阅读说明：本技术 一种分泌型fndc5蛋白及其制备方法和应用 (Secretory FNDC5 protein and preparation method and application thereof ) 是由 唐东起 李世武 李慧 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种分泌型FNDC5蛋白,不含跨膜结构域,可直接分泌并释放到血液中；所述分泌型FNDC5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；本发明的分泌型FNDC5蛋白结构简单,获得方便；本发明的分泌型FNDC5蛋白能用于治疗肥胖相关代谢紊乱；高脂喂养的肥胖小鼠模型腹腔注射分泌型FNDC5重组蛋白后,可有效改善葡萄糖和胰岛素耐量,表明此蛋白可明显改善肥胖患者糖代谢紊乱和胰岛素抵抗；可明显缓解脂肪肝发生,降低血浆胆固醇、游离脂肪酸及甘油三酯的水平,表明此蛋白可改善肥胖患者脂代谢紊乱。本发明的分泌型FNDC5蛋白,可以作为新的治疗代谢性疾病的药物靶点进行开发。(The invention discloses a secretory FNDC5 protein, which does not contain a transmembrane domain and can be directly secreted and released into blood; the amino acid sequence of the secretory FNDC5 protein is SEQ ID NO: 1; the secretory FNDC5 protein has simple structure and is convenient to obtain; the secreted FNDC5 protein can be used for treating obesity-related metabolic disorders; after secretory FNDC5 recombinant protein is injected into the abdominal cavity of an obese mouse model fed with high fat, the glucose and insulin tolerance can be effectively improved, which shows that the protein can obviously improve the glucose metabolism disorder and the insulin resistance of obese patients; can obviously relieve the occurrence of fatty liver and reduce the levels of plasma cholesterol, free fatty acid and triglyceride, which indicates that the protein can improve the lipid metabolism disorder of obese patients. The secretory FNDC5 protein can be developed as a new drug target for treating metabolic diseases.)

一种分泌型FNDC5蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体说是一种分泌型FNDC5蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

肥胖是一种常见的代谢疾病，威胁着全世界人民的健康，肥胖症患者并发心脑血管疾病，2型糖尿病，呼吸窘迫综合症和肌肉骨骼疾病的几率较高。人体能量摄入高于能量耗损，剩余热量便会以脂肪组织形式储存于体内，当脂肪组织含量超过生理需要时，遂演变成肥胖。因此，增加能量消耗已逐渐成为潜在预防及治疗肥胖及其相关疾病的有力手段。

鸢尾素(irisin)是2012年发现的一种含有112个氨基酸残基的蛋白，是由一种未知蛋白酶切割III型纤连蛋白域包含蛋白5(FNDC5)的产物。目前发现的三种FNDC5亚型均包含一段跨膜结构域(exon5)，将蛋白锚定在细胞膜上，鸢尾素即为FNDC5的C末端切割产物，该产物序列在哺乳动物中高度保守，鼠、兔和人的鸢尾素氨基酸序列完全相同。鸢尾素可由骨骼肌、心肌、肝脏、肾脏、神经、脂肪、胰腺等多种组织细胞产生，研究认为鸢尾素在改善肥胖等各种代谢性疾病等方面具有良好的应用前景。目前推测鸢尾素是被一种未知的蛋白酶从FNDC5上酶切下来并释放到血液中的，但至今尚未发现这个蛋白酶及确切的酶切位点，因此鸢尾素释放途径仍备受质疑。

不含跨膜结构域并可直接分泌的FNDC5亚型及其在脂质代谢中的应用目前还尚未报道过。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种分泌型FNDC5蛋白及其制备方法和应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种分泌型FNDC5蛋白，该分泌型FNDC5蛋白不含跨膜结构域，可直接分泌并释放到血液中；所述分泌型FNDC5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

一种分泌型FNDC5蛋白的制备方法，包括以下步骤：

①从fndc5基因不同位点设计引物，进行PCR，跑电泳，检测出除了已知的fndc5异构体外，还有其他的异构体；

其中引物为：

上游引物FNDC5-F：TGAGGCCGAGAAGATGGCCTCTAA；

下游引物FNDC5-R：TAGTGACAATGGCTGCTCTCTGCC；

②将检测到的新的异构体蛋白对应的cDNA序列转化入DH5a感受态细胞，涂板，挑取单克隆，提取质粒，酶切确认后，转入x-33酵母菌中，YPD培养基用来扩大培养，用含0.5％甲醇的BMMH溶液来蛋白表达，最后将蛋白表达上清进行纯化，得到分泌型FNDC5蛋白。

优选的制备方法，步骤②中，将检测到的新的异构体蛋白对应的cDNA序列与PPIC_ZaA质粒连接，转化入DH5a感受态细胞。

本发明还包括一种分泌型FNDC5蛋白的应用，在治疗肥胖相关代谢紊乱中的应用。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明的分泌型FNDC5蛋白是一种不含跨膜结构域的能直接分泌的新蛋白，结构简单，获得方便；本发明的分泌型FNDC5蛋白能用于治疗肥胖相关代谢紊乱；高脂喂养的肥胖小鼠模型腹腔注射分泌型FNDC5重组蛋白后，可有效改善葡萄糖和胰岛素耐量，表明此蛋白可明显改善肥胖患者糖代谢紊乱和胰岛素抵抗；可明显缓解脂肪肝发生，降低血浆胆固醇、游离脂肪酸及甘油三酯的水平，表明此蛋白可改善肥胖患者脂代谢紊乱。本发明的分泌型FNDC5蛋白，可以作为新的治疗代谢性疾病的药物靶点进行开发。

附图说明

图1为葡萄糖耐量实验结果示意图；

图2为胰岛素耐受实验结果示意图；

图3为血清中胆固醇在三组小鼠血清中的含量示意图；

图4为血清中甘油三酯在三组小鼠血清中的含量示意图；

图5为血清中游离脂肪酸在三组小鼠血清中的含量示意图；

图6为三组小鼠肝脏油红染色示意图。

具体实施方式

PPIC_ZaA质粒购买于(美国Invitrogen公司)。

实施例

一种分泌型FNDC5氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

MPPGPCPRAALRLWLGCVCFALVQADAPVNVTVRHLKANSAVVSWDVLEDEGFAISQQKKDVRMLRFIQEVNTTTRSCALWDLEEDTEYIVHVQAISIQGQSPASEPVLFKTPREAEKMASKNEVPFANVDDTGKHNQRAALQNAEGAKA；

分泌型FNDC5蛋白的制备方法：

⑴从fndc5基因不同位点设计引物，进行PCR，跑电泳，检测出除了已知的fndc5异构体外，还有其他的异构体；具体的，

引物为：

上游引物FNDC5-F：TGAGGCCGAGAAGATGGCCTCTAA；

下游引物FNDC5-R：TAGTGACAATGGCTGCTCTCTGCC；

提取INS-1细胞RNA，逆转录成cDNA，使用上述引物做PCR。

PCR反应体系：H₂O:36.75ul

Go Taq DNA Polymerase:0.25ul(Promega公司)

5x Go Taq Buffer:10ul(Promega公司)

FNDC5-F:1ul

FNDC5-R:1ul

cDNA:1ul

Total 50ul

94℃5分钟；

94℃30秒，56℃30秒，72℃，1分钟；30循环；

72℃7分钟。

PCR反应产物跑电泳，发现除了原来已知大小的fndc5基因条带，还有一条比它短的条带；

送公司测序，测序结果为一条新的来源于fndc5基因的序列。

⑵针对此种新异构体序列设计特异性引物，进行PCR扩增，将此PCR产物转化入DH5a感受态细胞，涂板，挑取单克隆，提取质粒，酶切确认后，转入x-33酵母菌中，YPD培养基用来扩大培养，用含0.5％甲醇的BMMH溶液来蛋白表达，最后将蛋白表达上清进行纯化，具体的：

2.1PCR扩增分泌型fndc5。

其中引物为：

上游引物FNDC5-F：GAATTCATGCCCCCAGGGCCGTGCGCCTG；

下游引物FNDC5-R：TCAGGCCTTGGCAGAGCCCTCTGCTCTAGA；

反应体系与(1)中PCR反应体系相同；

2.2酶切PPIC_ZaA质粒和2.1中PCR产物。

酶切体系：

2.3目的基因回收(美国MpBio公司试剂盒：Geneclean II Kit)

(1)切下含有目的DNA片段的凝胶；

(2)称重；

(3)加入3倍体积的NaI,混匀，55°水浴5min，待胶全部化掉；

(4)加入10ul Glassmilk,混匀，室温下放置5min；

(5)14000rpm，5s，弃上清；

(6)加入500ul New wash，重悬，14000rpm，5s，弃上清；

(7)加入500ul New wash，重悬，14000rpm，5s，弃上清；

(8)室温放置5min，以挥发残存的酒精；

(9)加入ddH₂O(10ul)溶解DNA；

(10)离心14000rpm，1min，取上清至新EP管中，即为目的基因的PCR回收产物，测DNA浓度即可。

以上试剂均为试剂盒内试剂。

2.4回收基因连接

10ul连接体系：

目的基因回收产物1(酶切分泌型FNDC5) 2.5ul

目的基因回收产物2(酶切PPIC_ZaA质粒) 2.5ul

T4连接酶 5ul

连接产物4℃过夜。

2.5将2.4中的连接产物转化到感受态细胞中：

(1)取50ul感受态DH5a或TOP10细胞置于冰上融化；

(2)将连接产物加入到融化后的DH5a或TOP10细胞中，轻微上下颠倒混匀，然后冰上放置30min；

(3)将带有DH5a或TOP10细胞的离心管放在42度加热器上90s后再次转移到冰上放置3min；

(4)向上述离心管中加入300ul无菌无抗生物的LB培养基，37度180rpm振荡培养1h；

(5)取适量已转化完毕的DH5a或TOP10细胞涂布于含氨苄的LB培养板上，37度倒置培养12-16h；

2.6挑取单克隆，提取质粒(凯杰公司质粒提取试剂盒)

(1)柱平衡步骤：将500ul BL加入到CP4中，15000rpm离心1min，然后将管中废液倒除；

(2)将培养的菌液倒入离心管中，15000rpm离心1min，除去上清液；

(3)将500ul含RNaseA溶液PI加入带有菌体的离心管中，用涡旋振荡器悬浮细胞沉淀；

(4)将500ul P2加入3中，轻轻的上下翻转10-12次，

(5)将700ul P3加入4中，轻轻地上下翻转10-12次，至出现白色絮状沉淀，然后离心，将白色絮状物离至管底；

(6)将5中的上清倒入Cs中，然后15000rpm离心3min，将得到的溶液加入到CP4中；

(7)15000rpm离心3min，将CP4放入收集管中；

(8)将500ul PD加入到CP4中，15000rpm离心3min，再次将CP4放入收集管中；

(9)将600ul PW加入到CP4中，15000rpm离心3min，再次将CP4放入收集管中；

(10)重复9；

(11)将CP4放回收集管中，15000rpm离心3min；

(12)向CP4中吸附膜的中间位置加入200ulTB，放于室温3min，然后，15000rpm离心2min，所得到的溶液即质粒溶液，然后测浓度。

文中BL、CP4、含RNaseA溶液PI、P2、P3、Cs、PD、PW等均为试剂盒中配套溶液。

2.7将PPIC-sFNDC5转入x-33酵母菌中

2.7.1感受态x-33的制备

(1)在50ml离心管中加入10mlYPD培养基，接种x-33酵母菌种，30度300rpm振荡过夜；

(2)室温离心500g，5min，弃上清，用10ml新鲜YPD培养基重悬X-33酵母，30度300rpm振荡4-6h，使OD值达到0.6-1.0；

(3)室温离心500g，5min，弃上清；

(4)用10ml EasyComp Transformation Kit中试剂1重悬细胞；

(5)室温离心500g，5min，弃上清；

(6)用1ml试剂1重悬细胞，得到感受态x-33细胞。

2.7.2将PPIC-sFNDC5质粒转入感受态x-33细胞

(1)取50ul感受态X-33细胞置于冰上融化；

(2)向感受态细胞中加入3ug线性PPIC-sFNDC5重组质粒；

(3)再加入1ml EasyComp Transformation Kit中试剂2，震荡混匀；

(4)将混合物置于37度水浴1小时，每15min震荡混匀一次；

(5)42度水浴10min；

(6)将细胞平均分至两个离心管中，并将1ml YPD培养基加入其中；

(7)30度孵育1h以恢复zeocin活性；

(8)3000g室温离心5min，弃上清；

(9)每管用500ul EasyComp Transformation Kit中试剂重悬细胞，并将两管细胞合至一管中；

(10)3000g室温离心5min，弃上清；

(11)用100～150ul EasyComp Transformation Kit中试剂重悬细胞；

(12)将细胞抹匀在含100mg/ml zeocin的YPD板上，倒置，30度培养3～5天。

2.7.3菌落PCR验证PPIC-sFNDC5质粒转入

(1)10％SDS配置：称取1gSDS(十二烷基硫酸钠)加入10ml ddH₂O中，混匀，使其完全溶解；

(2)0.2％SDS：取20ul 10％SDS溶液加980ul水，配成1ml0.2％的SDS液。

挑取几个菌落，分别至装有100ul 0.2％SDS的EP管中，混匀，100℃煮沸5min，然后置于冰上，涡旋震匀。

反应条件：94°4分钟，94°30秒，54°30秒，72°1分钟，72°5分钟，30循环。

其中引物为：

上游引物FNDC5-F：ATGCCCCCAGGGCCGTGCGCCTG；

下游引物FNDC5-R：TCAGGCCTTGGCAGAGCCCTCTGC；

2.8 sFNDC5的表达与确认

2.8.1挑取单克隆，在10mlYPD培养基中摇18h，然后换至500mlYPD培养基中摇48h扩大培养；

2.8.2 3000g室温离心15min，用200ml含0.5％甲醇的BMMH培养基(有组氨酸的缓冲性基础甲醇培养基)重悬细胞，促进蛋白的表达；2.7.3每24h加入0.5％甲醇，每24h取样，摇菌6d结束。

2.9重组分泌型FNDC5蛋白纯化

(1)重组分泌型FNDC5用60％饱和硫酸铵沉淀；

(2)沉淀的蛋白用溶液A(25mmol/L HEPES,pH 7.9,10％甘油，0.1mol/L KCl,0.2mmol/L EDTA,and 0.5mmol/L DTT)复溶；

(3)在溶液A中透析48h；

(4)透析后的蛋白液上至concannavalin-A凝胶柱；

(5)洗脱：凝胶柱用含1.5mol/LKCL的溶液A洗脱；

(6)洗脱得到的蛋白低温冻干后，放于-80℃，备用。

将分泌型FNDC5蛋白在治疗肥胖相关代谢紊乱中的应用。

肥胖模型制造：将6周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为4组，(1)正常饮食小鼠-生理盐水组：为阴性对照组，始终给予正常饮食，8周后给予生理盐水腹腔注射2周。(2)肥胖小鼠-生理盐水组：为阳性对照组，采用高脂饮食方法制造肥胖小鼠模型，8周后给予生理盐水腹腔注射2周。(3)肥胖小鼠-分泌型FNDC5组(实验组)：采用高脂饮食方法制造肥胖小鼠模型，8周后给予重组分泌型FNDC5蛋白腹腔注射2周。

给药方式及给药浓度：将分泌型FNDC5蛋白按0.5ug/g浓度，采用腹腔注射的方式给药，每天给药，连续给药2周。

葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐受实验(ITT)：

GTT:小鼠禁食过夜后，腹腔注射葡萄糖(2.0g/kg)，分别于注射前和注射后15、30、60和120分钟测定血糖。

ITT：小鼠禁食过夜后，经腹腔注射胰岛素(0.75g/kg)，分别于注射前和注射后15、30、60和120分钟测定血糖。

图1和图2结果显示，与正常饮食生理盐水处理组小鼠相比，高脂喂养肥胖小鼠模型糖耐量和胰岛素敏感性均有不同程度的损害，即产生了糖耐量异常及胰岛素抵抗；经重组分泌型FNDC5处理后，肥胖小鼠糖耐量得到明显改善，胰岛素敏感性增强；

数据均以均值±标准误(mean±SE)表示，每组样本有9个，*P＜0.05有统计学差异，#与正常饮食-生理盐水处理组相比；*与高脂饮食-生理盐水处理组相比。

血脂检测：小鼠处死前使用异氟烷麻醉小鼠，采用眼球取血的方式进行采血，室温静置1小时，300g离心15分钟，取上层血清送公司进行血脂检测。结果如图3、图4和图5所示，肥胖小鼠-生理盐水处理组(阳性对照组)血清中总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸明显高于正常饮食小鼠-生理盐水处理组(阴性对照组)，肥胖小鼠-分泌型FNDC5处理组(实验组)血清中三个反应血脂水平的指标明显降低。

肝脏油红染色：将小鼠处死后，取肝脏组织，***固定，进行石蜡包埋、切片、油红染色等一系列步骤，最后进行扫描。如图6所示，高脂喂养肥胖小鼠肝脏油红染色发现明显的脂质沉积，经重组分泌型FNDC5处理后肝脏脂质沉积明显减轻，可以看出重组分泌型FNDC5能够明显缓解脂肪肝的进展。

序列表

<110> 山东大学第二医院

<120> 一种分泌型FNDC5 蛋白及其制备方法和应用

<141> 2019-08-28

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> PRT

<213> III型纤连蛋白域包含蛋白5(Rattus rattus)

<400> 1

Met Pro Pro Gly Pro Cys Pro Arg Ala Ala Leu Arg Leu Trp Leu Gly

1 5 10 15

Cys Val Cys Phe Ala Leu Val Gln Ala Asp Ala Pro Val Asn Val Thr

20 25 30

Val Arg His Leu Lys Ala Asn Ser Ala Val Val Ser Trp Asp Val Leu

35 40 45

Glu Asp Glu Gly Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys Lys Asp Val Arg Met

50 55 60

Leu Arg Phe Ile Gln Glu Val Asn Thr Thr Thr Arg Ser Cys Ala Leu

65 70 75 80

Trp Asp Leu Glu Glu Asp Thr Glu Tyr Ile Val His Val Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Ile Gln Gly Gln Ser Pro Ala Ser Glu Pro Val Leu Phe Lys Thr

100 105 110

Pro Arg Glu Ala Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn Glu Val Pro Phe Ala

115 120 125

Asn Val Asp Asp Thr Gly Lys His Asn Gln Arg Ala Ala Leu Gln Asn

130 135 140

Ala Glu Gly Ala Lys Ala

145 150