免疫学的结核病诊断技术已经无法适应当前疾病流行形势，尤其是在结核病感染人数多、感染规模大的结核病流行态势下，快速准确的诊断方法是控制疾病流行蔓延的关键手段，也是进行抗结核治疗的重要前提与基础。酶联免疫吸附试验（ELISA）因具有快速、简便、高灵敏度等优点，且该技术所需设备简单、操作容易、一次可检测多个样品，现已成为部分抗体检测的首选方法。对现有商品化试剂盒的meta分析表明，在结核病的诊断中，现有的商品化血清学检测方法均未达到理想的诊断效果。

培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)是血清学检测活动性结核的标志物，为目前诊断结核病领域研究范围最广、最重要的抗原，它是从结核分枝杆菌短期培养的滤液中分离的一种低分子质量蛋白质, 含100个氨基酸。CFP10为一种有效的T细胞抗原, 能刺激机体产生特异性细胞免疫应答, 可以诱发PPD皮肤试验阳性者的外周血单个核细胞出现增殖反应和产生IFN-γ, 而IFN-γ能显著活化巨噬细胞, 提高巨噬细胞对胞内结核菌的生长抑制作用和杀伤能力。抗原表位是免疫原抗原性的物质基础，开展对抗原表位的研究将对抗原的诊断以及分子疫苗的设计等具有重要的意义，表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了表位肽以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。目前已知的结核菌表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用，而CFP10蛋白存在多个T细胞表位多肽，其多肽混合物中的每一个多肽都具有广泛的识别类型，这在疫苗的设计中具有重要意义, 有效的疫苗应该含有多个抗原决定簇, 而且可以被不同遗传背景的人群所识别。

尽管CFP10被研究人员公认为是新型结核免疫诊断试剂的候选抗原，但其本身在其他分枝杆菌菌株中可能不存在，编码蛋白大分子的基因可能含有一些有限的区段（可能具有B或T细胞表位），其可能与缺失区域外的基因同源，这可能导致免疫反应水平的交叉反应，从而可能使实验结果的特异性受损，因此，临床上需要使用蛋白来源多肽混合物或其截短形式来代替蛋白大分子作为可用的诊断试剂。考虑到不同结核病患者的抗体反应不同，因此有必要设计具有高灵敏度和特异性的结核病血清学诊断试剂的多种表位多肽组合的混合抗原，考虑结合使用多种表位多肽以改善提高其抗原性，这项研究的结果为开发高灵敏度和特异性的TB检测组合表位肽提供了基础。因此鉴定CFP10 蛋白T细胞表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的一是提供一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位多肽（命名为：表位肽P₃₉），将其应用于结核病的诊断及临床免疫学检测，所述T细胞表位多肽的灵敏度和特异度高，具有良好的临床诊断价值。

本发明的目的二在于提供表位肽P₃₉在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。

本发明的目的三在于提供该表位肽P₃₉的氨基酸序列：LQGQWRGAAGTAAQA（SEQ IDNO:1）。

本发明的目的四在于提供了一种结核病血清学诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，所述试剂盒中含有表位肽P₃₉。

本发明还提供表位肽P₃₉作为生物标记物用于结核血清学诊断的具体方法，其具体步骤为：

(1)包被：表位肽P₃₉分别溶解于包被缓冲液中(10ug/ml)；以100ul/孔加入96孔酶标板中，4℃过夜；

(2)洗板：PBST洗涤液300ul/孔，2min，洗3次；

(3)封闭：封闭液，300ul/孔，4℃过夜；

(4)洗板：洗涤液300ul/孔，2min，洗3次；

(5)加血清：按1:500稀释后的待测血清，100ul/孔，4℃过夜；

(6)洗板：洗涤液300ul/孔，3min，洗5次；

(7)加酶标二抗：加入新鲜稀释的IgG酶标抗体(1:40000)100ul/孔，室温条件下孵育4℃过夜；

(8)洗板：洗涤液300ul/孔，2min，洗5次；

(9)显色：新鲜配置的TMB显色液，100ul/孔，室温避光孵育15min；

(10)终止：终止液50ul/孔；

(11)测定：酶标仪调至450nm，以第一个空白对照孔调零后测各孔OD值。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明所述的一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位肽P₃₉，该表位肽P₃₉的氨基酸序列：LQGQWRGAAGTAAQA（SEQ ID NO:1），分子量为1485.63；

首先利用生物信息学方法预测CFP10抗原蛋白特异T细胞表位，通过分析表位预测结果和蛋白质二级结构确定符合条件的表位肽P₃₉序列，并合成表位多肽。借助CCK8细胞增殖实验对表位肽P₃₉进行检测，观察表位肽P₃₉刺激外周血淋巴细胞的增殖能力水平。建立间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)，通过棋盘滴定法确定表位肽P₃₉的最佳包被浓度、血清稀释度及二抗最佳稀释比例，检测健康人及结核病患者血清中IgG 抗体的水平，初步研究P₃₉免疫后血清的特异性抗体效价，并计算表位肽P₃₉在结核病诊断中的敏感性和特异性，通过绘制ROC 曲线与计算曲线下面积（AUC）评价表位肽P₃₉在检测IgG抗体的诊断能效与价值，对表位肽P₃₉进行血清学评价，为结核病的血清学诊断奠定基础。

本发明的有益效果：

本发明提供了能活化外周血单个核细胞、诱导其增殖的结核分枝杆菌特异性T细胞表位肽P₃₉，表位肽P₃₉产生了较强的抗原特异性，为免疫治疗提供了新的靶点。本发明综合利用生物信息学、免疫信息学的技术手段，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽P₃₉，其中筛选出的表位肽P₃₉与HLA分子之间具有高亲和力。本发明的优点在于利用结核杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核的治疗性活性肽，且表位肽P₃₉是未被研究报道过的新的HLA限制性结核分枝杆菌表位肽，该表位肽P₃₉能活化外周血单个核细胞、诱导其增殖，产生了较强的抗原特异性，为免疫治疗提供了新的靶点。本发明提供的表位肽P39用于血清学诊断的敏感性可以达到75.00%，特异性为67.71％。约登指数为0.667，应用ROC分析得到AUC值为0.8435，表现出较好的检测效果，因此，表位肽P39将成为一种有效的新的应用于血清学诊断的生物标记物。

本发明表位肽P₃₉的确定，不仅为研制基于CFP10抗原蛋白的结核疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息，为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定了基础，有利于进一步理解抗结核感染的保护性免疫机制，对结核病的防治具有重大意义。

附图说明

图1：结核分枝杆菌蛋白质CFP10的表位分析；

图2：表位肽P₃₉的质谱分析图；

图3：表位肽P₃₉经HPLC纯化的结果；

图4：血清样本中表位肽P₃₉特异性IgG抗体诊断活动性结核患者和健康对照者的受试者工作曲线(ROC曲线)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的表位肽P₃₉，作进一步详细的说明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1 一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位多肽的确定

本发明综合利用各种生物信息学、免疫信息学的技术手段，预测CFP10抗原蛋白所含的限制性T细胞表位。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载获取结核杆菌CFP10蛋白序列，EXPASY软件对其蛋白氨基酸序列与人类蛋白质的同源性进行分析；用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHCⅡpan这三种在线生物信息学软件联合预测分析，SYFPEITHI认为得分在前2%的多肽成为抗原肽的可能性超过80%，一般选取得分18分以上的进行后续分析，但为了提高预测表位的准确性和精确性，本发明选取得分在24分以上的连续15个氨基酸序列进行后续分析；RANKPEP选取红色标记的氨基酸序列结果进行后续分析；NetMHCⅡpan所进行预测的表位肽与等位基因的结合性能评价为50nm时两者具有较好的亲和力，结合综合预测值（comb）>0.75 的多肽进行汇总，利用DNAStar软件分析CFP10蛋白序列及表位分布情况，一般认为转角和无规则卷曲的结构与表位形成密切相关，Rothbard-Taylor法初步预测CFP10蛋白潜在的T细胞抗原表位可能位于2个小区域，见图1。结合基于矩阵的T细胞表位预测算法和人工神经网络法进行T细胞表位预测的结果和蛋白序列的分析，再根据表位分布情况通过大量的筛选，得到与HLA分子具有高亲和力的表位肽，并去除已知表位，最终确定符合条件的结核杆菌抗原蛋白CFP10的特异表位表位肽P₃₉，表位肽P₃₉肽段氨基酸序列为SEQ ID NO 1：LQGQWRGAAGTAAQA。

实施例2 一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位多肽的合成

1. 材料与方法：

1.1 主要试剂材料：

1.1.1 主要材料：HMP树脂-美国PE公司，苯甲硫醚-Sigma公司，EDT-Sigma公司，DMAP-美国PE公司，转铁蛋白-Sigma公司，呱咤-美国PE公司，氨基酸-美国PE公司，HOBt-美国PE公司，甲醇-美国PE公司，IFA-TEDIA公司，***-TEDIA公司，HoBt-美国PE公司，乙氰-TEDIA公司，NMP-美国PE公司，DCM-美国PE公司，DCC-美国PE公司，L-精氨酸-上海康达氨基酸厂，L-天冬酰胺-上海试剂三厂，L-谷氨酰胺-政翔化学试剂研究所。

1.1.2 主要仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》***重点实验室提供。

质谱仪APl2000型购自美国PE公司，多肽合成仪ABl431A型购自美国PE公司，HPLC仪Delta600型购自美国Waters公司，HPLC制备柱Delta-PakC4型购自美国Waters公司，Symmetry C8型购自美国Waters公司，HPLC分析柱Symmetry ShiledRP8型购自美国Laters公司，Delta-Pak C4型购自美国Waters公司。

根据预测的结果，本发明表位肽P₃₉采用标准Fmoc方案在ABl431A型多肽合成仪上进行合成，表位肽P₃₉的氨基酸序列为LQGQWRGAAGTAAQA（SEQ ID NO:1）。起始树脂为0.25mmol的P-羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP)，第一个氨基酸用二甲氨基苯晴(DMAP)连接到树脂上，氨基酸的量为10mol，比例为氨基酸：树脂=4:1，氨基酸的活化用1-羟基苯并***(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)，通过树脂与目的多肽的第一位带保护基的氨基酸在一定条件下进行缩合，耦联后用200mg/ml呱啶溶液去除Fmoc保护基团，加入第二个氨基酸进行缩合，按照序列使肽链从羧基端向氨基端延伸，重复以上步骤，直到加入第15个氨基酸。各种氨基酸的保护基团分别是：α-氨基为Fmoc基团保护；其余侧链保护基团为Lys(Boc)、Ser(tBu)、G1u(OtBu)，Arg(Pmc)、His(Trt)、Cys(Trt)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)。冰浴后的合成物加入处于冰浴条件下的lOml切割液中，待切割混合液温度上升至室温后持续搅拌，反应1.5h使肽链从树脂上裂解下来，同时去除保护基团。反应后的混合液经G4玻砂漏斗滤掉树脂，先后用约lml氟乙酸(TFA)、8ml二氧甲烷(DCM)冲洗反应瓶、树脂和漏斗。将滤液在常温下低压蒸发至2ml，加入50ml预冷的***沉淀多肽，4℃放置过夜，经G6玻砂漏斗过滤，真空抽干3h所得粗肽于-20℃储存。将合成的粗肽用二甲基亚砜(DMS0)溶解，浓度为20mg/ml，经0.22μL纤维滤膜过滤后，在Delta 600型HPLC上进行纯化和纯度分析，流动相选用乙氰溶液(含lml/LTFA)。梯度洗脱的乙氰溶液临时配制。洗脱时间为30 min，流动相流速为1.0ml／min，少量多次纯化，收集主峰。纯化收集液在常温下低压蒸发至完全干燥，用50ml预冷后的***沉淀、G6玻砂漏斗过滤收集沉淀、真空干燥，所得的多肽纯品于-20℃储存。合成的多肽在高压液相色谱仪上进行纯化，纯化后多肽的分子量测定在APl2000型质谱仪上进行，质谱分析并证实其分子量测定值与理论值相符，所得多肽即为靶肽，多肽质谱分析图见图2；表位肽P₃₉经HPLC纯化，纯度为96.54％，得到精肽，如图3所示。

实施例3 表位肽P₃₉对外周血单个核细胞增殖活性的影响

1. 材料与方法：

1.1 主要试剂材料：

1.1.1 主要材料：人工合成表位肽P₃₉；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；RPMI－1640细胞培养基购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自北京索莱宝科技有限公司；青链霉素购自北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝科技有限公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；96孔培养板购自晶安生物公司；细胞冻存管购自晶安生物公司；细胞培养瓶购自晶安生物公司；塑料刻度无菌离心管购自biosharp公司；肝素/EDTA抗凝血真空采血管购自江苏康捷医疗器械有限公司；塑料滴管购自biosharp公司。

1.1.2 主要仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》***重点实验室提供。

普通离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；10μl、20μl、100μl、200μl、1ml移液器购自德国Eppendof公司；791型磁力搅拌器购自上海南汇电讯器械厂；倒置显微镜XD-101-2B购自日本Olympus公司；细胞培养箱购自NUAIRE公司；-80度超低温冰箱购自SANYO公司；-20度冰柜购自青岛海尔公司；自动高压蒸汽灭菌锅购自TOMY公司。

2. 实验材料血液样本的采集

2.1 病史资料采集

对受试人群性别、年龄、卡介苗接种史、近期活动性结核密切接触史、免疫性疾病史和免疫抑制类药物的使用等基本情况进行采集。

2.2 活动性结核病人及健康对照者的入选：

(1)活动性结核组(ATB group)：入选活动性结核患者48例，入选者年龄在18岁以上，排除肿瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染(如慢性HBV/HCV感染等)；且尚未接受抗结核治疗；

(2)健康对照组(HC group)：入选健康对照者96例，无临床主诉症状，TST实验阴性，T-SPOT 实验阴性，胸部 X 线片阴性。

2.3 标本采集与处理：入选研究对象用肝素抗凝真空采血管空腹采集外周血4ml，室温保存，以备后续实验进行外周血单个核细胞的提取；EDTA抗凝真空采血管采集外周血3ml，室温静置待自然凝固后，以3000r/min常温离心10 min，收集血清分装于冻存管，放置于-80℃冰箱保存，待后续实验使用。

本发明符合国家和地方的道德准则，从所有入选的研究参与者或其法定监护人处获得书面知情同意书，本发明没有使用患者个人信息，没有侵犯受试者知情权及隐私权。

3．密度梯度离心法分离提取外周血单核细胞

分选之前，登记每个血液样本的基本信息。肝素钠抗凝管取3ml血样,并在15ml离心管中加入与血样等量的3ml淋巴细胞分离液，用滴管吸取肝素抗凝的血样，沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，进行2000rpm/20min离心。离心后可观察到管内液体分为四层，下层主要为红细胞和粒细胞层，中层为淋巴细胞分离液，上层为血浆和稀释液，在上、中层界面处有外周血单个核细胞为主的灰白色云雾层，用巴氏吸管将灰白色层的外周血单个核细胞吸取出来，置于另一离心管内，加入8ml的PBS液，进行混匀，再次1000rpm/10min离心，去除上清，该过程重复三遍后，向离心管中加RPMI-1640液4ml，进行混匀，即为外周血单核细胞。

3.1 淋巴细胞的冻存与复苏

淋巴细胞的冻存：新鲜的冻存缓冲液（90%胎牛血清+10%DMSO），并且放置预冷待用。将预先配好的冻存液与制备的细胞悬液（1×10⁶/ml）以1：1体积混匀，1ml分装入冻存管中。加细胞液1.5ml；冻存管上应作好记录，写明细胞的名称，冻存日期；先将冻存管放入4度冰箱，约30分钟；再放入-20度冰箱，约60分钟；最后置-80度冰箱过夜，液氮罐长期保存。

淋巴细胞的复苏：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37度温水中，并不时摇动使其尽快融化，管口处高于水面，防止污染；从37度水浴中取出冻存管，于超净台中打开冻存管，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml的离心管中，该离心管中已预先加入了3ml的RPMI-1640完全培养基，轻弹混匀细胞；离心，1500rpm，5分钟；离心后弃去上清液，轻轻吹打细胞，加入到细胞培养瓶中；每隔三日，更换一次细胞培养液，继续培养。

3.2 检测淋巴细胞增殖情况

本实验中，采用CCK-8法替代以往的MTT法进行淋巴细胞增殖试验。CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析，此方法比起原有的MTT法具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点。

将分离的结核病患者外周血单个核细胞用RPMI-1640培养基调整细胞数为1×10⁶/ml；将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，每组设六个复孔，按照PBS组(阴性对照)、2.5μg/ml表位多肽组、5μg/ml表位多肽组、10μg/ml表位多肽组、20μg/ml表位多肽组和40μg/ml表位多肽组的顺序依次加入96孔板中，将96孔板周边的孔设为空白孔，加入无细胞悬液的RPMI1640完全培养基，以预防误差，37℃，5％CO₂培养48小时；48小时后，向各孔中加入20μl的CCK-8溶液，37℃、5％CO2孵育5小时，测定450nm处的OD值，结果以六个复孔的平均值表示，进行检测淋巴细胞增殖情况。通过OD₄₅₀值的大小来反应表位肽P₃₉对人PBMC增殖活性的影响。增殖水平以刺激指数(Stimulation Index，SI)表示：SI＝多肽刺激组OD₄₅₀值/阴性对照组OD₄₅₀值。SI≥2被认为阳性结果。观察PBMC在表位肽P₃₉刺激后的增殖反应情况。通过比较结核病患者表位肽P₃₉刺激前后的PBMC增殖活化指数(SI)，分析表位肽P₃₉的变应原性。

结果：如表1所示，可知表位肽P₃₉五种不同浓度的SI值≥2，因而认定结核病患者PBMC对表位肽P₃₉表现出较强的增殖能力，表位肽P₃₉是能够有效刺激T细胞活化的阳性肽；对表位肽P₃₉五种不同浓度的增殖情况进行分析，可知表位肽P₃₉的浓度为40μg/ml时，结核病患者的PBMC产生的增殖反应最强，因此确定表位肽P₃₉的最佳细胞刺激增殖浓度为40μg/ml。

表一：表位肽P₃₉刺激淋巴细胞增殖

实施例4 检测表位肽P₃₉免疫后血清的特异性抗体效价，对其进行血清学评价

1. 材料与方法：

1.1 主要试剂材料：

1.1.1 主要材料：人工合成表位肽P₃₉；IgG-HRP单抗购自Bioworld公司,酶标板与封板膜购自Corning公司，pH9.6碳酸盐包被液、TMB单组份显色液、ELISA终止液均购自北京索莱宝生物技术公司，肝素抗凝血真空采血管购自江苏康捷医疗器械有限公司。

1.1.2 主要仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》***重点实验室提供。

10μl、20μl、100μl、200μl、1ml移液器购自德国Eppendof公司；791型磁力搅拌器购自上海南汇电讯器械厂；-80度超低温冰箱购自SANYO公司；-20度冰柜购自青岛海尔公司；自动高压蒸汽灭菌锅购自TOMY公司；多功能酶标仪购自TECAN公司。

2. 使用表位肽P₃₉检测两组人群血清IgG的应答

2.1方阵滴定法确定表位肽P₃₉的最佳包被浓度、待测血清及酶标二抗最佳稀释比例

首先将表位肽P₃₉用pH9.6碳酸盐包被液稀释至0.25ug/mL、1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL四个浓度，96孔酶标板的第1、2、3列每加入0.25ug/mL表位肽P₃₉稀释液100uL，4、5、6列加入1ug/mL表位肽P₃₉稀释液100uL，7、8、9列加入 5ug/mL表位肽P₃₉稀释液100uL，以此类推在微孔板震荡仪上震荡片刻混匀后用封口膜封住酶标板，置于4℃包被过夜。次日，弃去酶标板内液体，在吸水纸上轻轻拍干后每孔加入300uL的PBST洗液，静置2min后弃去洗涤液并拍干酶标板，反复洗涤5次。洗板完毕后向每孔加入300uL用PBST稀释的5%脱脂奶粉，盖上封板膜置于4℃封闭过夜。封闭完成弃去板内封闭液，按照前述步骤用PBST洗板5次并拍干微孔板。随后向酶标板的 A、B、C、D 行依次加入用 PBST 按 1:50、1:100、1:500、1：1000 稀释的结核病人血清；E、F、G、H 行依次加入用 PBST 按 1:50、1:100、500、1：1000 稀释的健康人血清，封板后置于4℃孵育过夜。弃去板内血清洗板 5 次后向酶标板的第 1、4、7、10 列加入以 1:10000 稀释的酶标二抗（Gota anti Huamn IgG-HRP），2、5、8、11 列加入以 1:20000稀释的酶标二抗，3、6、9、12 列加入以 1:40000 稀释的酶标二抗，置于4℃孵育过夜。酶标二抗孵育结束后弃去酶标板内液体，洗板5次并拍干酶标板，然后每孔加入100uL 的TMB单组份显色液，于37℃避光孵育显色15min，随后每孔加入 50uL ELISA终止液终止显色反应，15min内在酶标仪上测量OD_450nm下的吸光度。分析酶标板吸光度数据，以阳性（P）/阴性（N）最大值（P/N 值须≥2.1 为有效数据)所对应的表位肽P₃₉包被浓度、血清稀释比例、酶标二抗稀释比例为间接 ELISA 检测血清IgG抗体最优条件，结果可知根据棋盘滴定法检测，确定表位肽P₃₉检测血清IgG 的最佳包被浓度是10μg/mL，一抗血清最佳稀释度为1：500及二抗最佳稀释比例为1：40000。

2.2 间接ELISA方法评价表位肽P₃₉的抗原性及结核患者与健康人两组人群血清标本中IgG的免疫应答。

在确定间接ELISA检测血清中IgG抗体其最佳包被浓度是10μg/mL，一抗血清最佳稀释度为1：500及二抗最佳稀释比例为1：40000的情况下，通过建立的间接ELISA法对48份结核病人血清及96份健康人血清进行检测的具体步骤如下：(1)包被：表位肽P₃₉溶解于包被缓冲液中(10ug/ml)；以100ul/孔加入96孔酶标板中，4℃过夜；(2)洗板：PBST洗涤液300ul/孔，2min，洗3次； (3)封闭：封闭液，300ul/孔，4℃过夜；(4)洗板：洗涤液300ul/孔，2min，洗3次； (5)加血清：按1:500稀释后的待测血清，100ul/孔，4℃过夜； (6)洗板：洗涤液300ul/孔，3min，洗5次； (7)加酶标二抗：加入新鲜稀释的IgG酶标抗体(1:40000)100ul/孔，室温条件下孵育4℃过夜；(8)洗板：洗涤液300ul/孔，2min，洗5次； (9)显色：新鲜配置的TMB显色液，100ul/孔，室温避光孵育15min；(10)终止：终止液50ul/孔；(11)测定：酶标仪调至450nm，以第一个空白对照孔调零后测各孔OD值。

3.统计方法

采用SPSS20.0统计软件，用单因素方差分析(One-way ANOVA)对两组人群之间OD值的差异进行统计分析，并计算出Youden指数，该指数范围介于0-1，指数的值越大，真实性越好，Youden指数最大的点所对应的吸光度OD值，即为该多肽的Cut-off值。根据表位肽P₃₉的Cut-off值，判定待检血清的阴、阳性，即待检测血清的标本OD值大于该表位多肽的Cut-off值则确定该样本为阳性，小于Cut-off值则为阴性，计算表位肽P₃₉在检测结核病上的敏感性、特异性，并绘制 ROC 曲线，计算最大曲线下面积（AUC），评判表位肽P₃₉在检测结核病中的效能，若 AUC≈1，则该表位肽P₃₉为最为理想的检查指标；若0.6≤AUC≤0.9，则该表位肽P₃₉具有一定的诊断价值；若AUC≤0.5，则该表位肽P₃₉诊断实验无价值。

4.实验结果

结果表明，在活动性结核病组中，该表位肽P₃₉特异性的IgG抗体水平显著高于健康对照组(p<0.001)。应用间接ELISA初步检测了48例结核样本与96例健康人样本血清中的抗原特异性IgG，在初步检测中表位肽P₃₉在活动性结核病人群中检测出的阳性样本36人，在健康人群中检测出的阳性样本31人，敏感性为75％，特异性为67.71％，约登指数为0.667，Cut-off值为0.259，应用ROC分析，得到曲线下面积AUC为0.8435，如图4所示。

综上所述，本发明筛选鉴定的表位肽P₃₉能够特异地被结核病患者识别，并诱导外周血单个核细胞增殖，且该表位肽P₃₉敏感性为75％，特异性为67.71％，其约登指数为0.667，证明间接ELISA值的真实性较好，AUC值为0.8435，说明表位肽P₃₉具有一定的诊断价值，如可以将本发明表位肽P₃₉作为结核病的疫苗，也可将表位肽P₃₉作为治疗结核病药物的成分；也可以通过检测患者对表位肽P₃₉的免疫反应来判断患者是否患有结核病，故表位肽P₃₉也可作为结核病诊断试剂盒中的成分。这项研究的结果对开发高灵敏度和特异性的TB检测表位肽提供了参考，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 一种结核分枝杆菌特异性T细胞表位肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala

1 5 10 15