一种单克隆抗体、其制备方法及用途
阅读说明：本技术 一种单克隆抗体、其制备方法及用途 (Monoclonal antibody, preparation method and application thereof ) 是由 李玲 董春娜 吴冬荀 张艳宾 张蕾 张彤 李静 刘新月 肖进 齐鹏 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗猪瘟病毒E2单克隆抗体、其制备方法及用途。所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区,重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列1所示；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列2所示；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列3所示；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列4所示；轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列5所示；轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列6所示。本发明所述的单克隆抗体能特异性与猪瘟病毒E2蛋白结合,具有很好的抗原结合活性和一定的病毒中和活性,既可用于猪瘟的检测诊断又可以用于预防治疗,在开发猪瘟病毒新型诊断试剂和治疗药物中具有较好的生产应用前景。(The invention discloses a swine fever virus resisting E2 monoclonal antibody, a preparation method and application thereof. The monoclonal antibody comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the amino acid sequence of CDR1 of the heavy chain variable region is shown as a sequence 1; the amino acid sequence of CDR2 of the heavy chain variable region is shown as sequence 2; the amino acid sequence of CDR3 of the heavy chain variable region is shown as sequence 3; the amino acid sequence of CDR1 of the light chain variable region is shown as sequence 4; the amino acid sequence of CDR2 of the light chain variable region is shown as sequence 5; the amino acid sequence of CDR3 of the variable region of the light chain is shown in sequence 6. The monoclonal antibody disclosed by the invention can be specifically combined with classical swine fever virus E2 protein, has good antigen binding activity and certain virus neutralizing activity, can be used for detection and diagnosis of classical swine fever virus and prevention and treatment, and has good production and application prospects in development of novel diagnostic reagents and treatment medicines of classical swine fever virus.)
技术领域
本发明属于免疫学、分子生物学领域，涉及一种抗猪瘟病毒E2的单克隆抗体、其制备方法及用途。
背景技术
猪瘟(Classical Swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSF virus,CSFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病，其特征为发病急、高热稽留和细小血管变性，引发全身泛发型小点出血，脾梗死。不同品种、性别、年龄的猪均易感，猪瘟是严重危害养猪业的重大传染病。猪瘟的病原体猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属，同属的成员还包括牛病毒性腹泻病毒、羊边界病病毒等。猪瘟病毒基因组是长度约12.3kb的单股正链RNA，包含两端的非编码区(untranslated region,UTR)和中间一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF)，ORF编码一个大的多聚蛋白，该多聚蛋白经宿主细胞和病毒编码的蛋白酶水解加工产生具有功能的成熟蛋白，包括4种结构蛋白(Core、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中，结构蛋白E2是最主要的免疫原性蛋白，诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击，也是猪瘟基因工程疫苗研发的重要靶蛋白。
我国对猪瘟防控非常重视，2017年3月21日，农业农村部印发《国家猪瘟防治指导意见(2017-2020年)》，对猪场猪瘟的净化提出明确要求，截止2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围。免疫接种是预防和控制猪瘟发生和流行的主要措施，猪瘟疫苗质量的好坏直接影响猪瘟的免疫效果。目前，市场化的猪瘟疫苗主要有三类：一是传统的猪瘟兔化弱毒活疫苗；二是基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2的昆虫细胞-杆状病毒真核系统表达的亚单位疫苗，包括国内新疆天康的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗(Rb-03株)、国外CSF E2和
基于现有的商品化猪瘟疫苗种类和生产工艺，活病毒和/或活疫苗的抗原含量定量，即猪瘟疫苗的效力检验方法——半数荧光抗体感染剂量(50％fluorescent antibodyinfective does,FAID50)是病毒学领域活病毒效价测定的经典方法，具有测定结果准确、方法稳定、操作简单等特点，可以通过猪瘟病毒E2单克隆抗体利用间接或直接免疫荧光的方法测定猪瘟病毒活病毒的含量。配套猪瘟E2亚单位疫苗和重组活病毒载体疫苗CP7_E2alf的血清学鉴别诊断需要同时具有抗猪瘟病毒Erns和E2单克隆抗体，以区别出疫苗免疫动物，淘汰野毒感染动物。此外，以高特异性和亲和力为基础的猪瘟病毒E2单克隆抗体是阻断ELISA试剂盒的开发的核心。同时，野毒感染动物的治疗对抗猪瘟病毒E2单克隆抗体中和活性具有较高的要求。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种特异性结合猪瘟病毒E2的单克隆抗体，具有高亲和力和较好特异性的特点。
本发明的目的之二在于提供上述抗体的重链、轻链或其片段。
本发明的目的之三在于提供编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或其片段，以及***这些核酸分子以用于重组表达上述抗体的重组载体和重组细胞。
本发明的目的之四在于提供上述单克隆抗体的制备方法和用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种特异性结合猪瘟病毒E2的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成，重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成，即重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
重链CDR1具有序列1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
重链CDR2具有序列2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
重链CDR3具有序列3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
轻链CDR1具有序列4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
轻链CDR2具有序列5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
轻链CDR3具有序列6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
优选地，重链CDR1具有序列1所示的氨基酸序列；重链CDR2具有序列2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有序列3所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有序列4所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有序列5所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有序列6所示的氨基酸序列。
进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有序列7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有序列8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有序列7所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有序列8所示的氨基酸序列。
包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的单克隆抗体结合性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。
本发明的单克隆抗体还包括猪源与非猪源抗体，以及具有与上述单克隆抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。
进一步，所述单克隆抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。
Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。
Fab′是指包含了部分铰链区的Fab片段。
F(ab′)2是指Fab′的二聚体。
Fv是指含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。
单链抗体是指由轻链可变区和重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。
本发明公开的单克隆抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强抗体的免疫原性。
本发明的单克隆抗体可以被设计为在Fc区域内包含修饰，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。
本发明还提供了编码前面所述的单克隆或其抗原结合片段的核酸分子，所述核酸分子包括编码单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体重链的核苷酸序列，或编码单克隆抗体轻链的核苷酸序列。
本发明的编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和/或沉默的变体，核苷酸的替换、缺失和***也包含在内。
具体地，编码重链CDR1的核酸分子序列如序列11所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如序列12所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如序列13所示，编码重链可变区的核酸分子序列如序列9所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如序列14所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如序列15所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如序列16所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如序列10所示。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含前面所述的核酸分子，此外，还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
本发明中“载体”依次是指，可将编码某蛋白的多聚核苷酸***其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌体、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体和动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒等。一种载体可能含有多种控制表达元件，包括启动子序列、逆转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本发明的具体实施例中，重组载体是将前面所示的核酸分子***pCAGGS载体(Nova lifetech,Singapore)中构建而成。
本发明还提供了前面所述的重组载体的构建方法，所述方法包括将前面所述的核酸分子***pCAGGS载体中。
具体地，本发明的重组载体的构建方法如下所示：
分别将信号肽(编码序列如序列17)、抗体可变区和NCBI公布的对应恒定区序列合并，在基因序列C端加上终止密码子TAA后人工合成表达重链和轻链的完整基因序列，分别将其利用分子克隆的方法克隆至表达载体pCAGGS，分别构建得到重组表达质粒。
具体的，所述重组表达载体为将序列表中序列20所示的DNA片段或者序列表中序列21所示的片段***到表达载体pCAGGS的EcoRⅠ和BglⅡ酶识别位点之间，分别构建得到表达重链的重组表达质粒pC-HC或表达轻链的重组表达载体pC-LC。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中导入了前面所述的核酸分子或转染了前面所述的重组载体。
本发明中“重组细胞”一词是指导入核酸分子或载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，BHK细胞，HEK293细胞等。
在本发明的具体实施方案中，所述重组细胞是HEK293细胞。
本发明还提供了一种利用前面所述的重组细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的重组细胞并回收所述抗体，所述方法包括以下步骤：将重组表达载体转染宿主细胞或上述重组细胞，通过多次收获所述的转染后的细胞培养上清，和/或将重组细胞在目标培养基中进行培养，收获培养上清进行纯化，获得上述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合部分。
本发明还提供了一种通过上述方法产生的抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测猪瘟病毒E2蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)制备或提取含有猪瘟病毒E2蛋白的样品；
2)将步骤1)获取的样品与前面所述的特异性猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合片段接触或孵育；
3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
包含上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体的检测产品也在本发明的保护范围内。所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是能够检测出猪瘟病毒E2表达的检测产品均包括在本发明的范围之内。
具体的，本发明提供了用于猪瘟病毒活病毒效价和/或活疫苗效力检验的试剂盒，其特征在于，包括：上述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或者FITC标记的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体。
具体的，所述用于猪瘟病毒活病毒效价和/或活疫苗效力检验的试剂盒包括下述1)或2)：
1)上述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体和FITC标记抗抗体；
2)FITC标记上述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体和抗抗体。
所述FITC标记抗抗体优选为FITC标记羊抗鼠IgG二抗；所述抗抗体优选为羊抗鼠IgG二抗。
所述试剂盒中，还包括细胞培养板、PK-15细胞、细胞培养液、间接免疫荧光方法所需的其他试剂，如固定液，PBS等。
本发明还提供了利用上述试剂盒对猪瘟病毒活病毒和/或活疫苗效力检验方法，其特征在于，包括：抗猪瘟病毒E2单克隆抗体作为一抗，或者FITC标记的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体。
猪瘟病毒活病毒和/或活疫苗效力检验的方法包括如下步骤：
1)将长满单层的PK-15细胞，用EDTA-胰酶消化分散，将制备成的传代细胞悬液铺至96孔细胞培养板；
2)24h以内，96孔细胞培养板中的细胞密度在80-95％时，用PBS清洗一遍细胞待用；
3)用含2％FBS的DMEM培养基将待测冻干猪瘟活疫苗回溶或者猪瘟病毒活病毒并按10倍梯度稀释，将稀释液分别以100μl/孔加入步骤2)中的细胞培养板中，至于37℃、5％CO2培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；
4)培养72h后，用间接免疫荧光方法检测步骤3)细胞中的病毒蛋白E2的表达
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内的液体，用PBS清洗2遍；
②弃去PBS，用吸水纸将细胞培养板中残液吸附干净，加入固定液(体积比甲醇：丙酮＝1:1)，在-20℃固定30min；
③弃去固定液，用PBS清洗2遍；
④加入用PBS稀释的上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体，在37℃孵育90min；
⑤弃去一抗，用PBS清洗2遍，加入用PBS稀释的FITC标记羊抗鼠IgG二抗，在37℃孵育60min；
⑥弃去二抗，用PBS清洗2遍，至于荧光显微镜下观察细胞培养板中每孔的荧光情况；
5)按照所述间接免疫荧光情况，利用病毒滴度FAID50/0.1ml的计算公式为：
LogFAID50＝高于50％阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之差；
稀释度对数之差＝低于50％阳性孔率最高稀释度的对数-高于50％阳性孔率最高稀释度的对数；
距离比例＝(高于50％阳性孔率的百分数-50)/(高于50％阳性孔率的百分数-低于50％阳性孔率的百分数)；
本发明还提供了一种用于猪瘟病毒抗体检测的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括：HRP标记的上述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或上述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体。
具体的，所述的用于猪瘟病毒抗体检测的阻断ELISA试剂盒，包括：HRP标记上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体和猪瘟病毒E2蛋白包被的酶联反应板。
其中，所述猪瘟病毒E2蛋白的序列为自序列表中序列18的氨基端41-379位氨基酸残基序列；为了方便表达纯化，其氨基酸连接有gp67信号肽、C端连接有6×His标签，所示gp67信号肽序列为自序列表中序列18的氨基端1-41位氨基酸残基序列。
所述试剂盒中还可以包括阳性对照血清和阴性对照血清，所述阳性对照血清为猪瘟活疫苗免疫后采集的猪血清，阴性对照血清为无特定病原体(SPF)猪血清。
所述试剂盒中还可以包括：样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、和终止液。
样品稀释液含有5mg/ml酪蛋白的0.01M的磷酸盐缓冲液(pH值7.4)。
底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液。
底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液。
20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
终止液为2M的硫酸溶液。
根据需要，试剂盒中还可以包括样品稀释板(2块、96孔/块)，用于样品的稀释。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的用途，所述用途包括以下任一项：
1)制备猪瘟病毒抗体检测的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括：HRP标记的所述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体；
2)在制备猪瘟病毒诊断制剂中的应用；
3)在制备猪瘟治疗制剂中的应用。
本发明所述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体，能特异性、高效结合猪瘟病毒E2蛋白，不与包括牛病毒性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病等外源病毒发生交叉反应，具有很好的抗原结合活性和一定的病毒中和活性，既可用于猪瘟的检测诊断又可以用于预防治疗，在开发猪瘟病毒新型诊断试剂和治疗药物中具有较好的生产应用前景。
附图说明
图1为间接免疫荧光筛选猪瘟病毒E2单克隆抗体结果图；
图2为利用间接免疫荧光试验比较本发明抗猪瘟病毒E2单克隆抗体与商品化产品的结果图；
图3为不同细胞上本发明抗猪瘟病毒E2单克隆抗体的特异性荧光反应结果图；
图4为亲和层析纯化抗猪瘟病毒E2单克隆抗体的SDS-PAGE电泳结果图；
图5为利用抗猪瘟病毒E2单克隆抗体对猪瘟病毒E2蛋白的Western blotting结果图；
图6为抗猪瘟病毒E2单克隆抗体与BVDV、PCV2和PRV的交叉反应；
图7为利用抗猪瘟病毒E2单克隆抗体与猪瘟病毒疫苗C株中和反应后的间接免疫荧光图。
图8为本试剂盒酶联免疫板加样示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详尽描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和伦理道德可获取的生物材料都可按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、猪瘟病毒E2蛋白的制备及抗猪瘟病毒E2单克隆抗体的筛选
1、表达猪瘟病毒E2蛋白的杆状病毒穿梭载体的构建
含有杆状病毒gp67信号肽的猪瘟病毒E2蛋白序列如序列表中序列18所示，序列18中，自氨基端第1-40为杆状病毒gp67信号肽，41-379为猪瘟病毒E2蛋白的胞外域(GenBank:AY775178.2，2441～3457位核苷酸对应690～1028位氨基酸序列)，380-385为6×His标签。
将以上氨基酸序列根据昆虫密码子偏好性由上海捷瑞生物工程有限公司人工合成(序列如序列表中序列19所示)，并通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶克隆至pFastBac1载体(Invitrogen公司)，构建得到穿梭载体pFastBac1-tE2。
2、表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒的拯救和扩增
(1)转化：取穿梭载体pFastBac1-tE2 1μl(约100ng)加入50μl大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，轻轻弹击几下Ep管以使质粒和感受态细胞混匀，将Ep管置于冰上冰浴30min；在42度水浴热激90秒后立即放在冰上冷却1～2min；加入800μl无抗LB培养基，37度以220rpm的速度培养4h。
(2)蓝白斑筛选：取以上菌液50μl涂布含有50μg/ml卡纳霉素、7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素(KTG三抗)，以及100μg/ml的Bluo-gal、40μg/ml IPTG的LB平板，将平板置于37度培养箱培养48h后，挑取白斑于500μl KTG三抗LB培养基，37度、220rpm培养过夜；用接种环取1环该菌液，在含有KTG三抗和Bluo-gal、IPTG的LB平板上划线，将平板置于37度培养箱培养48h；如此步骤，重复至少3次，得到重组大肠杆菌阳性菌。
(3)重组Bacmid的获取：取重组大肠杆菌阳性菌液50μl接种5ml KTG三抗LB培养基，在37度、220rpm摇菌培养过夜(16h)。将菌液移至1.5ml Ep管，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。按照TIANGEN质粒小提试剂盒说明书进行(3)～(5)操作：
向留有菌体的Ep管中加入250μl溶液P1，悬浮菌体；向Ep管中加入250μl溶液P2，轻柔地上下翻转混匀6-8次，使菌体充***解；加入350μl溶液P3，出现白色絮状沉淀，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min；用移液器将500μl上清液转移至一新的Ep管，等体积加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀，12000rpm离心5min；取500μl上层液体转移至一新的Ep管，等体积加入氯仿，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min；取400μl上层液体转移至一新的Ep管，加入1/10体积的3M乙酸钠，然后加入2.5倍体积的乙醇，上下颠倒混匀，-20度过夜沉淀；将上一步置于-20度的Ep管取出，4度、12000rpm离心15min，然后加入1ml 75％乙醇溶液清洗一遍，4度、12000rpm离心5min，尽量弃上层液体，室温干燥10min；向Ep管底部加入100μl去离子水，室温防止2min后用移液器轻轻吹打均匀，取2μlBacmid DNA测其浓度。
(4)表达猪瘟病毒tE2的重组杆状病毒的拯救：Sf9细胞传代并铺至6孔细胞培养板中，待贴壁单层细胞长至90％左右(约1×106)，PBS清洗细胞两次，然后加入1.8ml无血清Grace培养基；取两个1.5mL的无菌Ep管，每管加入100μl Grace培养基，向其中一管中加入10μl脂质体Lipofectamine 3000，另一管中加入5μg Bacmid DNA和10μl P3000试剂，然后将两支管中的液体混匀并放置5min；将以上混合溶液加入6孔细胞培养板中，轻轻摇晃混匀，于28℃培养箱持续培养72h后，收获第一代重组杆状病毒2ml，记为P1，避光4度保存。
(5)表达猪瘟病毒tE2的重组杆状病毒的扩增：向100mm细胞培养皿中处于对数期的1×107贴壁昆虫细胞Sf9加入1ml P1代重组杆状病毒，72h收获培养上清10ml，记为P2代病毒；Sf9悬浮细胞1升传代至2升的玻璃三角瓶，当细胞长至对数期(密度为2×106/ml)时，以体积比1:100加入P2代病毒，在感染后72h收获培养上清，记为P3代病毒。
3、猪瘟病毒E2蛋白的表达和纯化
(1)tE2蛋白的表达：昆虫细胞High Five悬浮细胞800ml传代至2升的玻璃三角瓶，当细胞长至对数期(密度为2.5×106/ml)时，以体积比1:4加入P3代病毒200ml进行扩大培养，在培养48h后5000rpm离心20min收获培养上清。
(2)tE2蛋白的纯化：将培养上清1000ml用0.22μm的滤膜过滤后用蠕动泵以1ml/min的流速上样到HisTrap HP 5ml镍柱预装柱，上样完毕后在AKTA纯化仪用含20mM咪唑的缓冲液(20mM NaCl,50mM Tris-HCl,pH 8.0)洗去杂蛋白和未结合的蛋白，然后用含300mM咪唑的缓冲液洗下目的蛋白；将上一步纯化得到的样品在AKTA纯化仪经过GE HiLoadSuperdex 16/600 200pg柱子纯化得到目的蛋白。
4、猪瘟病毒E2单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株的筛选
(1)动物免疫：首免，将上述猪瘟病毒E2蛋白(100μg/ml)与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，取1ml于Balb/c小鼠颈背部皮下多点注射；二免，首免4周后，将猪瘟病毒E2蛋白(100μg/ml)与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，取0.5ml于Balb/c小鼠腹腔注射；三免，参照二免，在二免后4周三免；四免，在三免后2周直接取0.5ml猪瘟病毒E2蛋白(100μg/ml)腹腔注射。
(2)骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合：首先在细胞融合前1天取未免疫的小鼠准备饲养细胞，用注射器将含10％FBS的HAT培养基注射到处死小鼠的腹腔，反复轻柔腹腔部位后吸出腹腔中的培养液，细胞计数后铺于96孔细胞培养板中，在37度、5％CO2培养箱中培养；其次是准备骨髓瘤SP2/0细胞，融合的当天将SP2/0细胞以1000rpm、5min离心收集，计数后待用；细胞融合，取四免3天后的小鼠处死，取其脾脏研磨，用200μm铜网过滤后以1000rpm、5min离心收集，用无血清DMEM培养基重悬后计数；将以上1×108脾细胞和3×107SP2/0细胞混合，1000rpm、5min离心后弃上清，缓慢加入1ml 50％PEG1000溶液，然后立即加入25ml无血清DMEM培养基轻柔混匀；1000rpm、5min离心后弃上清，加入30ml HAT细胞培养液重悬后铺于上述有饲养细胞的96孔细胞培养板中，在37度、5％CO2培养箱中培养1周。
(3)间接免疫荧光试验筛选猪瘟病毒E2单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株：取培养上清作为一抗孵育接种了猪瘟病毒疫苗C株的PK-15细胞，用FITC标记的羊抗鼠二抗孵育后，荧光显微镜下选出具有明显绿色荧光细胞形态的孔(图1)，然后对应地挑选出96孔细胞培养中的阳性杂交瘤细胞株6N10。将阳性细胞孔的细胞进行亚克隆后扩大培养。
将上述筛选到的亲和力和特异性较好的一个抗体6N10，通过间接免疫荧光的方法与商品化猪瘟病毒E2单克隆抗体(韩国金诺JBT)进行比较，结果显示本发明涉及的猪瘟病毒E2单克隆抗体6N10孵育的PK-15细胞在荧光显微镜表现出更强的绿色荧光(图2)，说明其亲和力较好。同时，通过间接免疫荧光的方法分别在感染了猪瘟病毒的PK-15、ST细胞孵育单抗6N10，结果表明抗体在两种不同细胞上都能和病毒抗原发生特异性反应(图3)。
实施例2、抗猪瘟病毒E2单克隆抗体基因测序及单克隆抗体表达系统的建立
为了在后续使用过程中稳定抗体品质，对包括抗体纯度、反应性、浓度等参数进行质量控制，我们利用哺乳动物表达系统体外表达、纯化抗猪瘟病毒E2单克隆抗体。
1、单克隆抗体基因测序
(1)单克隆抗体杂交瘤细胞株6N10总RNA提取：取杂交瘤细胞悬液300μl，加入1mlTrizol，上下颠倒混匀，加入200μl(1/5Trizol体积)氯仿后混匀，静置5min，4度、12000rpm离心15min；取上层水相600μl，加入等体积异丙醇后混匀，室温静置10min，4度、12000rpm离心10min；弃去液体，用预冷75％的乙醇清洗一遍，4度、12000rpm离心5min；弃去乙醇，干燥后加入20μl DEPC水溶解RNA。
(2)抗体重链和轻链可变区序列的测定：按照逆转录试剂盒(Thermofisher)说明书进行逆转录，得到cDNA；取2μl cDNA作为模板，分别通过重链可变区通用引物(VH-1:5′-GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3′；VH-2:5′-ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3′)和轻链可变区通用引物(VL-1:5′-GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC-3′；VL-2:5′-CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′)扩增目的片段VH、VL，分别将VH、VL片段装入T载体pMD18-T(Takara)，利用通用引物M13测序(北京擎科生物科技有限公司)，获得抗体重链和轻链可变区序列。
2、重组载体的构建
(1)抗体信号肽序列(核苷酸序列如序列17所示)：自GenBank Accession Versionnumber为ABY60458.1的氨基端第1～24位氨基酸残基序列。
(2)抗体重链恒定区氨基酸序列
324个氨基酸，IgG重链，自GenBank Accession Version number为AXV45364.1的氨基端第157～480位氨基酸残基序列。
(3)抗体轻链恒定区氨基酸序列
105个氨基酸，IgGκ链，自GenBank Accession Version number为AAA39012.1的氨基端第2～106位氨基酸残基序列。
(4)重组表达载体的构建：首先，分别将信号肽、抗体可变区和NCBI公布的对应恒定区序列合并，在基因序列C端加上终止密码子TAA后人工合成表达重链和轻链的完整基因序列(重链完整基因序列如序列20所示，轻链的完整基因序列如序列21所示)，分别将其利用分子克隆的方法通过EcoRⅠ和BglⅡ将片段克隆至表达载体pCAGGS，分别构建得到重组表达质粒pC-HC和pC-LC，这一步直接交由基因合成公司完成(上海捷瑞生物工程有限公司)。
3、抗猪瘟病毒E2抗体的表达与纯化
(1)载体DNA的转染：在直径为15cm的细胞培养皿中接种HEK293细胞，当细胞密度长至1.2×107～1.5×107时，用浓度为1mg/ml的PEI(Alfa Aesar公司)转染上述重组表达质粒pC-HC和pC-LC。
具体操作如下：于4ml Ep管中加入1ml OPTI-MEM培养基，然后依次加入30μg重组表达质粒pC-LC和20μg重组表达质粒pC-HC，轻柔混匀；于另一个1.5ml Ep管中加850μlOPTI-MEM培养基，然后加入150μl PEI转染试剂后混匀；然后将含有转染试剂的OPTI-MEM培养基加入含有重组质粒的Ep管中轻柔混匀，室温放置15min后加入铺了HEK293细胞的培养皿中，在37℃、5％CO2条件下培养5h，换液为无血清DMEM培养基。
(2)抗猪瘟病毒E2抗体的表达：上述转染重组DNA质粒的HEK293细胞培养72h后，收获培养上清，保存4℃待用；在细胞培养皿中再次加入无血清DMEM培养基，继续培养72h后收获上清。
(3)抗猪瘟病毒E2抗体的纯化、定量与保存：将两次收获的培养上清利用HiTrapProtein G HP(GE公司)柱子纯化。首先将细胞培养上清在4℃、12000rpm离心以去除细胞碎片，然后用0.22μm的滤膜过滤后用蠕动泵以1ml/min的流速上样到HiTrap Protein GHP5ml预装柱；上样完毕后在AKTA纯化仪用Bind buffer(20mM磷酸钠，pH 7.0)洗去杂蛋白和未结合的抗体，然后将Elution buffer(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗下目标物800μl中加入200μl中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)；将收集到每一管目的样品取20μl，加入5μl5×loading buffer，沸水浴10min后置于冰上；取10μl样品SDS-PAGE电泳，结合SDS-PAGE电泳结果将含有目的抗体的样品混合，将混合后的样品用PBS将抗体浓度调整至2mg/ml后保存于-80℃。纯化后的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体SDS-PAGE结果如图4所示，在55kDa和25kDa附近有单一的条带，抗体纯度在95％以上。
实施例3、抗猪瘟病毒E2单克隆抗体对抗原的亲和活性和特异性检测
1、利用Western blotting检测抗体与猪瘟病毒E2抗原的反应活性
将实施例1中获得的猪瘟病毒E2蛋白用PBS稀释成1μg/μl，取20μl蛋白，加入5μl5×loading buffer，沸水浴10min后置于冰上；取5μl样品SDS-PAGE电泳，120V电泳约80min，小心地取下凝胶后转至PVDF膜，冰浴、80V的条件下运行90min；取出PVDF膜，用PBS清洗一遍，加入5％的脱脂奶4℃封闭过夜；用PBS室温清洗10min，加入抗猪瘟病毒E2单克隆抗体(1:1000稀释)，室温孵育90min，用PBS清洗1×4次(10min/次)；加入1:1000稀释的HPR标记羊抗鼠二抗(Sigma公司)，室温孵育60min，用PBS清洗1×4次(10min/次)后化学发光显色。显色结果如图5所示，可以看到在40～50kDa间出现清晰、单一的条带，大小与E2抗原一致，说明上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体与E2抗原的反应活性和特异性较好。
2、利用间接ELISA检测抗体与猪瘟病毒的反应活性
(1)猪瘟病毒疫苗C株的培养与保存：取1瓶(20头份)商品化猪瘟活疫苗株(中牧股份江西省生物药厂)，用2ml DMEM培养基复融，4℃、5000rpm离心后取上清接入T75ST贴壁细胞，37℃、5％CO2培养箱培养72h后收获培养上清，即猪瘟病毒C株，1ml/支分装后冻于-80℃保存备用。
(2)将在增殖培养的猪瘟病毒疫苗株原液以100μl/孔直接加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，4℃放置过夜，使猪瘟病毒与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白的PBS缓冲液，37℃封闭处理2h，甩干后，待酶联反应板干燥后用铝箔纸进行封袋，置2～8℃保存备用。
用PBS将上述抗猪瘟病毒单克隆抗体进行倍比稀释，以100μl/孔加入以上包被有病毒抗原的酶标板，37℃反应30min，用PBST洗涤液洗板4次，拍干后，向每孔加入1:5000稀释的兔抗鼠IgG-HRP标记物(Sigma公司)，37℃反应30min，用洗涤液4次，拍干后，向每孔加入底物液A(为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液)和底物液B(为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)各50μl底物工作液，37℃避光反应15min；向每孔加入50μl终止液(2M的硫酸溶液)，振荡混匀终止反应；15min内测定每孔的OD450nm值。以吸光度值＞阴性对照(即洗板培养液)×2.1倍为阳性判定标准。测定结果显示，初始浓度为2μg/ml的抗体依次作倍比稀释反应后的OD450nm值分别为：1.186、3.077、3.485，抗体与猪瘟病毒有强烈信号反应，并且呈剂量依赖性。
3、利用间接ELISA检测抗体与猪瘟病毒E2蛋白的反应活性
将上述猪瘟病毒E2蛋白溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液稀释浓度至2μg/ml，加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，4℃下放置过夜，使E2抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白的PBS缓冲液，37℃封闭处理2h，甩干后，待酶联反应板干燥后用铝箔纸进行封袋，置2～8℃保存备用。
用PBS将上述抗猪瘟病毒单克隆抗体进行倍比稀释，以100μl/孔加入以上包被有病毒抗原的酶标板，37℃反应30min，用PBST洗涤液洗板4次，拍干后，向每孔加入1:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)，37℃反应30min，用洗涤液4次，拍干后，向每孔加入底物液A(为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液)和底物液B(为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)各50μl底物工作液，37℃避光反应15min；向每孔加入50μl终止液(2M的硫酸溶液)，振荡混匀终止反应；15min内测定每孔的OD450nm值。以吸光度值＞阴性对照(即洗板培养液)×2.1倍为阳性判定标准，测定结果显示，初始浓度为2μg/ml的抗体依次作倍比稀释与2μg/ml的E2蛋白反应后的OD450nm值分别为：1.985、3.167、(+)，抗体与猪瘟病毒E2蛋白有强烈信号反应，并且呈剂量依赖性。
4、利用间接免疫荧光检测抗体与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的交叉反应
将上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体分别与接种了猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪圆环2型和猪伪狂犬病病毒的PK-15细胞反应，用间接免疫荧光的方法检测抗体与其他猪病原体的交叉反应。
具体操作如下：将PK-15细胞传代接种于24孔细胞培养板，24h后细胞密度约为95％，以MOI为1分别接种猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪圆环2型和猪伪狂犬病病毒，同时设置4个不接毒对照孔；在37℃、5％CO2条件下培养24h，取出细胞培养板，显微镜下观察细胞的形态和病变情况；弃去培养上清，用PBS清洗2次，吸水纸吸干细胞培养板中残留液体，加入预冷的固定液(体积比甲醇:丙酮＝1:1)，-20℃放置30min，用PBS清洗2次；加入3％BSA封闭液，37℃孵育30min，用PBS清洗2次；将上述抗猪瘟病毒抗体、牛病毒性腹泻病毒高免血清、抗猪圆环2型和抗猪伪狂犬病病毒gB抗体用PBS作1:200稀释，然后分别加入24孔细胞培养板对应孔中，37℃孵育90min，用PBS清洗2次；加入对应的FITC标记二抗，37℃孵育60min，用PBS清洗2次，在荧光显微镜下观察细胞中病毒蛋白的表达情况。结果显示：上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体只能与接种猪瘟病毒的PK-15细胞发生特异性结合，且没有接种病毒的PK-15细胞作为背景对照基本上看不到绿光(图6所示)。
实施例4、利用抗猪瘟病毒E2单克隆抗体对猪瘟病毒活病毒的效力检验
鉴于抗体对猪瘟病毒的高亲和力和特异性，可利用上述单克隆抗体通过间接免疫荧光的方法对猪瘟病毒活病毒和/或活疫苗进行效力检验。
具体操作步骤如下：将长满单层的PK-15细胞，用EDTA-胰酶消化分散，将制备成的传代细胞悬液铺至96孔细胞培养板；24h以内，96孔细胞培养板中的细胞密度在80％～95％时，用PBS清洗一遍细胞待用；用2ml含2％FBS的DMEM培养基将冻干猪瘟活疫苗(中牧股份江西生物药厂，1901003、1901005、和1903008批次)回溶，取100μl按10倍梯度稀释，将系列稀释液以100μl/孔加入96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；培养72h后，用间接免疫荧光方法检测细胞中的病毒蛋白E2的表达，即
①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内的液体，用PBS清洗2遍；
②弃去PBS，用吸水纸将细胞培养板中残液吸附干净，加入固定液(体积比甲醇：丙酮＝1:1)，在-20℃固定30min；
③弃去固定液，用PBS清洗2遍；
④加入用PBS稀释的上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体一抗，在37℃孵育90min；
⑤弃去一抗，用PBS清洗2遍，加入用PBS稀释的FITC标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)，在37℃孵育60min；
⑥弃去二抗，用PBS清洗2遍，至于荧光显微镜下观察细胞培养板中每孔的荧光情况，按照所述间接免疫荧光情况，计算病毒效价。
间接免疫荧光阳性判定标准：与设立的不接毒正常细胞胞浆未出现绿色荧光一样的细胞培养孔，判定为阴性孔；而接毒的细胞胞浆能观察到形态清晰的特异性绿色荧光细胞培养孔，判定为阳性孔。
病毒滴度FAID50/0.1ml的计算公式：
LogFAID50＝高于50％阳性孔率最高稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之差
稀释度对数之差＝低于50％阳性孔率最高稀释度的对数-高于50％阳性孔率最高稀释度的对数
距离比例＝(高于50％阳性孔率的百分数-50)/(高于50％阳性孔率的百分数-低于50％阳性孔率的百分数)
结果显示：3批猪瘟活疫苗的效检结果为：10 4.57FAID50/头份、10 4.71FAID50/头份和104 . 67FAID50/头份(表1)。该结果表明，可利用上述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体通过间接免疫荧光的方法对猪瘟活疫苗进行效力检验，避免了现行疫苗效检动物法中因动物个体差异和饲养环境等因素造成的检测误差，具有检测速度快、费用低、结果稳定可靠的优点。
表1.猪瘟活疫苗稀释度及阳性孔观察结果
实施例5、病毒中和试验
将PK-15细胞传代并铺至96孔细胞培养板中，24h内细胞长至85％～95％时进行试验。将上述纯化的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体(2mg/ml)2倍系列稀释，作12个稀释度和8孔重复。将稀释的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体与实施例2中100FAID50的猪瘟病毒等体积混匀，于37℃水浴孵育1h。孵育结束后，将抗猪瘟病毒E2单克隆抗体和病毒复合物接种96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。72h后取出细胞培养板，弃去培养上清，用猪瘟病毒特异性抗体(中国兽医药品监察所)进行间接免疫荧光：将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内的液体，用PBS清洗2遍；弃去PBS，用吸水纸将细胞培养板中残液吸附干净，加入固定液(体积比甲醇:丙酮＝1:1)，在-20℃固定30min；弃去固定液，用PBS清洗2遍；加入用PBS稀释的上述抗猪瘟病毒特异性一抗，在37℃孵育90min；弃去一抗，用PBS清洗2遍，加入用PBS稀释的FITC标记抗猪IgG二抗(Sigma公司)，在37℃孵育60min；弃去二抗，用PBS清洗2遍，至于荧光显微镜下观察细胞培养板中每孔的荧光情况，计算病毒中和效价。
结果显示：在1:2、1:4和1:8抗体稀释孔中未观察到细胞绿色荧光，且在1:16抗体稀释孔中检测到少量发绿色荧光的细胞(图7所示)，表明抗体的中和效价为1:12，具有猪瘟病毒中和活性。
实施例6、一种猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
1、制备猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒
(1)制备抗原包被板：将实施例1中纯化后E2蛋白用pH9.6的碳酸盐溶液稀释成1μg/ml的工作液，以100μl/孔加入到96孔聚苯乙烯酶联反应板，2～8℃条件放置8～12h，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入pH7.4、含有10mg/ml牛血清白蛋白的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3h，甩干液体，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
(2)制备HRP标记的猪猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体：将猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与HRP进行偶联，然后用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，加等量的优质丙三醇，-20℃保存。
具体操作步骤如下：
①将5mg HRP溶于0.2ml含有1.25％戊二醛的0.1M PBS缓冲液(pH值6.8)中，室温放置偶联18h，充分透析出去多余戊二醛；
②加生理盐水至1ml，然后加入2.5mg纯化的猪瘟病毒E2特异性单克隆抗体，以及0.1ml 1M的碳酸盐缓冲液(pH值9.6)，2～8℃放置24h；
③加入0.1ml 0.3M的赖氨酸溶液，室温放置2h；
④用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，通过离心去除沉淀，上清即为酶结合物，用酶标记物稀释液按一定比例稀释后即为酶标记物的工作液(0.5μg/ml)。
(3)阳性对照血清：猪瘟活疫苗免疫后采集的猪血清作为试剂盒的阳性对照血清(1管、1.5ml/管)。
(4)阴性对照血清：无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管、1.5ml/管)。
(5)样品稀释液的制备为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M的磷酸盐缓冲液(pH值7.4)(1瓶、24ml/瓶)。
(6)底物液A的制备为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶、12ml/瓶)。
(7)底物液B的制备为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶、12ml/瓶)。
(8)20倍浓缩洗涤液的制备为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(2瓶、50ml/瓶)。
(9)终止液的制备：2M的硫酸溶液(1瓶、12ml/瓶)。
(10)根据需要，试剂盒中还可以有样品稀释板(2块、96孔/块)，用于样品的稀释。
2、猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法
(1)平衡：将试剂盒从冷藏条件取出，室温放置平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
(2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液。
(3)样品稀释：用样品稀释液将待检血清进行2倍稀释，阴、阳性对照血清已稀释，可直接使用。
(4)加样：取抗原包被板，将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清加入到抗原包被板中，100μl/孔；每份待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，加样过程时间跨度应尽量短。如图8所示加样：N表示加阴性对照血清，P表示加阳性对照血清，S1、S2、S3、S4等表示加各待检血清。
(5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应60min。
(6)洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
(7)加酶：各孔加入上述制备的酶标记物工作液100μl。
(8)温育：置37℃温箱，反应30min。
(9)洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
(10)显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
(11)每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应，15min内测定结果。
(12)试验成立条件：阴性对照的平均OD450应大于0.50。阳性对照的阻断率应大于50％。
(13)判定：在酶标仪上测各孔OD450nm值，样品阻断率％＝100×(阴性对照平均值－样品值)÷阴性对照平均值，结果判定：样品阻断率％≤30，判为阴性；30﹤阻断率％﹤40，判为可疑；阻断率％≥40，判为阳性。
3、敏感性试验
使用按照上述步骤1所述方法制备的3批猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒(批次ZM2019001、ZM2019002、ZM2019003)，按照步骤2的使用方法对猪瘟病毒野毒感染猪血清32份，疫苗免疫血清50份进行检测，实验结果见表2，本发明的试剂盒共检测出80份阳性，有2份未检出，结果表明本试剂盒对猪瘟病毒野毒感染猪血清32份，疫苗免疫血清50份敏感性为97.6％。
表2.敏感性检测结果
试剂盒批号
检出率
敏感性
ZM2019001
80/82
97.6％
ZM2019002
80/82
97.6％
ZM2019002
80/82
97.6％
4、特异性试验
按照步骤2试剂盒使用方法，用上述3批猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒(批次ZM2019001、ZM2019002、ZM2019003)对60份健康猪血清、2份牛病毒性腹泻病毒阳性血清(BVDV)、2份猪伪狂犬病毒阳性血清(PRV)、2份猪圆环病毒阳性血清(PCV2)，分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如表3所示，对60份健康猪血清的检测结果均为阴性，3批试剂盒的特异性均为100.00％；对2份牛病毒性腹泻病毒阳性血清(BVDV)、2份猪伪狂犬病毒阳性血清(PRV)、2份猪圆环病毒阳性血清(PCV2)检测结果均为阴性，3批试剂盒的特异性均为100.00％。
表3.猪瘟病毒E2阻断ELISA抗体检测试剂盒特异性检测结果
5、符合率试验
用IDEXX进口试剂盒的猪瘟病毒抗体检测试剂盒和本发明试剂盒同时对60份健康猪血清、32份猪瘟病毒感染血清和50份疫苗免疫血清同时进行检测，以比较2种试剂盒检测结果的符合率。
IDEXX进口试剂盒操作方法：
在使用前，所有的试剂盒组分都必须恢复到18～26℃。试剂应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。不同的样品要更换吸头。
(1)取出包被板，在记录表上记录样本的位置。如果只需使用部分板条，则将需要的板条拆下进行实验，剩余的板条放在附赠的自封袋中，并放入干燥剂，封好口后置于2～8℃保存。
(2)分别将50μl样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。
(3)分别将50μl阴性对照加到相应的对照孔中，加两孔。
(4)分别将50μl阳性对照加到相应的对照孔中，加两孔。
(5)分别将50μl的被检样品加入到剩下的检测孔中，注意每个样本都使用不同吸头。
(6)轻弹微量反应板或用振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。
(7)在18～26℃孵育2h(±5min)或过夜孵育(12～18h)。无论选择哪种孵育方式，都要将微量反应板用盖板封闭或于湿箱中室温孵育，避免液体挥发。
(8)用300μl左右的洗涤液洗涤每个板孔3次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，在最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体。在加入下一个试剂前，避免孔壁变干。
(9)在每孔中加入100μl酶标抗体。
(10)用盖板封闭反应板或置于湿盒中在18～26℃下孵育30min(±2min)。
(11)重复步骤8。
(12)每个反应孔中加入100μl的底物溶液N.12。
(13)18～26℃条件下避光放置10min(±1min)。
(14)每个反应孔中加入100μl的终止液N.3终止反应。
(15)在450nm处测定样本以及对照的吸光度值，也可用双波长(450nm和650nm)测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。
(16)计算结果：分别计算阴性对照和阳性对照平均值，要求阴性对照平均值﹥0.500，阳性对照阻断率％﹥50。样品阻断率％＝100×(阴性对照平均值－样品值)÷阴性对照平均值。
(17)结果判定：样品阻断率％≤30，判为阴性；30﹤阻断率％﹤40，判为可疑；阻断率％≥40，判为阳性。
本发明试剂盒和IDEXX进口试剂盒的猪瘟病毒抗体检测试剂盒对60份健康猪血清、32份猪瘟病毒感染血清和50份疫苗免疫血清的检测结果见表4，本发明试剂盒和IDEXX进口试剂盒的猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测阳性的血清份数均为77份，检测为阴性的血清份数均为60份。142份待检血清中，两种试剂盒检测结果一致的血清份数是137份，符合率为96.5％。
表4.符合率试验结果
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 一种单克隆抗体、其制备方法及用途
<130> WHOI201037
<170> Patent-In 3.5
<160> 21
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Glu Ser Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asn Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 9
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tccagcagtc cggcgccgag ctggtgaggc ccggcgcctc tgtgaccctg 60
tcttgcaagg cctccggcta caagttcacc gattatgaaa tgcactgggt gaagcagacc 120
cctgtgcacg gcttggagtg gattggcgcc atcgagagcg aaactggggg cacggcgtac 180
aaccaaaagt tcaaggataa ggccacactc accgccgaca catctagctc taccgcctac 240
atggaactgc gcagcctcac atctgaggac tctgccgtgt actactgcac ccggaacggg 300
aactattacg ctatggatta ctggggccag ggcacatctg tgacagtgtc tagc 354
<210> 10
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacgtggtga tgacccagac ccccctgtcc ctgcccgtga gcctgggcga ccaggcctcc 60
atcagctgcc gctcttcgca aagcctcgta cactcgaacg gaaacacata cttgcactgg 120
tacttgcaga agcccggcca gagccccaag ctgctgatct acaaagtgtc gaaccgcttc 180
agtggcgtgc ccgacagatt cagcggctcc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagagtgg aggccgagga cctgggcgtg tacttttgta gccagaatac gcacgtaccg 300
ttcacgttcg gctccggcac caagctggag atcaagcggg cc 342
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gattatgaaa tgcac 15
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccatcgaga gcgaaactgg gggcacggcg tacaaccaaa agttcaagga t 51
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacgggaact attacgctat ggattac 27
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgctcttcgc aaagcctcgt acactcgaac ggaaacacat acttgcac 48
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaagtgtcga accgcttcag t 21
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agccagaata cgcacgtacc gttcacg 27
<210> 17
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgcctatgg gctccctcca gccactcgcc acactgtacc tgctgggaat gctcgtggcc 60
agcgtgctcg cc 72
<210> 18
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr
35 40 45
Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly
50 55 60
Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn
65 70 75 80
Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr
85 90 95
Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly
100 105 110
Ala Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn
115 120 125
Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro
130 135 140
Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu
145 150 155 160
Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val
165 170 175
Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val
180 185 190
Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val
195 200 205
Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly
210 215 220
Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln
225 230 235 240
Val Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly
245 250 255
Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly
260 265 270
Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile
275 280 285
Ser Ala Glu Gly Ser His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys
290 295 300
Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys
305 310 315 320
Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe
325 330 335
Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser
340 345 350
Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp
355 360 365
Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser Asp Tyr Phe His His His His His
370 375 380
His
385
<210> 19
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60
agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120
cgtttggctt gcaaggagga ctacagatac gccatcagca gcaccaacga gatcggattg 180
ttgggcgccg gcggattgac caccacctgg aaggagtact cccacgactt gcagttgaac 240
gacggaaccg tcaaggctat ctgcgtcgcc ggttcattca aggtgaccgc tctgaacgtc 300
gtgtcccgta gatacctggc ctccttgcac aagggagctt tgctgacctc cgtgaccttc 360
gagcttttgt tcgacggtac aaaccctagc accgaggaga tgggcgacga cttcggtttc 420
ggcctctgcc cattcgacac ctccccagtc gtcaagggaa agtacaacac caccctgttg 480
aacggtagcg ctttctacct cgtctgccct atcggatgga ccggagtcat cgagtgcacc 540
gctgtgtccc caaccaccct cagaaccgag gtcgtgaaga ccttccgtag agagaagcca 600
ttccctcaca gaatggactg cgtgaccacc accgtggaga acgaggactt gttctactgc 660
aagttgggcg gtaactggac ctgcgtcaag ggtgagcctg tggtctacac cggcggccag 720
gtgaagcagt gcaagtggtg cggattcgac ttcaacgagc cagacggttt gcctcactac 780
ccaatcggta agtgcatctt ggctaacgag accggttaca gaatcgtgga cagcaccgac 840
tgcaacaggg acggtgtggt catcagcgct gagggtagcc acgagtgctt gatcggaaac 900
accaccgtca aggtccacgc tagtgacgag aggctcggcc ctatgccatg ccgcccaaag 960
gagatcgtgt ccagcgctgg tcctgtgcgt aagacctcct gcaccttcaa ctacgctaag 1020
accctgaaga acaagtacta cgagccccgc gacagctact tccagcagta catgctgaag 1080
ggtgagtacc agtactggtt cgacttggac gtgaccgaca ggcactccga ctacttccac 1140
caccaccacc accactaa 1158
<210> 20
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgcctatgg gctccctcca gccactcgcc acactgtacc tgctgggaat gctcgtggcc 60
agcgtgctcg cccaggtgca gctccagcag tccggcgccg agctggtgag gcccggcgcc 120
tctgtgaccc tgtcttgcaa ggcctccggc tacaagttca ccgattatga aatgcactgg 180
gtgaagcaga cccctgtgca cggcttggag tggattggcg ccatcgagag cgaaactggg 240
ggcacggcgt acaaccaaaa gttcaaggat aaggccacac tcaccgccga cacatctagc 300
tctaccgcct acatggaact gcgcagcctc acatctgagg actctgccgt gtactactgc 360
acccggaacg ggaactatta cgctatggat tactggggcc agggcacatc tgtgacagtg 420
tctagcgcca agacaacccc accatctgtg tacccactcg ccccaggcag cgccgcccag 480
accaactcta tggtgacact gggctgcctc gtgaagggct acttccccga gcccgtgaca 540
gtgacctgga acagcggctc tctgtctagc ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctccag 600
agcgacctgt acacactgtc ttctagcgtg accgtgccat cttctacctg gccatccgag 660
acagtgacat gcaacgtggc ccaccccgcc tctagcacaa aggtggacaa gaagattgtg 720
ccacgcgact gcggctgcaa gccttgcatt tgcacagtgc ccgaggtgtc ctccgtgttc 780
attttccctc caaagccaaa ggacgtgctg accattacac tcacccctaa ggtgacatgc 840
gtggtggtgg acatttctaa ggacgaccct gaggtgcagt tctcttggtt cgtggacgac 900
gtggaggtgc acacagccca gacccagcct agggaggagc agttcaacag cacattcaga 960
tccgtgtccg agctgcctat catgcaccag gactggctga acggcaagga gttcaagtgc 1020
cgggtgaaca gcgccgcctt ccctgcccca attgaaaaga ccatttctaa gacaaagggc 1080
agacctaagg cccctcaggt gtacacaatt cctcctccaa aggagcagat ggccaaggac 1140
aaggtgtccc tcacatgcat gattaccgac ttcttccctg aggacattac agtggagtgg 1200
cagtggaacg gccagcctgc cgagaactac aagaacaccc agcctattat ggacaccgac 1260
ggctcttact tcgtgtactc taagctgaac gtgcagaagt ctaactggga ggccggcaac 1320
accttcacat gctctgtgct ccacgagggc ctccacaacc accacacaga gaagtctctg 1380
tctcactctc ctggcaagta a 1401
<210> 21
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgcctatgg gctccctcca gccactcgcc acactgtacc tgctgggaat gctcgtggcc 60
agcgtgctcg ccgacgtggt gatgacccag acccccctgt ccctgcccgt gagcctgggc 120
gaccaggcct ccatcagctg ccgctcttcg caaagcctcg tacactcgaa cggaaacaca 180
tacttgcact ggtacttgca gaagcccggc cagagcccca agctgctgat ctacaaagtg 240
tcgaaccgct tcagtggcgt gcccgacaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgacttc 300
accctgaaga tcagcagagt ggaggccgag gacctgggcg tgtacttttg tagccagaat 360
acgcacgtac cgttcacgtt cggctccggc accaagctgg agatcaagcg ggccgacgcc 420
gcccccaccg tgagcatctt ccccccctcc agcgagcagc tgaccagcgg cggcgcctcc 480
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tacacctgcg aggccaccca caagaccagc accagcccca tcgtgaagtc cttcaaccgg 720
aacgagtgct aa 732