阅读说明：本技术 一种木瓜总三萜的制药用途 (Pharmaceutical application of total triterpene of pawpaw ) 是由 贺海波 石孟琼 廖勇 宋利华 张媛媛 何毓敏 卫巧 程凡 邹坤 张继红 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种木瓜总三萜的制药用途。具体包括木瓜总三萜在制备促进UVB损伤的人皮肤成纤维细胞HDF细胞增殖、细胞迁移、抑制细胞凋亡的药物上的应用。以及制备促进UVB损伤的人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞增殖、细胞迁移、抑制细胞凋亡的药物上的应用。以及制备治疗术后切割损伤伤口愈合的药物上的应用。以及制备治疗受损皮肤再生修复的药物上的应用。具有显著的治疗效果。(The invention discloses a pharmaceutical application of total triterpene of pawpaw. The application of the total triterpene of the pawpaw in preparing the medicament for promoting the proliferation and cell migration of human skin fibroblast HDF cells damaged by UVB and inhibiting apoptosis is concretely included. And the application of the HUVECs in preparing medicaments for promoting the cell proliferation and cell migration of human umbilical vein endothelial cells damaged by UVB and inhibiting cell apoptosis. And the application in preparing the medicine for healing the postoperative cutting injury wound. And the application in preparing the medicine for treating the regeneration and repair of the damaged skin. Has obvious curative effect.)

一种木瓜总三萜的制药用途

技术领域

本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及木瓜总三萜水凝胶的制备工艺及其应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，具有代谢、吸收、防护、体温调节、分泌和感觉等多项重要功能，同时受到外界化学、物理等因素刺激时容易造成损伤。皮肤发生急性创伤后的愈合过程十分容易造成瘢痕和创面收缩，影响正常的皮肤功能、美观和心理，因此皮肤损伤后的再生和功能修复成为临床医师关注的焦点问题。尤其是皮肤全层缺损患者，主要通过临近皮肤上皮细胞迁移和残存的皮肤附件的干细胞再生使伤口愈合，若患者皮肤缺损面积过大或全层皮损伤/缺损时，不能完全再生，创面形成瘢痕、延迟愈合或者不愈合，使患者发生严重功能障碍，患者承受痛苦较大。因此促进皮肤创面愈合和减少瘢痕生成显得尤为重要。

目前，用于皮肤创面愈合治疗的方法主要是基因工程的应用、生物工程材料的使用、纳米技术的应用、营养辅助治疗等，但存在疗效个体差异大、价格高、病人依从性差、愈合后易出现瘢痕等诸多不足，中药治疗皮肤病历史悠久，经验丰富，开创了许多不同的用药剂型，近年来随着科学的发展，中药药物提取用于治疗皮肤病也收到了很好的疗效。

木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的干燥近成熟果实，又名皱皮木瓜、铁脚梨、贴梗海棠、宣木瓜、酸木瓜、空儿木瓜、木瓜实等。木瓜有“百益之果”之称，是一种非常重要的观赏和食用的植物，被列为***2003年首批认定的药食两用的食品之一。其被用作一种可食用的果实，又被应用于美容化妆品和保健品领域。木瓜总三萜是皱皮木瓜中的重要活性成分，其主要成分包括齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸、3-O-乙酰熊果酸、3-O-乙酰坡模醇酸、山楂酸、委陵菜酸和Speciosaperoxide。木瓜总三萜在鲜果中含量在0.32%以上，富集后的木瓜三萜总含量为90.02%。具体方法在我们已获授权的专利：一种皱皮木瓜提取物、提取方法及其应用(专利号：ZL201510660595.8)有详细的介绍。

本发明发明人经过广泛深入的研究，将从土家药物皱皮木瓜中提取得到的木瓜总三萜，并且经过研究发现木瓜总三萜可有效促进人真皮成纤维细胞和血管内皮细胞增殖、迁移，对受损的皮肤创面具有较好的促进皮肤修复、伤口愈合和减少瘢痕生成，未见有明显的毒副作用。目前还未见有与本发明制备的木瓜总三萜的制备方法及促进受损皮肤创面愈合的相关报道。

本发明的一个目的是提供一种将木瓜总三萜的制药用途。具体制药用途如下：

木瓜总三萜在制备促进UVB损伤的人皮肤成纤维细胞HDF细胞增殖、细胞迁移、抑制细胞凋亡的药物上的应用。

木瓜总三萜在制备促进UVB损伤的人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞增殖、细胞迁移、抑制细胞凋亡的药物上的应用。

木瓜总三萜在制备术后切割损伤伤口愈合的药物上的应用。

木瓜总三萜在制备治疗受损皮肤再生修复的药物上的应用。

本制备方法制备得到的皱皮木瓜总三萜具有良好的生物相容性、无毒性、抵抗原性和良好的生物降解性，可有效的避开药物肝脏的首过效应，且可以实现定向给药、作用持久，因而更具应用开发前景。

本发明的有益效果

本发明制备得到的木瓜总三萜在人真皮成纤维细胞、血管内皮细胞损伤模型具有较好的促进增殖、抑制细胞凋亡和促进细胞迁移作用；对手术切割致大鼠皮肤损伤模型和皮肤外伤患者具有良好的治疗作用，可显著促进皮肤创面愈合、缩短伤口愈合时间，促进受损皮肤再生修复、减少瘢痕生成。

附图说明

图1为木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞增殖的影响(MTT检测分析)(与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)

图2木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞增殖的影响(平板克隆形成实验)(A：细胞克隆图片，B：克隆形成个数；与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图3木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞凋亡的影响(A：细胞凋亡图片，B：细胞凋亡数；与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图4木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞迁移的影响(划痕实验)(A：细胞迁移图片，B：迁移面积；与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图5木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞增殖的影响(MTT检测分析)(与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图6木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞增殖的影响(平板克隆形成实验)(A：细胞克隆图片，B：克隆形成个数；与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图7木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞凋亡的影响(A：细胞凋亡图片，B：细胞凋亡数；与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图8木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞迁移的影响(划痕实验)(A：细胞迁移图片，B：迁移面积；与正常组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01；与UVB组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；n=4)。

图9木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠创面愈合时间的影响(与模型组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；与疤痕灵组比较：^† P＜0.05，^†† P＜0.01；n=10)。

图10木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠大鼠创面愈合速率的影响(与模型组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01；与疤痕灵组比较：^† P＜0.05，^†† P＜0.01；n=10)。

图11木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠皮肤病理形态的影响。

下面结合具体的实验例，具体说明木瓜总三萜对皮肤细胞损伤具有较好的促进增殖、抑制细胞凋亡和促进细胞迁移作用；对动物皮肤损伤模型及皮肤外伤患者可显著促进促进皮肤创面愈合、缩短伤口愈合时间，促进受损皮肤再生修复、减少瘢痕生成。

实验例1

下面结合具体的实验例，具体说明木瓜总三萜促进UVB损伤的人皮肤成纤维细胞(HDF)细胞增殖、细胞迁移、抑制细胞凋亡作用。

试验方法

1）实验细胞

细胞株本次实验采用人皮肤成纤维细胞(HDF)购买自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5%CO₂培养箱中生长，实验时取对数生长期细胞。

2）方法

（1）细胞培养

培养正常HDF细胞，培养液为含10%进口胎牛血清的DMEM培养液，恒温37℃，5%CO₂，相对饱和湿度条件，无菌培养。每日观察细胞生长情况，单层细胞贴壁达80%左右时进行传代。传代时弃上清，PBS清洗细胞2-3次，弃PBS，加入2mL 0.25%胰蛋白酶进行消化3min，加入含血清培养液终止消化，将贴壁细胞轻轻吹下，成为细胞悬液，1400rpm离心4min，弃上清，加入新鲜培养液将离心细胞吹打成单细胞悬液，传代比例为1:3，传入培养瓶继续培养。实验时取对数生长期细胞。

（2）中波紫外线(UVB)损伤的HDF细胞模型的建立及分组

将HDF细胞培养在含10%进口胎牛血清的DMEM培养液中，当细胞长至对数生长期时，将细胞浓度为1×10⁵个/mL的单细胞悬液接种于96孔板，培养24h后，进行紫外线照射，照射强度为0.4mW/cm²，照射时间为250s，最终总照射剂量为100mJ/cm²(照射剂量=照射强度×照射时间)。将UVB损伤的HDF细胞随机随机分为UVB组、木瓜总三萜(2.5、5、10、20、40、80μg/mL)组和UVB组、木瓜总三萜(5、10和20μg/mL)组，另设未经UVB照射的HDF细胞作为正常组。。实验前用二甲基亚砜(DMSO)将木瓜总三萜100mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜过滤后4℃保存备用。

（3）MTT检测木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞增殖的影响

HDF细胞的培养方法和分组见（2）。将各给药加入相应的浓度的木瓜总三萜后，分别培养24h和48h后每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，培养4h后吸尽培养液，加入150μL DMSO，490nm波长测定OD值。

（4）平板克隆形成实验检测木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞增殖的影响

实验分正常组，UVB组、木瓜总三萜5μg/mL组、木瓜总三萜10μg/mL组、木瓜总三萜20μg/mL组，每组3个复孔。HDF单细胞悬液以300个每孔接种于6孔板中，培养24h细胞贴壁后，木瓜总三萜各剂量组加入木瓜总三萜(5、10、20μg/mL)，每孔中培养液为3mL，每隔三天换液，换液的同时加入相应浓度木瓜总三萜，5%CO₂，恒温37℃，相对饱和湿度条件下培养2周左右，除正常组外，各组进行紫外线照射，照射强度为0.4mW/cm²，照射时间为250s，最终总照射剂量为100mJ/cm²，继续培养24h，然后结晶紫染色，计算克隆形成个数。

（5）Hoechst 33258染色检测木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞凋亡的影响

5×10⁵个/mL的HDF单细胞悬液1mL接种于六孔板中，待细胞贴壁后加入药物处理，细胞分组见（2）。除正常组外，各组进行紫外线照射，照射强度为0.4mW/cm²，照射时间为250s，最终总照射剂量为100mJ/cm²，将各给药加入相应的浓度的木瓜总三萜(5、10和20μg/mL)培养24h后，弃去孔中培养液，加入0.5mL 4%多聚甲醛固定液，固定10min；PBS洗涤2遍后再加入1mL Hoechst 33258染色液，摇床轻晃，染色5分钟；用PBS洗涤2遍，吸尽液体。荧光显微镜下检测拍照。

（6）划痕实验检测木瓜总三萜对HDF迁移增殖的影响

取处于对数生长期的HDF细胞以15×10⁵个/mL接种于6孔板，使用无菌的200μL枪头垂直在6孔板中划3条划痕，然后用PBS清洗，再按照（2）中分组对细胞进行相应浓度的木瓜总三萜(5、10和20μg/mL)处理，培养24h后观察划痕宽度的变化，并使用相应图像处理软件分析划痕宽度。

（7）统计学分析

统计每组数据，均以均数±标准差(±s)表示。数据分析在SPSS21.0统计软件包上进行，以单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异，P<0.05说明差异具有统计学意义。每实验重复4次。

试验结果

1）木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞增殖的影响

MTT结果显示，UVB照射对HDF细胞有明显的抑制增殖作用，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(2.5、5、10和20μg/mL)处理后，对UVB损伤的HDF细胞具有明显的促进增殖作用，40和80μg/mL木瓜总三萜抑制了HDF细胞的增殖。提示低浓度木瓜总三萜可促进HDF细胞增殖，高浓度木瓜总三萜可抑制其增殖活性。根据现有研究，确定了木瓜总三萜的适宜浓度(20μg/mL以下)和处理时间(24h)，以供进一步的体外研究(见图1)。

平板克隆形成实验结果显示，UVB照射可明显抑制HDF细胞克隆数，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(5、10和20μg/mL)处理后，可明显增加UVB损伤的HDF细胞克隆数，与UVB组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)(见图2)。

2）木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞凋亡的影响

Hoechst 33258染色结果显示，正常对照组细胞呈现弱蓝色荧光，形态均一完整，染色质分布均匀。UVB损伤模型组中可见较多强蓝色荧光染色细胞，可观察到典型的调亡小体，染色质浓缩，核碎裂成大小不等的圆形小体等表示细胞凋亡的现象；其细胞凋亡数目明显增多，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(5、10和20μg/mL)处理后该种现象减弱并且随着木瓜总三萜剂量的增大，正常形态的细胞增多，其凋亡特征越不明显，其细胞凋亡数目明显减少，与UVB组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)(见图3)。

3）木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞迁移的影响

划痕实验结果显示：UVB照射明显抑制了细胞的迁移能力，细胞愈合能力显著下降，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(5和20μg/mL)处理后能明显促进UVB损伤的HDF细胞迁移，划痕周边的细胞迁移至中央划痕区的距离明显减小，愈合能力明显升高，与UVB组比较具有显著性差异(P<0.01)(见图4)。

试验结论

由木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞影响实验可知，木瓜总三萜可显著促进UVB损伤的HDF细胞增殖、抑制其细胞凋亡、促进其细胞迁移。实验结果显示木瓜总三萜对UVB损伤的HDF细胞具有较好的保护作用。

实验例2

下面结合具体的实验例，具体说明木瓜总三萜促进UVB损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞增殖、细胞迁移、抑制细胞凋亡作用。

试验方法

1）实验细胞

细胞株本次实验采用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购买北京中国医学科学院基础医学研究所，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5%CO₂培养箱中生长，实验时取对数生长期细胞。

2）方法

（1）细胞培养

培养正常HUVECs细胞，培养液为含10%进口胎牛血清的DMEM培养液，恒温37℃，5%CO₂，相对饱和湿度条件，无菌培养。每日观察细胞生长情况，单层细胞贴壁达80%左右时进行传代。传代时弃上清，PBS清洗细胞2-3次，弃PBS，加入2mL 0.25%胰蛋白酶进行消化3min，加入含血清培养液终止消化，将贴壁细胞轻轻吹下，成为细胞悬液，1400rpm离心4min，弃上清，加入新鲜培养液将离心细胞吹打成单细胞悬液，传代比例为1:3，传入培养瓶继续培养。实验时取对数生长期细胞。

（2）中波紫外线(UVB)损伤的HUVECs细胞模型的建立及分组

将HUVECs细胞培养在含10%进口胎牛血清的DMEM培养液中，当细胞长至对数生长期时，将细胞浓度为1×10⁵个/mL的单细胞悬液接种于96孔板，培养24h后，进行紫外线照射，照射强度为0.4mW/cm²，照射时间为250s，最终总照射剂量为100mJ/cm²(照射剂量=照射强度×照射时间)。将UVB损伤的HUVECs细胞分别随机分为UVB组、木瓜总三萜(2、4、8、16、32、64μg/mL)组和UVB组、木瓜总三萜(4、8和16μg/mL)组，另设未经UVB照射的HUVECs细胞作为正常组。实验前用二甲基亚砜(DMSO)将木瓜总三萜水凝胶配成100mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜过滤后4℃保存备用。

（4）平板克隆形成实验检测木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞增殖的影响

实验分正常组，UVB组、木瓜总三萜4μg/mL组、木瓜总三萜8μg/mL组、木瓜总三萜16μg/mL组，每组3个复孔。HUVECs单细胞悬液以300个每孔接种于6孔板中，培养24h细胞贴壁后，木瓜总三萜各剂量组加入木瓜总三萜(4、8、16μg/mL)，每孔中培养液为3mL，每隔三天换液，换液的同时加入相应浓度木瓜总三萜，5%CO₂，恒温37℃，相对饱和湿度条件下培养2周左右，除正常组外，各组进行紫外线照射，照射强度为0.4mW/cm²，照射时间为250s，最终总照射剂量为100mJ/cm²，继续培养24h，然后结晶紫染色，计算克隆形成个数。

（5）Hoechst 33258染色检测木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞凋亡的影响

5×10⁵个/mL的HUVECs单细胞悬液1mL接种于六孔板中，待细胞贴壁后加入药物处理，细胞分组见（2）。除正常组外，各组进行紫外线照射，照射强度为0.4mW/cm²，照射时间为250s，最终总照射剂量为100mJ/cm²，将各给药加入相应的浓度的木瓜总三萜(4、18、16μg/mL)培养24h后，弃去孔中培养液，加入0.5mL 4%多聚甲醛固定液，固定10min；PBS洗涤2遍后再加入1mL Hoechst 33258染色液，摇床轻晃，染色5分钟；用PBS洗涤2遍，吸尽液体。荧光显微镜下检测拍照。

（6）划痕实验检测木瓜总三萜对HUVECs迁移增殖的影响

取处于对数生长期的HUVECs细胞以15×10⁵个/mL接种于6孔板，使用无菌的200μL枪头垂直在6孔板中划3条划痕，然后用PBS清洗，再按照（2）中分组对细胞进行相应浓度的木瓜总三萜(4、8、18μg/mL)处理，培养24h后观察划痕宽度的变化，并使用相应图像处理软件分析划痕宽度。

（7）统计学分析

统计每组数据，均以均数±标准差(±s)表示。数据分析在SPSS21.0统计软件包上进行，以单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异，P<0.05说明差异具有统计学意义。每实验重复4次。

试验结果

1）木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞增殖的影响

MTT结果显示，UVB照射对HUVECs细胞有明显的抑制增殖作用，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(2、4、8和16μg/mL)处理后，对UVB损伤的HUVECs细胞具有明显的促进增殖作用，32和64μg/mL木瓜总三萜抑制了HUVECs细胞的增殖。提示低浓度木瓜总三萜可促进HUVECs细胞增殖，高浓度木瓜总三萜可抑制其增殖活性。根据现有研究，确定了木瓜总三萜的适宜浓度(16μg/mL以下)和处理时间(24h)，以供进一步的体外研究(见图5)。

平板克隆形成实验结果显示，UVB照射可明显抑制HUVECs细胞克隆数，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(4、8和16μg/mL)处理后，可明显增加UVB损伤的HUVECs细胞克隆数，与UVB组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)(见图6)。

2）木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞凋亡的影响

Hoechst 33258染色结果显示，正常对照组细胞呈现弱蓝色荧光，形态均一完整，染色质分布均匀。UVB损伤模型组中可见较多强蓝色荧光染色细胞，可观察到典型的调亡小体，染色质浓缩，核碎裂成大小不等的圆形小体等表示细胞凋亡的现象；其细胞凋亡数目明显增多，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(4、8和16μg/mL)处理后该种现象减弱并且随着木瓜总三萜剂量的增大，正常形态的细胞增多，其凋亡特征越不明显，其细胞凋亡数目明显减少，与UVB组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)(见图7)。

3）木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞迁移的影响

划痕实验结果显示：UVB照射明显抑制了细胞的迁移能力，细胞愈合能力显著下降，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜总三萜(4和16μg/mL)处理后能明显促进UVB损伤的HUVECs细胞迁移，划痕周边的细胞迁移至中央划痕区的距离明显减小，愈合能力明显升高，与UVB组比较具有显著性差异(P<0.01)(见图8)。

试验结论

由木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞影响实验可知，木瓜总三萜可显著促进UVB损伤的HUVECs细胞增殖、抑制其细胞凋亡、促进其细胞迁移。实验结果显示木瓜总三萜对UVB损伤的HUVECs细胞具有较好的保护作用。

实验例3

下面结合具体的实验例，具体说明本发明实施例1得到的木瓜总三萜对手术切割致大鼠皮肤损伤具有明显的治疗作用。

试验方法

1）实验动物

动物及饲料均购自三峡大学实验动物中心，SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠50只，体重180~220g，雌雄各半，实验动物质量合格证号：SCXK(鄂)2017-0061。动物饲养于普通级动物室干燥、通风、安静的环境，5只/笼。动物实验遵循三峡大学实验动物伦理委员会指导原则，并在其监督下开展实验研究。

2）方法

（1）皮肤损伤大鼠模型的制作

用手术切割方法造模。在造模前两天在大鼠背部脊柱两侧用8％硫化钠脱毛备皮。术前腹腔注射20％氨基甲酸乙酯(1.5g/kg)麻醉，取大鼠俯卧位，暴露背部，铺无菌巾，术区常规碘伏消毒后，在距耳后4.0cm、脊柱正中两侧旁开1.0cm处用直径为1.2cm的角膜环钻做全层皮肤缺损创面，左右各1个，止血并用生理盐水冲洗伤口。在做创面的过程中，尽量做到打孔位置、大小、深度一致，尽量只取全层皮，少伤及皮下筋膜，尽量不伤及深层的血管以及神经，减小造模个体差异。

（2）皮肤损伤模型大鼠分组及给药

将成功制作皮肤损伤模型大鼠随机分为皮肤损伤模型组、木瓜总三萜组(1.2、2.4和3.6g/kg)和疤痕灵阳性药组(1.0g/kg)。药物涂敷组在其伤口缺损处分别涂敷相应木瓜总三萜搽剂(将木瓜总三萜溶解于生理盐水中)和疤痕灵；模型组则涂敷生理盐水。造模当天记作第0天。每天早晚1次，连续4周。

（3）一般状况观察

观察实验期间大鼠的进食量、精神状况、伤口有无感染等。

（4）伤口愈合情况分析

在造模的第0天开始，每隔3天用相机给伤口拍照。每次拍照前麻醉大鼠，然后修剪创面及其周缘长出的毛发，在伤口距离相等的位置放置直尺，用相同的焦距及距离拍照，记录对应大鼠编号的创面左右，并每天观察创面愈合情况。用Image J软件图像分析软件计算伤口面积，伤口创面愈合率=(建模后伤口面积-现在剩余伤口面积)/建模后伤口面积×100%，以伤口创面愈合率＞90%为愈合标准。

（5）皮肤组织形态学分析

分别在在第3、14、28天每次随机选取一组大鼠，麻醉后剔除伤口周缘毛发，离伤口周缘1cm处取包含全层皮肤及皮下组织的标本，然后处死动物。用4%多聚甲醛中固定组织标本、乙醇梯度脱水、石蜡包埋后，切片，Masson染色后光镜下观察。

（6）统计学分析

实验结果用均数±标准差(

±s)表示，数据分析在SPSS21.0统计软件包上进行，以单因素方差分析进行多组间差异比较，以Dunnett-t检验比较两组间差异；P<0.05认为有统计学差异。

试验结果

1）大鼠的一般情况

实验大鼠在术后略有下降，后缓慢增长，饲养期间大鼠活动正常，术后伤口无明显感染以及化脓情况出现。

2）木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠创面的影响

术后第3天，木瓜总三萜(1.2、2.4和3.6g/kg)组和疤痕灵阳性药组创面渗出液明显减少，创面均被血痂皮覆盖，伤口开始收缩变小，伤口周围干燥，肿胀范围小，并且随着时间的延长，各组伤口创面减少速度明显快于模型组，而木瓜总三萜(1.2、2.4和3.6g/kg)组促进伤口愈合效果更明显，随着木瓜总三萜(1.2和2.4g/kg)剂量的增加，其疗效愈加明显；但当木瓜总三萜剂量增加为3.6g/kg时，疗效并没有显著增加，与模型组比较均具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。在手术后第14天，木瓜总三萜2.4g/kg组伤口达到愈合标准，其余组未达到愈合标准。在手术后第28天，各组创面均已愈合，木瓜总三萜(1.2、2.4和3.6g/kg)组创面与周边皮肤差别不明显，无明显瘢痕凸起，伤口愈合区域有大量新生毛发长出；其他组伤口周缘清晰，可见瘢痕组织形成，无明显毛发生长，其中以木瓜总三萜2.4g/kg组的疗效最为显著。以上结果表明，木瓜总三萜可显著缩短创面愈合时间、提高创面愈合速率，减轻伤口的炎症反应，促进肉芽组织的生成。

3）木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠创面愈合时间的影响

每天观察各组伤口愈合情况，每隔三天伤口拍照。拍照后用Image J软件图像分析软件进行残余伤口面积计算，以愈合创面面积＞90%为愈合标准。结果显示，模型组创面愈合的平均天数为17.87±1.06天；疤痕灵组创面愈合的平均天数为16.18±1.04；木瓜总三萜(1.2、2.4和3.6g/kg)组创面愈合的平均天数分别为13.92±1.00、13.86±0.93和15.62±1.15天，随着木瓜总三萜(1.2和2.4g/kg)剂量的增加，其促进皮肤损伤大鼠创面愈合时间显著缩短，但当木瓜总三萜剂量增加为3.6g/kg时，其促进皮肤损伤大鼠创面愈合时间并没有明显缩短，与模型组和疤痕灵组比较均具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。实验结果表明木瓜总三萜能缩短创面愈合天数(见图9)。

4）木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠大鼠创面愈合速率的影响

木瓜总三萜(1.2、2.4和3.6g/kg)组在手术后3、7、14天伤口创面面积均有不同程度减小，随着木瓜总三萜(1.2和2.4g/kg)剂量的增加，其促进皮肤损伤大鼠创面愈合速率明显增加，但当木瓜总三萜剂量增加为3.6g/kg时，其促进皮肤损伤大鼠创面愈合速率没有明显增加，与模型组和疤痕灵组比较均具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。实验结果表明，木瓜总三萜能提高大鼠创面愈合速率，使创面愈合时间缩短(见图10)。

5）木瓜总三萜对皮肤损伤模型大鼠皮肤病理形态的影响

Masson染色将***和胶原纤维染成蓝色，平滑肌染成红色，细胞核染成褐色。术后第3、14、28天，各组均有胶原纤维(蓝色)在组织中生成；第14、28天，木瓜总三萜组胶原纤维数量最多组较少，模型；第28天，木瓜总三萜组胶原纤维较其他组多，排列规则、有序，更接近正常皮肤。随着木瓜总三萜(1.2和2.4g/kg)剂量的增加，其对皮肤损伤大鼠皮肤病理形态学的改善效果愈加明显，但当木瓜总三萜剂量增加为3.6g/kg时，其对皮肤损伤大鼠皮肤病理形态学的改善效果并没有明显愈加。实验提示木瓜总三萜可促进皮肤受损部位胶原纤维的形成及有序排列，从而促进大鼠皮肤创面的愈合(图11)。***和胶原纤维染成蓝色，平滑肌染成红色，细胞核染成褐色。

试验结论

由木瓜总三萜对手术切割致大鼠皮肤损伤影响实验可知，木瓜总三萜可显著缩短创面愈合时间、提高创面愈合速率，减轻伤口的炎症反应，促进肉芽组织的生成和胶原纤维的形成，促进受损皮肤再生修复、减少瘢痕生成。

实验例4

下面结合具体的实验例，具体说明木瓜总三萜对皮肤外伤患者的皮肤损伤具有明显的治疗作用。

试验方法

1）临床资料

本组64例患者均来自三峡大学中医临床医学院，其中男32例，女32例，年龄为，l6～55岁，平均年龄为38岁；所有患者均在伤后15min～2h就诊。创伤部位：上臂创伤者14例，前臂创伤者18例，小腿创伤者20例，大腿创伤者12例，均为皮下组织以上的小面积浅层皮肤组织缺损；创面面积为1.5cm×5.0 cm～5.0cm×13.0cm。

2）方法

（1）分组方法

将64例患者按照随机数表法分为木瓜总三萜组和疤痕灵膏组；木瓜总三萜组32例，疤痕灵膏组32例，分别采取相应疗法治疗。

（2）治疗方法

入院后所有患者均进行一期清创，清除创面坏死、污染的组织，然后用生理盐水冲洗创面后再用无菌干纱布蘸干水分，并探查创面深度及周围组织受损情况。清创后根据创面情况采用不同方法治疗。木瓜总三萜组和疤痕灵组分别在创面外涂木瓜总三萜和疤痕灵，每日换药2次，直至创面愈合。换药前将，原有药物及液化物蘸净后再涂新的药物，换药时遵循创 面不疼痛、不出血、不损伤正常组织的“三不原则”。

（3）疗效评价

观察指标：观察两组患者创面愈合时问及创面感染情况，并于随访8～21个月后观察瘢痕增生情况。

疗效判定标准：优：创面完全愈合，临床症状完全消失；良：创面愈合面积>50%，临床症状完全消失；可：创面愈合面积为20％～50％，渗出物减少，临床症状改善；差：创面无变化或扩大，临床症状未见改善。

（6）统计学分析

实验结果用均数±标准差(±s)表示，数据分析在SPSS21.0统计软件包上进行，以单因素方差分析进行多组间差异比较，以Dunnett-t检验比较两组间差异；P<0.05认为有统计学差异。

试验结果

1）两组患者临床疗效比较

木瓜总三萜组患者创面疗效优良率为87.50%，没有疗效差的患者出现；疤痕灵组患者创面疗效优良率为68.75%，有3例疗效差的患者出现。木瓜总三萜组优良率明显优于疤痕灵组，与疤痕灵组比较具有显著性差异(P＜0.01)(见表1)。

表1 两组患者临床疗效比较

与疤痕灵组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01.

2）两组患者创面愈合时间比较

木瓜总三萜组患者的创面平均愈合时间为11.10±1.13d，疤痕灵组患者的创面平均愈合时间为15.62±1.34d。木瓜总三萜组平均愈合时间明显短于疤痕灵组，与疤痕灵组比较具有显著性差异(P＜0.01)(见表2)。

表2 两组患者临床疗效比较

组别	病例数(n)	愈合时间(天)	平均愈合时间(天)	感染病例数(n)
					木瓜总三萜组	32	10～14	12.35±1.08<sup>**</sup>	0
疤痕灵组	32	13～17	15.89±1.48	2

与疤痕灵组比较：^* P＜0.05，^** P＜0.01.

3）两组患者创面感染情况比较

疤痕灵治疗组有2例患者出现了不同程度感染，木瓜总三萜治疗组患者的创面无感染情况出现，与疤痕灵组比较具有显著性差异(P＜0.01)(见表2)。

试验结论

木瓜总三萜可有效促进创面表皮愈合速度，皮肤组织弹性升高，减少瘢痕生成，提高创面愈合质量。

综上所述，木瓜总三萜对皮肤细胞损伤具有较好的促进增殖、抑制细胞凋亡和促进细胞迁移作用；对动物皮肤损伤模型及皮肤外伤患者可显著促进皮肤创面愈合、缩短伤口愈合时间，促进受损皮肤再生修复、减少瘢痕生成。与当前的临床上使用的治疗皮肤损伤的药物相比，具有效果好，但毒副作用小、天然无刺激的优势。

上述实施例和实验例对本发明对本发明做了具体说明。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。