一种美曲普汀的制备方法
阅读说明：本技术 一种美曲普汀的制备方法 (Preparation method of metreleptin ) 是由 汤华东 梅芸 董瑶 童齐金 陈亚 于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种美曲普汀的制备方法,具体是美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体,包涵体进行溶解,再进行疏水层析复性,获得美曲普汀蛋白。包涵体溶解和疏水层析复性均采用温和的方式进行,过程中还可以添加抗氧化剂和/或金属螯合剂,以抑制目的蛋白的氧化、降解。该方法制备美曲普汀,易于实现产业化放大,复性效率高,收得率高,生物活性好。(The invention discloses a preparation method of metreleptin, and particularly relates to a preparation method of metreleptin protein, wherein metreleptin gene is expressed by a prokaryotic expression system to obtain an inclusion body, the inclusion body is dissolved, and then hydrophobic chromatography renaturation is carried out. The dissolution of the inclusion body and the renaturation of the hydrophobic chromatography are carried out in a mild mode, and an antioxidant and/or a metal chelating agent can be added in the process to inhibit the oxidation and degradation of the target protein. The method for preparing the metreleptin is easy to realize industrial amplification, and has high renaturation efficiency, high yield and good biological activity.)
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种美曲普汀的制备方法。
背景技术
美曲普汀(Metreleptin)是大肠杆菌表达系统表达的重组人瘦素衍生物(rmetHuLeptin)，含有147个氨基酸残基，与天然人瘦素蛋白相比，其N末端多一个甲硫氨酸残基，故又称为重组人甲硫氨酰瘦素蛋白。美曲普汀无糖基化修饰，其第97位半胱氨酸残基与第147位半胱氨酸残基形成链内二硫键，封闭其C-末端，相对分子量约为16.15k Da。2014年2月24日，美国FDA批准美曲普汀制剂上市(商品名：Myalept，Amylin公司产品)，用作补充疗法治疗先天性或获得性脂肪代谢障碍患者瘦素缺乏并发症，制剂规格：11.3mg/支。
大肠杆菌(E.coli)表达系统，因其基因组信息研究清晰、基因操作简便，而为学术界和工业界广泛应用。但大肠杆菌细胞内缺乏氧化还原环境和翻译后加工修饰机制，所以许多大肠杆菌表达系统重组表达的外源性蛋白均无法正确折叠，从而形成不可溶的包涵体(IBs)。包涵体中主要是部分折叠或者错误折叠的目的蛋白的聚集体。要从包涵体中得到正确折叠，具有天然生物学活性的蛋白，通常采用复杂的“变性-复性”过程：首先使用高浓度的变性剂如8M尿素或6M盐酸胍溶解包涵体，将目的蛋白二级结构完全打开(变性)，再通过合适溶液使目的蛋白重新折叠，形成正确的结构(复性)。
用大肠杆菌表达系统表达制备重组人瘦素蛋白或者其衍生物时，目的蛋白也主要以包涵体形式表达，获得有生理活性的瘦素蛋白通常使用的方法也是使用盐酸胍或尿素溶解后再复性。但这种包涵体的溶解方式会完全破坏蛋白质的结构，包括所有的二级结构，这样在蛋白质的复性(重折叠)过程中，容易折叠错误，引起蛋白聚集沉淀，从而复性失败，或者复性效率低，导致蛋白收得率低。常规复性采用稀释复性或透析复性方式，逐步脱除变性剂(尿素或盐酸胍)，在变性剂浓度逐级降低的同时目的蛋白会折叠、形成正确构象。由于稀释复性或透析复性方式很难真正实现变性剂浓度逐级降低，变性剂浓度的骤然下降时目的蛋白还来不及折叠成正确构象，往往形成错误构象，并聚集沉淀，导致复性效率低下；通常稀释复性或透析复性时包涵体溶解液与复性液的比例高达1:50～1:100，也不利于产业化放大或者放大成本高。因此，有必要开发一种易于产业化放大、收得率高的美曲普汀制备方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的美曲普汀在生物工程制备过程中常以包涵体形式存在，要经过复杂的变性、复性过程，难于产业化放大、收得率低等问题，本发明提供了一种新的美曲普汀的制备方法，整体技术方案是以原核表达系统表达美曲普汀，制得包涵体，采用一种较温和的方式溶解包涵体，并采用疏水层析进行复性。用该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高。
下面详述本发明的技术方案：
一种美曲普汀的制备方法，美曲普汀基因通过原核表达系统表达获得包涵体，包涵体进行溶解，再进行疏水层析复性，获得美曲普汀蛋白；
所述溶解使用的溶解液为0.5M～1M的Arg，pH 12，溶解温度为2～8℃，溶解时间为3～18小时；
所述疏水层析复性包括以下步骤：
(1)将溶解后的包涵体溶液中，加入等体积含4M NaCl的溶解液，然后上样至预平衡好的层析柱；所述层析柱为经过平衡液1平衡3～5个柱床体积的Phenyl Fast Flow 6(high)层析柱；
(2)上样完毕后，用平衡液1复平衡层析柱；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3～10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3～10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3～10个柱床体积；
(3)最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1含0.5M Arg，2M NaCl，pH 12；
所述平衡液2含0.5M Arg，2M NaCl，pH 10；
所述复性液1含20mM PB，0.5M NaCl，5％甘油(w/v)，0.01％Tween80(w/v)，pH＝8.0；
所述复性液2含20mM PB，0.15M NaCl，0.01％ Tween80(w/v)，pH 8.0；
所述洗脱液含0.01％ Tween80(w/v)。
Arg：精氨酸，2-氨基-5-胍基-戊酸；PB：PB缓冲液，由NaH2PO4和Na2HPO4加纯化水配制而成。上述各溶液的溶剂均为水，各成分百分含量的单位w/v是重量体积比，例如5％甘油，即为100ml溶液中含5g甘油。
为避免常规高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体对目的蛋白二级结构的破坏作用，本发明采用较温和的方式溶解包涵体，即高pH条件(0.5M～1M的Arg，pH12)溶解包涵体，这种包涵体溶解方式可以保留蛋白二级结构，从而增加复性效率；同时精氨酸还可帮助包涵体溶解以及目的蛋白的折叠、复性。
本发明疏水层析复性采用逐级降低(梯度洗脱)目的蛋白所处的pH环境(pH12→pH10→pH8.0)，逐级降低(梯度洗脱)目的蛋白所处的盐离子浓度(2M NaCl→0.5M NaCl→0.15M NaCl)的方式，使目的蛋白得到充分时间折叠成正确构象；同时加入甘油和Tween 80可提高暂时错误折叠构象蛋白的溶解度，避免其聚集沉淀，进一步提高了复性效率。同领域技术人员将会理解，对于层析工艺一旦确立工艺参数，是很容易实现线性放大的。
美曲普汀基因通过原核表达系统表达，是将美曲普汀基因***原核表达载体，构建成重组表达载体，重组表达载体导入原核表达菌株中，构建含有重组表达载体的基因工程菌，然后在适宜条件下培养基因工程菌，诱导美曲普汀在该基因工程菌中表达。
原核表达载体是能携带***的基因序列进入原核细胞中进行表达的载体，通常含有载体自主复制、目的基因表达、转录等所需的调控元件，包括复制起点(Ori)、启动子、转录终止子、操纵子、操纵子阻遏物基因等序列，以及筛选标记基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因等；载体上调控目的基因表达的启动子有多种类型，如λ噬菌体T7启动子(pET系列载体)、pL/pR启动子(pBV220载体)、冷休克基因CSPA启动子(pCold系列载体)等。可选或优选的，所述原核表达载体为pET32a(+)、pBV220或pCold IV。
原核表达菌株优选大肠杆菌，大肠杆菌在选择时应考虑与所选用原核表达载体的相适配性，该适配性选择为本领域技术人员所能理解；例如若所选用原核表达载体为pET系列载体，由于该系列载体均使用λ噬菌体T7启动子启动目的基因的转录，而该T7启动子转录需要用到T7 RNA聚合酶，可选择整合有λ噬菌体DE3片段(该片段中包含了编码T7 RNA聚合酶的基因)的BL21(DE3)菌株；再比如选用pL/pR启动子启动目的基因转录的pBV220载体或CSPA启动子启动目的基因转录的pCold系列载体，均可选用BL21菌株作为表达菌株。
将基因序列***原核表达载体，构建成重组表达载体的技术为本领域公知常识，可参考J.萨姆布鲁克和M.R.格林主编的《分子克隆实验指南》，按“限制性内切酶酶切-连接”的方式***原核表达载体多克隆位点(MCS)中；或采用无缝克隆(Seamless Cloning/In-Fusion Cloning)的方式***原核表达载体的适宜位置。无缝克隆是通过PCR扩增在拟***的基因序列(目的基因序列)两端和线性化的载体两端分别带上15～20个同源碱基序列，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化大肠杆菌(宿主菌)，进入宿主菌中的载体依靠大肠杆菌修复系统将缺口修复。通过无缝克隆，可以无痕的***目的基因序列，同时还可去掉表达载体上的多余序列，从而使重组表达载体的序列长度最短，降低载体复制所需能量，从一定程度上达到提高表达效率的效果。
重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株的方法，为本领域公知常识，可为CaCl2热激转化法，或电穿孔法(Electroporation)等。
诱导表达，是指通过调节培养温度，或加入诱导剂，如IPTG或乳糖或其类似物，以开启目的基因表达，可参照不同原核表达载体的说明书上记载的诱导条件选择诱导温度或诱导剂进行诱导表达，诱导温度可为16～42℃，诱导剂浓度可为0.35～1mM，诱导后的培养时间可为4～22小时。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述溶解液、平衡液1、平衡液2和复性液1的至少一种中还添加抗氧化剂。有助于抑制目的蛋白美曲普汀的氧化失活。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述抗氧化剂添加后的终浓度为1～100mg/ml。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述抗氧化剂为Met(甲硫氨酸)，添加后Met的终浓度为2mg/ml。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述溶解液、平衡液1、平衡液2和复性液1的至少一种中还添加金属离子螯合剂，以抑制金属蛋白酶对目的蛋白美曲普汀的降解。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述金属离子螯合剂添加后的终浓度为1～100mM。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述金属离子螯合剂为EDTA。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，还包括对美曲普汀粗品进行纯化的步骤。纯化方法为本领域公知，可采用包括硫酸铵沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、制备型反相色谱等通用纯化技术，使目的蛋白美曲普汀的纯度大于95％，更为优选地，使美曲普汀的纯度大于98％。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述美曲普汀基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码如SEQ ID NO.1所示的美曲普汀氨基酸序列；通过大肠杆菌表达系统表达。上述核苷酸序列是经过密码子优化的美曲普汀基因序列，参照大肠杆菌偏爱密码子表，并结合密码子简并性、GC含量、转录的mRNA结构及其稳定性等因素对该DNA序列进行优化，以期提高编码蛋白的表达量。可采用OptimumGeneTM软件进行DNA序列优化。本领域技术人员将会理解，为便于将所述基因序列***克隆载体或表达载体等分子克隆操作，所述基因序列两端还可加上限制性内切酶识别序列；为便于翻译起始和终止，还可在所述基因序列的5’-端上游加上核糖体结合位点序列(RBS序列)/Shine-Dalgarno(SD)序列，和/或3’-末端加上终止密码子序列。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述原核表达系统为含有带美曲普汀基因的重组表达载体的基因工程菌，表达条件为基因工程菌生长至OD600＝0.4～40时，诱导美曲普汀在基因工程菌中表达。
优选的，上述美曲普汀的制备方法中，所述原核表达系统在表达结束后，表达系统经过洗涤缓冲液洗涤后，用破菌缓冲液进行破菌释放包涵体，所得包涵体再用清洗液进行清洗，供溶解备用；所述洗涤缓冲液、破菌缓冲液和清洗液均为含20mM PB、0.15M NaCl、1mMEDTA、和0.1％ TritonX-100(w/v)的水溶液，pH 7.4。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用一种较温和的方式溶解包涵体，并采用疏水层析进行复性，在制备过程进一步使用抗氧化剂和/或金属螯合剂，以抑制目的蛋白的氧化、降解。该方法制备美曲普汀，易于实现产业化放大，复性效率高，收得率高，且产品生物活性与市售品相当。
附图说明
图1：不同诱导剂IPTG浓度对pET-DE3工程菌株目的蛋白表达影响的SDS-PAGE图。其中1号样为诱导剂IPTG终浓度1mM，2号样为诱导剂IPTG终浓度0.75mM，3号样为诱导剂IPTG终浓度0.5mM，4号样为诱导剂IPTG终浓度0.25mM，M为蛋白Marker。
图2：不同诱导表达时间对pET-DE3工程菌株目的蛋白表达影响的SDS-PAGE图。其中1号样为诱导培养4小时的全菌液，2号样为诱导培养4小时的破菌后沉淀，3号样为诱导培养8小时的全菌液，4号样为诱导培养8小时的破菌后沉淀，5号样为诱导培养16小时的全菌液，6号样为诱导培养16小时的破菌后沉淀，M为蛋白Marker。
图3：美曲普汀纯品RP-HPLC分析图谱。
图4：美曲普汀纯品SEC-HPLC分析图谱。
图5：质谱法检测美曲普汀纯品分子量结果。A为非还原相对分子量结果；B为还原后相对分子量结果。
图6：美曲普汀纯品二硫键配对分析结果。
图中，leptin表示美曲普汀。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。
实施例1：美曲普汀重组表达载体的构建
1.1 美曲普汀表达基因序列优化及合成
参照原核生物大肠杆菌密码子使用频率表，结合mRNA二级结构稳定性和GC含量均衡性等因素，在不改变SEQ ID NO.1所示的美曲普汀氨基酸序列的前提下，优化碱基序列，以期最大限度提高目的蛋白的表达量，优化后的美曲普汀表达基因序列如SEQ ID NO.2所示。通过化学合成的方式合成该序列。
1.2 美曲普汀重组表达载体的构建
采用原核表达载体构建美曲普汀重组表达载体。本实施例中，所述的重组表达载体均通过无缝克隆的方法构建。目的蛋白(美曲普汀)基因均紧接在起始密码子ATG之后，并且最后一个氨基酸密码子TGC之后的终止密码子使用了最优终止密码子TAA；为加强终止效率，终止密码子TAA之后又额外增加了一个T，最大限度地提高了终止效率。列举如下来说明：
1.2.1 pET32a(+)-leptin重组表达载体的构建
pET32a(+)载体是一种融合蛋白表达载体，含有T7启动子，其下游依次含有lac操纵子、核糖体结合位点(RBS)、硫氧环蛋白标签(Trx-tag)、6×His标签(N-6×His)、凝血酶切割位点(N-thrombin)、S-标签(S-tag)、EK酶切割位点(N-EK)、多克隆位点(MCS)、6×His标签(C-6×His)和T7终止子；该载体含有氨苄青霉素抗性基因以便于重组子筛选。
(1)目的基因片段及线性化载体的获得
设计目的基因正向引物pET32a(+)-lept F(SEQ ID NO.3)和反向引物pET32a(+)-lept R(SEQ ID NO.4)，以实施例1.1化学合成的基因序列为模板，采用PCR扩增得到目的基因片段。所述目的基因引物一方面引入大肠杆菌最优终止密码子序列TAAT(下划线所示TAAT互补序列ATTA)，可高效终止翻译，另一方面引入载体部分序列(小写字母)，以利于无缝克隆的进行：
pET32a(+)-lept F：5'-aggagatatacatatgGTGCCGATCCAGAAGG-3'；
pET32a(+)-lept R：5'-agcagccggatcATTAGCAGCCCGGGCTCAG-3'。
设计载体正向引物pET32a(+)F(SEQ ID NO.5)和反向引物pET32a(+)R(SEQ IDNO.6)，采用PCR扩增线性化pET32a(+)载体。所述载体引物可同时去掉pET32a(+)载体起始密码子后的Trx-tag、N-6×His、N-thrombin、S-tag、N-EK、MCS以及C-6×His序列，可缩短载体序列大小：
pET32a(+)F：5'-TAATgatccggctgctaac-3'；
pET32a(+)R：5'-catatgtatatctccttc-3'。
同领域技术人员将会理解，缩短载体序列大小，有利于降低载体复制所需能量，有利于缩短载体复制时间，有助于提高目的蛋白表达效率。
(2)无缝克隆连接
可参照商品化无缝克隆试剂盒说明书进行操作，本实施例中，无缝克隆反应体系可为：线性化载体0.03pmol，目的基因片段0.06pmol，5×Buffer 4μL，Exnase 1μL；37℃反应0.5h后，冰浴5min，然后转化Top10菌株，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养13～16小时，筛选得到重组克隆子，通过PCR鉴定正确后，再经测序确认序列的准确性。提取经PCR鉴定和测序确认正确的重组质粒，即得重组表达载体，记作pET32a(+)-leptin。
1.2.2 pCold IV-leptin重组表达载体的构建
pCold IV载体含有冷休克基因CSPA启动子，在该启动子下游含有5’非翻译区(5’UTR)、翻译增强元件(TEE)、6×His标签序列、Xa因子切割位点、多克隆位点(MCS)和3’非翻译区(3’UTR)；该启动子下游还含有lac操纵子，可通过IPTG或乳糖或其类似物诱导其表达。该载体含有氨苄青霉素抗性基因以便于重组子筛选。
(1)目的基因片段及线性化载体的获得
设计目的基因正向引物pCold-lept F(SEQ ID NO.7)和反向引物pCold-lept R(SEQ ID NO.8)，以实施例1.1化学合成的基因序列为模板，采用PCR扩增得到目的基因片段。所述目的基因引物一方面引入大肠杆菌最优终止密码子序列TAAT(下划线所示TAAT互补序列ATTA)，可高效终止翻译，另一方面引入载体部分序列(小写字母)，以利于无缝克隆的进行：
pCold-lept F：5'-gaggtaataccatatgGTGCCGATCCAGAAGG-3'；
pCold-lept R：5'-gggtaccgagctcATTAGCAGCCCGGGCTCAG-3'。
设计载体正向引物pCold F(SEQ ID NO.9)和反向引物pCold R(SEQ ID NO.10)，采用PCR扩增线性化pCold IV载体。所述载体正向引物引入目的基因表达的终止密码子序列TAAT：
pCold F：5'-TAATgagctcggtaccctcgagggatc-3'；
pCold R：5'-catatggtattacctcttaataat-3'。
(2)无缝克隆连接
可参照商品化无缝克隆试剂盒说明书，将1.2.2(1)经PCR扩增所得的目的基因片段与线性化的pCold IV载体进行无缝克隆连接，然后转化Top10菌株，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养13～16小时，筛选得到重组克隆子，通过PCR鉴定正确后，再经测序确认序列的准确性。提取经PCR鉴定和测序确认正确的重组质粒，即得重组表达载体，记作pCold IV-leptin。
1.2.3 pBV220-leptin重组表达载体的构建
pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体，载体含有SD序列；其后紧跟多克隆位点(MCS)，便于***带起始密码子ATG的外源基因；含有强的转录终止子rrnB T1和T2终止子；含有λ噬菌体pL/pR启动子和编码对该启动子具有抑制作用而又对温度敏感的cI蛋白基因cIts857调控基因cI，因此可用温度对***其中的外源基因的转录进行调控；同时含有氨苄青霉素抗性基因以便于重组子筛选。
(1)目的基因片段及线性化载体的获得
设计目的基因正向引物pBV220-lept F(SEQ ID NO.11)和反向引物pBV220-leptR(SEQ ID NO.12)，以实施例1.1化学合成的基因序列为模板，采用PCR扩增得到目的基因片段。所述目的基因引物一方面引入大肠杆菌最优终止密码子序列TAAT(下划线所示TAAT互补序列ATTA)，可高效终止翻译，另一方面引入载体部分序列(小写字母)，以利于无缝克隆的进行：
pBV220-lept F：5'-ttcccggggatccATGGTGCCGATCCAGAAGG-3'；
pBV220-lept R：5'-ctgcaggtcgacATTAGCAGCCCGGGCTCAG-3'。
设计载体正向引物pBV220 F(SEQ ID NO.13)和反向引物pBV220 R(SEQ IDNO.14)，采用PCR扩增线性化pBV220载体。所述载体正向引物引入目的基因表达的终止密码子序列TAAT，反向引物引入目的基因表达的翻译起始密码子ATG(大写粗体所示ATG的反向互补序列CAT)：
pBV220 F：5'-TAATgtcgacctgcagccaagcttc-3'；
pBV220 R：5'-CATggatccccgggaattcctcct-3'。
(2)无缝克隆连接
同1.2.2(2)方法，将1.2.3(1)经PCR扩增所得的目的基因片段与线性化的pBV220载体进行无缝克隆连接，转化Top10菌株，经筛选，鉴定，提取得到重组表达载体，记作pBV220-leptin。
实施例2：美曲普汀基因工程菌的构建及诱导表达
将实施例1.2构建的重组表达载体，通过CaCl2热激转化法或电穿孔法(Electroporation)转入适配的大肠杆菌表达菌株细胞中，经筛选得到重组子，即为基因工程菌株。列举如下来说明：
2.1 pET-DE3工程菌株的构建及诱导表达
将实施例1.2.1构建的pET32a(+)-leptin重组表达载体，转化BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃培养13～16小时筛选得到重组子，即为美曲普汀基因工程菌株，记作pET-DE3工程菌株。
(1)诱导剂IPTG浓度筛选
将活化的pET-DE3工程菌株按1:100(V/V)比例接种于含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃摇瓶培养至OD600＝0.6时，加入IPTG，终浓度分别为0.25mM、0.5mM、0.75mM和1mM。诱导培养22h后，取20μl菌液做SDS-PAGE检测，检测目的蛋白表达量。
实验结果如图1所示，目的蛋白在IPTG终浓度为1mM时，目的蛋白表达量最高，并且杂质蛋白表达量较少。
(2)诱导培养时间筛选
将活化的pET-DE3工程菌株按1:100(V/V)比例接种于含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃摇瓶培养至OD600＝0.6时，加入IPTG，终浓度为1mM。分别诱导4小时，8小时，16小时。收集菌体，超声破碎。取沉淀和全菌液进行SDS-PAGE检测。
实验结果如图2所示，诱导表达4小时，8小时和16小时后，全菌液和沉淀中目的蛋白随着时间延长，表达量逐渐增加。
2.2 pCold-BL21工程菌株的构建及诱导表达
将实施例1.2.2构建的pCold IV-leptin重组表达载体，转化BL21大肠杆菌表达菌株，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃培养13～16小时筛选得到重组子，即为美曲普汀基因工程菌株，记作pCold-BL21工程菌株。
将活化的pCold-BL21工程菌株按1:100(V/V)比例接种于含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃摇瓶培养至OD600＝0.8时，将温度降低至16℃，并加入IPTG使其终浓度为1mM，诱导培养22小时。收集菌体，超声破碎，取沉淀，上清和全菌液进行SDS-PAGE检测。结果显示目的蛋白美曲普汀大部分存在于破菌沉淀中，为包涵体表达。
2.3 pBV-BL21工程菌株的构建及诱导表达
将实施例1.2.3构建的pBV220-leptin重组表达载体，转化BL21大肠杆菌表达菌株，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃培养13～16小时筛选得到重组子，即为美曲普汀基因工程菌株，记作pBV-BL21工程菌株。
将活化的pBV-BL21工程菌株按1:100(V/V)比例接种于含100μg/mlAmp的LB培养基中，37℃摇瓶培养至OD600＝0.4时，将温度提高至42℃，并加入IPTG使其终浓度为0.5mM，诱导培养4小时。收集菌体，超声破碎，取沉淀，上清和全菌液进行SDS-PAGE检测。结果显示目的蛋白美曲普汀大部分存在于破菌沉淀中，为包涵体表达。
实施例3：pET-DE3工程菌的小试发酵及包涵体制备、洗涤
取冻存的实施例2.1构建的pET-DE3工程菌，经活化、扩培后，按10％接种量接种于5L发酵培养液(发酵培养液成分为：葡萄糖5.0g/L，蛋白胨6.0g/L，酵母粉12.0g/L，NaCl1.0g/L，NH4Cl 2g/L，Na2HPO4·12H2O 30.0g/L，KH2PO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L)中进行发酵培养(温度37℃，转速200rpm，通气量1.8Nm3/h，罐压0.2bar)；发酵前期控制溶氧在30％以上，不足时逐步调整转速至600rpm，之后调整通气量至2.5Nm3/h，最后以碳源(葡萄糖600g/L)和氮源(蛋白胨150g/L、酵母粉150g/L)补料，控制溶氧在30％左右；在发酵前期，利用氨水调控pH在7.0，在随后的发酵过程中，尽量通过补料控制pH值。当发酵菌液OD600＝40时，将温度降低至30℃，并加入IPTG使其终浓度为0.35mM，诱导培养8小时后，放罐收集菌液，离心收集菌体。
收集的菌体经洗涤，破菌，离心即可得到包涵体，再经适宜方法清洗可得到较纯的包涵体。例示性地，可用以下方法制备、洗涤包涵体：
(1)菌体洗涤
按1:15～1:30(V/V)的比例将菌体重悬于菌体洗涤缓冲液(含20mM PB、0.15MNaCl、1mM EDTA、0.1％TritonX-100，pH 7.4)中，利用磁力搅拌器搅拌均匀后，离心，弃上清，收集菌体；可重复该步骤1～2次；
(2)破菌制备包涵体
将步骤(1)中洗涤好的菌体，按1:15(V/V)的比例重悬于破菌缓冲液(含20mM PB、0.15M NaCl、1mM EDTA、0.1％TritonX-100，pH 7.4)中，将其置于冰浴中，利用高压匀浆机进行破碎(破碎条件：压力小于900bar，匀浆4次)；破菌完毕，离心收集沉淀，即得包涵体。
(3)包涵体洗涤
将步骤(2)中得到的包涵体，重悬于包涵体洗涤缓冲液(含20mM PB、0.15M NaCl、1mM EDTA、0.1％TritonX-100，pH 7.4)中，进行包涵体洗涤，之后离心去除包涵体洗涤液，重复洗涤2～4次，以得到纯度较高的包涵体。
实施例4：包涵体溶解及疏水层析复性
本实施例采用较温和的方式溶解包涵体，并使用疏水层析(HIC)进行复性和初步纯化。纯化过程中出现一美曲普汀相关蛋白杂质，为N端第一个甲硫氨酸残基氧化产物(LiuJL,Lu KV,Eris T,etc.In vitro methionine oxidation of recombinant humanleptin.Pharm Res 1998,15(4):632-640.)，可以用C18柱RP-HPLC法检测该氧化杂质的比例；还可在制备过程中加入抗氧化剂和/或金属螯合剂以抑制其氧化。例示性地，列举如下：
4.1 包涵体溶解及疏水层析复性(添加抗氧化剂)
取实施例3制备并经洗涤的包涵体，按每1g包涵体加入30ml溶解液(含0.5M Arg(精氨酸)、2mg/ml Met(甲硫氨酸)，pH12)的比例，加入溶解液(含0.5M Arg、2mg/ml Met，pH12)，4℃搅拌12h，于12000g离心10min后，收集上清，即为包涵体溶解样品。在该包涵体溶解样品中加入等体积含有4M NaCl的溶解液(含0.5M Arg-2mg/ml Met，pH12)，然后上样预先用平衡液1平衡3个柱床体积的Phenyl Fast Flow 6(high)层析柱；上样完毕，用平衡液1复平衡层析柱3个柱床体积；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱5个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱5个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱5个柱床体积；最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1为含0.5M Arg、2mg/ml Met-2M NaCl的水溶液，pH 12；
所述平衡液2为含0.5M Arg、2mg/ml Met-2M NaCl的水溶液，pH 10；
所述复性液1为含20mM PB、2mg/ml Met、0.5M NaCl、5％甘油(w/v)、0.01％Tween80(w/v)的水溶液，pH＝8.0；
所述复性液2为含20mM PB、0.15M NaCl、0.01％ Tween80(w/v)的水溶液，pH 8.0；
所述洗脱液为0.01％Tween80(w/v)。
4.2包涵体溶解及疏水层析复性(添加金属螯合剂)
取实施例3制备并经洗涤的包涵体，按每1g包涵体加入50ml溶解液(含1M Arg(精氨酸)、1mM EDTA，pH12)的比例，加入溶解液(含1M Arg、1mM EDTA，pH12)，8℃搅拌3h，于12000g离心10min后，收集上清，即为包涵体溶解样品。在该包涵体溶解样品中加入等体积含有4M NaCl的溶解液(含1M Arg、1mM EDTA，pH12)，然后上样预先用平衡液1平衡5个柱床体积的Phenyl Fast Flow 6(high)层析柱；上样完毕，用平衡液1复平衡层析柱5个柱床体积；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱3个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱3个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱3个柱床体积；最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1为含0.5M Arg、1mM EDTA、2M NaCl的水溶液，pH 12；
所述平衡液2为含0.5M Arg、1mM EDTA、2M NaCl的水溶液，pH 10；
所述复性液1为含20mM PB、1mM EDTA、0.5M NaCl、5％甘油(w/v)、0.01％Tween80(w/v)的水溶液，pH＝8.0；
所述复性液2为含20mM PB、0.15M NaCl、0.01％ Tween80(w/v)的水溶液，pH 8.0；
所述洗脱液为含0.01％ Tween80(w/v)的水溶液。
4.3包涵体溶解及疏水层析复性(添加抗氧化剂和金属螯合剂)
取实施例3制备并经洗涤的包涵体，按每1g包涵体加入30ml溶解液(含0.5M Arg、2mg/ml Met、1mM EDTA，pH12)的比例，加入溶解液(含0.5M Arg、2mg/ml Met、1mM EDTA，pH12)，4℃搅拌12h，于12000g离心10min后，收集上清，即为包涵体溶解样品。在该包涵体溶解样品中加入等体积含有4M NaCl的溶解液(含0.5M Arg、2mg/ml Met、1mM EDTA，pH12)，然后上样预先用平衡液1平衡3个柱床体积的Phenyl Fast Flow 6(high)层析柱；上样完毕，用平衡液1复平衡层析柱3个柱床体积；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱5个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱5个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱5个柱床体积；最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1为含0.5M Arg、2mg/ml Met、1mM EDTA、2M NaCl的水溶液，pH 12；
所述平衡液2为含0.5M Arg、2mg/ml Met、1mM EDTA、2M NaCl的水溶液，pH 10；
所述复性液1为含20mM PB、2mg/ml Met、1mM EDTA、0.5M NaCl、5％甘油(w/v)、0.01％Tween80(w/v)的水溶液，pH＝8.0；
所述复性液2为含20mM PB-0.15M NaCl-0.01％Tween80(w/v)的水溶液，pH8.0；
所述洗脱液为含0.01％Tween80(w/v)的水溶液。
4.4包涵体溶解及疏水层析复性(无添加)
取实施例3制备并经洗涤的包涵体，按每1g包涵体加入40ml溶解液(含0.75M Arg(精氨酸)，pH12)的比例，加入溶解液(含0.75M Arg，pH12)，2℃搅拌18h，于12000g离心10min后，收集上清，即为包涵体溶解样品。在该包涵体溶解样品中加入等体积含有4M NaCl的溶解液(含0.75M Arg，pH12)，然后上样预先用平衡液1平衡4个柱床体积的Phenyl FastFlow 6(high)层析柱；上样完毕，用平衡液1复平衡层析柱4个柱床体积；再依次从平衡液1到平衡液2梯度洗脱10个柱床体积，平衡液2到复性液1梯度洗脱10个柱床体积，复性液1到复性液2梯度洗脱10个柱床体积；最后用洗脱液洗脱，收集目的峰，即得美曲普汀粗品；
所述平衡液1为含0.5M Arg、2M NaCl的水溶液，pH 12；
所述平衡液2为含0.5M Arg、2M NaCl的水溶液，pH 10；
所述复性液1为含20mM PB、0.5M NaCl、5％甘油(w/v)、0.01％Tween80(w/v)的水溶液，pH＝8.0；
所述复性液2为含20mM PB、0.15M NaCl、0.01％ Tween80(w/v)的水溶液，pH8.0；
所述洗脱液为含0.01％Tween80(w/v)的水溶液。
4.5美曲普汀粗品氧化杂质含量对比
采用C18柱RP-HPLC法(用95％的A相(1％TFA)和5％的B相(100％乙腈-1％TFA)预平衡C18分析柱(Waters公司产品，规格：4.6×250mm，5μm，货号：WAT106151)，UV检测设置在214nm处，柱温为常温，上样50μg，B相从5％到95％线性梯度洗脱，洗脱30分钟，流速为1ml/min。)检测实施例4.1、4.2、4.3和4.4所制备的美曲普汀粗品氧化杂质的比例，结果如表1所示，抗氧化剂(2mg/ml Arg)和/或金属螯合剂(1mMEDTA)可有效抑制美曲普汀氧化杂质的生成，减少目的蛋白氧化降解，有助于提高目的蛋白的最终收得率。
表1美曲普汀粗品氧化杂质含量比较
美曲普汀粗品制备方法
添加物
氧化杂质含量(％)
实施例4.1
2mg/ml Met
12.5
实施例4.2
1mM EDTA
13.7
实施例4.3
2mg/ml Met和1mM EDTA
12.8
实施例4.4
无
30.8
实施例5：美曲普汀蛋白精纯及其质量鉴定
本实施例采用阴离子交换层析(DEAE)结合反相制备色谱(C8)的方法对美曲普汀粗品进行精细纯化，所得美曲普汀纯品经RP-HPLC法和SEC-HPLC法检测纯度均大于98％。例示性地，具体方法如下：
取实施例4疏水层析(HIC)复性并初步纯化所得的美曲普汀粗品，加入1/9体积的0.5M Tris(pH8.5)，使美曲普汀蛋白处于50mM Tris-0.01％Tween80(w/v)，pH8.5的缓冲体系中；上样预先用50mM Tris-0.01％Tween80(w/v)，pH8.5平衡好的DEAE-Sepharose FastFlow层析柱；上样完毕，用同样的缓冲液[50mM Tris-0.01％ Tween80(w/v)，pH8.5]复平衡；然后用洗脱液[50mM Tris-0.01％ Tween80(w/v)-0.1M Arg，pH7.5]洗脱目的蛋白。
将上述DEAE-Sepharose Fast Flow层析洗脱收集物，上样预先用95％的A相(1％TFA)和5％的B相(100％乙腈-1％TFA)预平衡的C8制备柱；然后设置B相从5％到95％线性梯度洗脱，洗脱体积为2个柱体积；在梯度为65％B相时，收集目的蛋白洗脱峰，即得美曲普汀纯品。可进一步通过冻干、离子交换层析或疏水层析去除蛋白样品中的有机溶剂，并将样品置换于适当的溶剂之中。
取实施例3制备并经洗涤的包涵体(IBs)，按实施例4.1所述方法溶解包涵体，疏水层析(HIC)复性并初步纯化得美曲普汀粗品；再按上述方法经阴离子交换层析(DEAE)结合反相制备色谱(C8)制备美曲普汀纯品。重复三次实验，汇总纯化得率如表2所示，每升发酵液最终可得美曲普汀纯品均在500mg以上。
表2美曲普汀纯化得率汇总表
所得美曲普汀纯品分别采用RP-HPLC法(用95％的A相(1％TFA)和5％的B相(100％乙腈-1％TFA)预平衡C18分析柱(Waters公司产品，规格：4.6×250mm，5μm，货号：WAT106151)，UV检测设置在214nm处，柱温为常温，上样50μg，B相从5％到95％线性梯度洗脱，洗脱30分钟，流速为1ml/min。)和SEC-HPLC法(平衡液：85％0.25 M PB缓冲液-15％乙腈，pH7.0。平衡液平衡TSKgel G2000SWxl凝胶柱(TOSOH公司产品，规格：7.8×300mm，5μm，货号：08540)至压力稳定，上样80μg到100μg，再用平衡液洗脱40分钟，UV检测值设定在280nm，流速为0.3ml/min。)进行纯度检测。
纯度检测结果显示，RP-HPLC法检测纯度为100％(图3)，SEC-HPLC法检测纯度为99.25％(图4)。
将所得美曲普汀纯品委托上海中科新生命生物科技有限公司采用Edman降解法检测N末端15个氨基酸序列，采用质谱法检测非还原和还原相对分子量，并进行二硫键配对分析。
N末端测序15个循环后检测N端序列为：NH2-Met-Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile，与理论序列一致；非还原和还原相对分子量检测结果如图5所示，检测所得非还原美曲普汀相对分子量为16156.00Da，而理论分相对子量为16157.64Da，相差不到2Da，在误差范围之内。还原后相对分子量为16158.00Da，与还原前的16156.00Da相差2Da，正好是2个氢原子的分子量，证明制备的美曲普汀有一个二硫键形成；二硫键分析结果如图6所示，经蛋白酶解后液质联用分析，结合软件和人工分析，综合结果证明，送检样品中存在与理论配对方式相符的1种二硫键(C97-C147)。
参照原研药(Myalept，Amylin公司产品)说明书上记载的方法检测美曲普汀纯品生物活性，结果显示美曲普汀纯品生物活性(EC50值：2.875ng)与市售的重组人瘦素蛋白(R&D公司产品，货号：398-LP-01M)生物活性(EC50值：3.381ng)相当，表明制备得到的美曲普汀生物活性很好。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 武汉海特生物制药股份有限公司
<120> 一种美曲普汀的制备方法
<130> WH2006133
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys
1 5 10 15
Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser
20 25 30
Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro
35 40 45
Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln
50 55 60
Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser
85 90 95
Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly
100 105 110
Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser
115 120 125
Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser
130 135 140
Pro Gly Cys
145
<210> 2
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgccgatcc agaaggttca agacgatacc aagaccctga tcaaaaccat tgtgacccgt 60
atcaacgaca ttagccacac ccagagcgtg agcagcaagc aaaaagttac cggtctggac 120
ttcatcccgg gcctgcaccc gattctgacc ctgagcaaga tggatcagac cctggcggtg 180
taccagcaaa ttctgaccag catgccgagc cgtaacgtta tccaaattag caacgacctg 240
gagaacctgc gtgatctgct gcacgtgctg gcgtttagca aaagctgcca cctgccgtgg 300
gcgagcggtc tggaaaccct ggatagcctg ggtggcgttc tggaggcgag cggttatagc 360
accgaagtgg ttgcgctgag ccgtctgcag ggcagcctgc aagacatgct gtggcagctg 420
gatctgagcc cgggctgc 438
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggagatata catatggtgc cgatccagaa gg 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcagccgga tcattagcag cccgggctca g 31
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatgatccg gctgctaac 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catatgtata tctccttc 18
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggtaatac catatggtgc cgatccagaa gg 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtaccgag ctcattagca gcccgggctc ag 32
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taatgagctc ggtaccctcg agggatc 27
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catatggtat tacctcttaa taat 24
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcccgggga tccatggtgc cgatccagaa gg 32
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgcaggtcg acattagcag cccgggctca g 31
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taatgtcgac ctgcagccaa gcttc 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catggatccc cgggaattcc tcct 24