阅读说明：本技术 细胞团块融合方法 (Cell pellet fusion method ) 是由 谷口英树 田所友美 于 2019-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供使细胞团块融合的方法。一种细胞团块融合方法,包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上,从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养。(The present invention provides methods of fusing cell masses. A cell pellet fusion method comprising seeding a cell pellet on a surface capable of adhering to cells, and culturing the cell pellet by supplying a culture medium from the front surface side and the back surface side of the surface seeded with the cell pellet.)

细胞团块融合方法

技术领域

本发明涉及使细胞团块融合的方法。

背景技术

生物体内的大部分的组织、内脏器官中存在血管系统，进行血液细胞、氧、营养等的供给，代谢废物等的除去。

近年来，通过在生物体外的细胞培养，建立了使用了肠、肝等各种上皮系的细胞的三维培养法(非专利文献1，2)，但这些为仅包含上皮细胞的类器官(organoid)，不含有血管结构。

接着这样的技术，开发了通过将内脏器官的前体细胞和血管内皮细胞，间充质细胞混合，在基质胶等基质上诱发自主性的细胞凝聚，由此制备具有微小血管网的类器官(内脏器官原基)的技术(非专利文献3，专利文献1)。

虽然能够通过使用低吸附板等以无基质条件制备细胞团块，主要由于营养和氧需求的问题，为了在内部不会引起坏死而进行长期培养，需要将细胞团块控制在几百μm以下的大小(非专利文献4)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Nature 459，262-265，2009

非专利文献2：Cell 160，299-312，2015

非专利文献3：Nature 399，481-484，2013

非专利文献4：Br.J.Cancer(1986)，53，345-353

专利文献

专利文献1：WO2013/047639

发明概述

发明要解决的问题

为了制备φ为几百μm以上的类器官，需要使用基质，但由类器官周围的基质引起类器官之间的凝聚、融合受到抑制，难于将类器官扩大到5mm以上的尺寸。另外，根据GCTP的观点，基质的使用也是难于进行再生医疗等应用的原因之一。

本发明的目的在于提供以无基质条件制备大型类器官的方法。

用于解决问题的方法

本发明人通过在培养容器中以无基质条件(matrix-free)共培养内脏器官细胞和血管内皮细胞和间充质细胞，由此制备类器官(细胞团块)，将这些类器官接种在能与细胞黏附的表面上，从接种类器官的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养，从而成功创造出任意大小的融合型类器官，完成了本发明。确认了该融合型类器官在内部形成血管网结构。另外，在融合型类器官中，多种内脏器官分化标记的基因表达上升了。在利用本发明的方法制备的融合型肝芽中，确认到肝功能相关基因的表达水平的上升，也确认到了毛细血管、细小动静脉，窦状隙，肝内胆管的形成。进而，确认了将融合型类器官移植至小鼠时，小鼠的血管系统与融合型类器官的血管系统的吻合、血液灌注。

本发明的主要内容如下。

(1)细胞团块融合方法，包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养。

(2)根据(1)所述的方法，包括以使得细胞团块相对于接种面所占的面积的比率为40～100％的方式将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上。

(3)根据(1)或(2)中所述的方法，其中，细胞团块包含血管细胞和/或间充质细胞。

(4)根据(3)所述的方法，其中，间充质细胞和血管细胞的比例为1∶0.01～100。

(5)根据(4)所述的方法，其中，间充质细胞和血管细胞的比例为1∶0.1～10。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，融合的细胞团块形成血管网结构。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，细胞团块为器官芽。

(8)根据(7)所述的方法，其中，器官芽由组织或内脏器官细胞、间充质细胞及血管细胞形成。

(9)根据(8)所述的方法，其中，组织或内脏器官细胞、间充质细胞及血管细胞的比例为10∶0.1～10∶0.1～10。

(10)根据(9)所述的方法，其中，间充质细胞和血管细胞的比例为1∶0.1～10。

(11)根据(7)～(10)中任一项所述的方法，其中，器官芽在具有细胞非黏附面的培养器材中形成。

(12)根据(7)～(11)中任一项所述的方法，其中，器官芽为肝芽，且融合的肝芽形成血管网结构。

(13)根据(12)所述的方法，其中，血管网结构包含毛细血管和/或细小动静脉。

(14)根据(6)～(13)中任一项所述的方法，其中，细胞团块为肝芽，且融合的肝芽形成胆管结构。

(15)融合细胞团块的制备方法，包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养，使细胞团块融合。

(16)构建血管网结构的方法，包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养，形成血管网结构。

(17)人工内脏器官，其具有血管网结构和/或胆管结构，通过将由肝细胞、间充质细胞及血管细胞形成的肝芽在体外融合而制备。

(18)根据(17)所述的人工内脏器官，其中，肝细胞、间充质细胞及血管细胞中的至少1种由人工制备的多潜能干细胞诱导分化而来。

根据本发明可以制备mm级以上的融合细胞团块。另外，根据本发明可以在融合细胞团块中再现性良好地形成血管网络样的结构。进一步，根据本发明，可以制备肝功能相关基因的表达水平上升的融合型肝芽，在融合型肝芽中，可形成毛细血管、细小动静脉，窦状隙，肝内胆管。

根据本发明，能够实现具有血管网结构的融合类器官的稳定制备，因此，通过与大血管等组织融合在将来能够实现制备能够移植的内脏器官。

发明效果

根据本发明能够实现制备大型的类器官。

在本说明书中，包含在作为本申请的优先权的基础的日本专利申请：特愿2018-061095的说明书和/或附图中记载的内容。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明提供细胞团块融合方法，包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基同时进行培养。根据本发明的方法可得到融合细胞团块。因此，本发明提供融合细胞团块的制备方法，包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养而使细胞团块融合。根据本发明的方法，能够在细胞团块中构建血管网结构。因此，本发明提供构建血管网结构的方法，包括将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养，形成血管网结构。

根据本发明的方法，能够制备至今的以无基质条件制备细胞团块的方法中没有报告过的大小，即，φ为8mm以上的细胞团块。如在Br.J.Cancer(1986)，53，345-353中，根据进行作图的数据，可形成达φ为2.2mm左右尺寸的细胞团块，在其它论文中，如利用旋转培养装置能够制备φ1.1mm大的细胞团块(Zanoni M等，Sci.Rep.6，19103.2016)，在U型底平板中能够制备φ为1mm大的细胞团块(Vinci M等，BMC Biology 10：29，2012)，在U型底平板中制备了细胞团块后进行了在低吸附板上的旋转培养，由此能够制备φ为4mm大的细胞团块(Xiang Y等，Cell Stem Cell 21，383-398，2017)，在细胞培养插件上能够制备φ为4mm大的细胞团块[Takasato M等，Nature 526，564-568，2015]。另外，在使用基质制备类器官的方法中，推断是以最大5mm左右的大小为极限(Chen Y等，Nat.Cell Biol.19，542-549)，但在本发明的方法中，能制备比该报告更大的细胞团块。

细胞团块可以为器官芽(类器官)、球体等任何的细胞的聚集体，可以为包含血管细胞(例如：血管内皮细胞)和间充质细胞(例如：间充质干细胞的这样的未分化间充质细胞)的其中一者或两者。间充质细胞和血管细胞的比例可以为1∶0.01～100，优选为1∶0.1～10，更优选为1∶0.5～2。如果细胞团块包含血管细胞和间充质细胞，则在融合的细胞团块中可能形成血管网结构。

球体为细胞彼此发生集合、凝聚的球状的细胞聚集体，形成三维结构。

“器官芽”是指，是可以通过成熟而分化为器官的结构体，作为其的一例，在WO2013/047639中公开了由组织或内脏器官细胞，血管细胞(例如：血管内皮细胞)，及间充质细胞(例如：间充质干细胞那样的未分化间充质细胞或由其分化成的细胞)的三种细胞制备器官芽的方法，在本发明中，优选可以使用利用该方法制备的器官芽。对于某个结构体是否为器官芽，例如可以通过如下操作来确认：将该结构体移植到生物体中，调查是否可以分化为目的器官(如果分化为目的器官则可以判断为器官芽)，以及/或者调查该结构体是否包含全部的上述三种细胞(如果包含全部三种细胞则可以判断为器官芽)。器官芽例如可以是分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺，胸腺、生殖腺、脑、脊髓等器官的器官芽等，优选分化为肝脏的器官芽(肝芽)、分化为胰脏的器官芽(胰芽)、分化为肠道的器官芽等分化为内胚层器官的器官芽。对于某个结构体是否为分化为内胚层器官的器官芽，可以通过调查作为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出后述的标记蛋白质的任一个或多个，则可以判断为器官芽)。例如，就肝芽而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就胰芽而言，PDXl、SOX17、SOX9等成为标记，就分化为肠道的器官芽而言，CDX2、SOX9等成为标记。在本领域技术人员所使用的术语中，肝芽(liver bud)、肝憩室(liverdiverticula)、肝类器官(liver organoid)、胰腺(背侧或腹侧)芽(pancreatic (dorsalor ventral)buds)、胰腺憩室(pancreatic diverticula)、胰腺类器官(pancreaticorganoid)、肠芽(intestinal bud)、肠憩室(intestinal diverticula)、肠类器官(intestinal organoid)(K.Matsumoto，等Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等包含于本发明的器官芽中。

本发明中所谓“组织或内脏器官细胞”是指构成组织或内脏器官的功能细胞、或向功能细胞分化的未分化细胞。作为“未分化的组织或内脏器官细胞”，例如可以是能够分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等器官的细胞等，可以举出能够分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发/指甲/皮肤腺、感觉器官、末梢神经、晶状体等外胚层器官的细胞、能够分化为肾脏、输尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨架、真皮、***、间皮等中胚层器官的细胞、能够分化为肝脏、胰腺、肠道、肺、甲状腺、甲状旁腺、尿路等内胚层器官的细胞等。对于某个细胞是否为能够分化为外胚层器官、中胚层器官或内胚层器官的细胞，可以通过调查成为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出标记蛋白质的任一种或多种，则可以判断为能够分化为内胚层器官的细胞)。例如，就能够分化为肝脏的细胞而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就能够分化为胰腺的细胞而言，PDXl、SOX17、SOX9等成为标记，就能够分化为肠道的细胞而言，CDX2、SOX9等成为标记，就能够分化为肾脏的细胞而言，SIX2、SALLl成为标记，就能够分化为心脏的细胞而言，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA成为标记，就能够分化为血液的细胞而言，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4成为标记，就能够分化为脑或脊髓的细胞而言，HNK1、AP2、NESTIN等成为标记。在本领域技术人员所使用的术语当中，成肝细胞(hepatoblast)、肝祖细胞(hepatic progenitor cells)、肝前体细胞(hepatic precursor cells)、成胰腺细胞(pancreatoblast)、胰腺祖细胞(pancreatic progenitors)、胰腺祖细胞(pancreaticprogenitor cells)、胰腺前体细胞(pancreatic precursor cells)、内分泌前体细胞(endocrine precursors)、肠祖细胞(intestinal progenitor cells)、肠前体细胞(intestinal precursor cells)、间介中胚层(intermediate mesoderm)、后肾间充质前体细胞(metanephric mesenchymal precursor cells)、多潜能肾单位前体细胞(multipotent nephron progenitor)、肾前体细胞(renal progenitor cell)、心脏中胚层(cardiac mesoderm)、心血管前体细胞(cardiovascular progenitor cells)、心脏前体细胞(cardiac progenitor cells)(JR.Spence，等，Nature.；470(7332)：105-9.(2011)，Self，等，EMBO J.；25(21)：5214-5228.(2006)，J.Zhang，等，Circulation Research.；104：e30-e41(2009)，G.Lee，等，Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007))等包含于本发明的未分化的组织或内脏器官细胞中。未分化的组织或内脏器官细胞可以从组织或内脏器官采集、或从人工多潜能性干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)等多潜能干细胞依照公知的方法制备。另外，未分化的组织或内脏器官细胞也可以是从iPS细胞等多潜能干细胞向组织或内脏器官的分化处于中途阶段的细胞，例如可以是原始肠内胚层细胞(Primitive GutEndoderm Cells：PGECs)(日本专利第5777127号)等。PGECs能够向肝细胞、胰细胞及肠细胞分化(分化功能高)，不表达与癌的恶性度相关的标记(安全性高)，可以从iPS细胞在非饲养环境下分化诱导而制备，因此还具有可以临床应用的优点。而且，PGECs能够大量制备。PGECs可以利用日本专利第5777127号中记载的方法制备。或者，可以是通过向无血清培养基中添加激活素(activin)来培养iPS细胞等多潜能干细胞而诱导为CXCR4及E-钙粘蛋白双阳性的内胚层细胞而得，此外也可以是通过将所得的内胚层细胞添加BMP4、FGF2并培养2天而得的CXCR4阴性HNF4α阳性的肝脏内胚层集团。除此以外，例如，能够分化为肝脏的内脏器官细胞可以依照K.Si-Taiyeb，等，Hepatology，51(1)：297-305(2010)、T.Touboul，等Hepatology.51(5)：1754-65.(2010)来制作，能够分化为胰脏的内脏器官细胞可以依照D.Zhang，等，Cell Res.；19(4)：429-38.(2009)来制作，能够分化为肠道的内脏器官细胞可以依照J.Cai，等，J Mol Cell Biol.；2(1)：50-60(2010)、R.Spence，等，Nature.；470(7332)：105-9.(2011)来制作，能够分化为心脏的内脏器官细胞可以依照J.Zhang，等，Circulation Research.；104：e30 e41(2009)来制作，能够分化为脑或脊髓的细胞可以依照G.Lee，等Nature Biotechnology 25，1468 1475(2007)来制作。作为“分化了的组织或内脏器官细胞”可以例示出胰腺的内分泌细胞、胰腺的胰管上皮细胞、肝脏的肝细胞、肠道的上皮细胞、肾脏的肾小管上皮细胞、肾脏的肾小球上皮细胞、心脏的心肌细胞、血液的淋巴细胞或粒细胞、红细胞、脑的神经细胞或神经胶质细胞、脊髓的神经细胞或施万细胞等。组织或内脏器官细胞可以为源自癌化的组织、内脏器官的细胞(癌细胞)。癌细胞可以为建立的癌细胞，源自癌患者(也包括非人动物)的初代培养癌细胞、传代培养癌细胞中的任意一种。组织或内脏器官细胞主要使用源自人的那些，然而也可以使用源自除了人以外的动物(例如：利用作实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗犬等的动物，具体而言，为小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的组织或内脏器官细胞。

血管细胞可以自脐静脉等血管组织分离，但不限于自血管组织分离的细胞，也可以是iPS细胞或ES细胞等具有全能性或多潜能的细胞经分化诱导的细胞。作为血管细胞，可以例示血管内皮细胞，血管平滑肌细胞等，优选为血管内皮细胞，源自脐带静脉的血管内皮细胞处于市售中，容易获取。在本发明中“血管内皮细胞”是指构成血管内皮的细胞、或可以分化为此种细胞的细胞。对于某个细胞是否为血管内皮细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如：TIE2，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，CD41来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任一种或多种，则可以判断为血管内皮细胞)。在本发明中所用的血管内皮细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于血管内皮细胞是否为分化了的细胞，可以利用CD31，CD144确认。在本领域技术人员所使用的术语当中，内皮细胞(endothelial cells)、脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells)、内皮祖细胞(endothelialprogenitor cells)、内皮前体细胞(endothelial precursor cells)、血管性祖细胞(vasculogenic progenitors)、成血管细胞(hemangiob last)(HJ.joo，等，Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含于本发明的血管内皮细胞中。优选的血管内皮细胞源自脐带静脉的血管内皮细胞。血管内皮细胞可以从血管采集、或从人工多潜能干细胞(iPS细胞)，胚胎干细胞(ES细胞)等多潜能干细胞依照公知的方法制作。血管内皮细胞主要使用源自人的那些，然而也可以使用源自除了人以外的动物(例如实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗犬等所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、犬、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的血管内皮细胞。

本发明中所谓“间充质细胞”的概念是指，主要存在于来自于中胚层的***中、形成以组织发挥作用的细胞的支撑结构的***细胞，也是包括虽然确定了向间充质细胞分化的命运、然而还没有分化为间充质细胞的细胞的概念。在本发明中使用的间充质细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于某个细胞是否为未分化间充质细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如：Stro-1，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD133，CD271，巢蛋白来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为未分化间充质细胞)。另外，对于没有表达出前项的标记的任意一种的间充质细胞可以判断为分化间充质细胞。在本领域技术人员所使用的术语当中，间充质干细胞(mesenchymalstem cells)、间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells)、间充质细胞(mesenchymalcells)(R.Peters，等，PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等包含于本发明的间充质细胞中。优选的间充质细胞为源自骨髓的间充质细胞(特别是间充质干细胞)。间充质细胞可以从骨髓，脂肪组织，胎盘组织，脐带组织，牙髓等组织中采集、或从人工多潜能干细胞(iPS细胞)，胚胎干细胞(ES细胞)等多潜能干细胞依照公知的方法制作。间充质细胞主要使用源自人的那些，然而也可以使用源自除了人以外的动物(例如实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗犬等所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、犬、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的未分化间充质细胞。

组织或内脏器官细胞，血管内皮细胞及间充质细胞这3种细胞全部由iPS细胞制备，并从这些细胞创立器官芽的方法记载于Takebe T等，2017，Cell Reports 21，2661-2670中，也可以将这些细胞、器官芽使用于本发明。

共培养中的三种细胞的培养比是可以形成器官芽的范围内，没有特别限定，合适的细胞的个数比为组织或内脏器官细胞∶血管细胞∶间充质细胞＝10∶0.1～10∶0.1～10。如果血管细胞和间充质细胞减少，则血管的形成变难。如果间充质细胞变多，则相比于与细胞能够黏附的面的黏附，更多会由于细胞之间的黏附力较强导致收缩，细胞团块的融合变难。如果血管细胞变多，则对血管构建而言所需的间充质细胞的量变得不够，由此抑制血管形成。

间充质细胞和血管细胞的比例(数比)可以为1∶0.01～100，优选为1∶0.1～10，更优选为1∶0.5～2。可以对组织或内脏器官细胞23万个左右，血管内皮细胞16万个左右，间充质细胞16万个左右进行共培养，形成大小为3,500～4,500微米左右的器官芽。间充质细胞的比率越提高，在器官芽中形成的血管网的网状结构越细。对于形成血管网结构的合适的细胞的数量比为组织或内脏器官细胞∶血管内皮细胞∶间充质细胞＝10∶1～10∶1～10，更优选为10∶2～7∶2～7。

用于器官芽的形成时使用的培养基只要是可以形成器官芽的培养基，则无论是何种都可以，优选使用血管内皮细胞培养用的培养基，组织或内脏器官细胞培养用的培养基，混合了上述2个培养基的那些等。血管内皮细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，优选使用包含hEGF(重组人上皮细胞生长因子)，VEGF(血管内皮细胞生长因子)，氢化可的松，bFGF，抗坏血酸，IGF1，FBS，抗生素(例如：庆大霉素，两性霉素B等)，Heparin，L-谷氨酰胺，酚红，BBE中的至少一种。作为血管内皮细胞培养用的培养基，可以使用EGM-2BulletKit(Lonza公司制)，EGM BulletKit(Lonza公司制)，VascuLife EnGS Comp Kit(LCT公司制)，人内皮-SFM基础生长培养基(Invitrogen公司制)，人微小血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO公司制)等。组织或内脏器官细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，在内脏器官细胞为肝细胞的情况下，优选使用包含抗坏血酸，BSA-FAF，胰岛素，氢化可的松，GA-1000中的至少一种的那些。作为肝细胞培养用的培养基，可以使用从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)培养基、向RPMI1640(Sigma-Aldrich公司制)中加入了1％B27补充剂(GIBCO公司制)和10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich公司制)等。关于人肝芽的形成，当将EGM BulletKit(Lonza公司制)与从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基以1∶1混合，向所得的培养基中添加***，抑瘤素M，HGF时，即判明对于肝芽的成熟有效果。

对用于器官芽的形成的细胞的培养温度没有特别限定，优选为30～40℃，进一步优选为37℃。

对用于器官芽的形成的细胞的培养期间没有特别限定，优选为3～14天，进一步优选为10天。

在本发明中，细胞团块(例如：器官芽)可以为不使用基质等细胞能够黏附的面(无基质条件)制备的那些，例如可以为在具有细胞非黏附面的培养器材中形成的那些。

具有细胞非黏附面的培养器材可以为经低吸附表面处理的那些，例如：可以为在培养面包被有细胞非黏附性的聚合物的那些。作为细胞非黏附性的聚合物，可以例示：磷脂，磷脂·高分子复合体，聚(2-甲基丙烯酸羟基乙酯)(PHEMA)，聚乙烯醇，琼脂糖，壳聚糖，聚乙二醇，白蛋白，光交联超亲水性聚合物等，但不限于这些。

另外，培养器材的底部可以为具有许多半球形状或圆锥台形状的凹处的底部。例如可以使用在1个孔中具有600个半球形状或圆锥台形状的凹处(凹处的容积为0.068mm³)的24孔板的培养器材，每1个孔培养总数20万～300万个的细胞而形成细胞团块。此时，细胞团块的大小可成为80～500微米。上述培养器材及培养条件记载于WO2015/182159中，在本说明书中作为参考引用。作为具有细胞非黏附面的培养器材，有Elplasia RB 500400NA(Kuraray)，96孔U型底平板或V型底平板(住友BakeLite)等，在本发明中，可以适合地使用。

本发明的方法中，可以以使得细胞团块相对于接种面所占的面积的比率为40～100％的方式将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，细胞团块相对于接种面所占的面积的比率优选为60～100％，更优选为80～100％。细胞团块相对于接种面所占的面积的比率可通过测定细胞团块的投射阴影面积，计算出相对于接种面的面积的比率而得到。细胞团块的投射阴影面积可以根据以下方法测定。利用FIJI，ImageJ，Photoshop等图像分析软件计算出细胞团块的投射阴影面积。

本发明的方法中，可将细胞团块以高密度接种到能与细胞黏附的表面上。高密度是指，例如在为直径150um的细胞团块的情况下，在每1cm³空间中存在的细胞团块的数量可以为9.5x10⁴～3.8x10⁵个，优选为1.9x10⁵～3.8x10⁵个，更优选为2.9x10⁵～3.8x10⁵个。

细胞团块的数量可以为2个以上，如果增加细胞团块的数量，则能够制备更大的融合细胞团块(参考后述的实施例)。

细胞团块的大小为80～500μm是适当的，优选为100～250μm。

培养基只要是适于细胞团块的培养的那些即可，例如：在细胞团块为肝芽的情况下，优选EGM BulletKit(Lonza公司制)与从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基以1∶1混合，向所得的培养基中加入了***，抑瘤素M，HGF的培养基，EGM BulletKit(Lonza公司制)与VascuLife EnGS Comp Kit(LCT公司制)以1∶1混合所得的培养基，EGM BulletKit(Lonza公司制)与内皮细胞生长培养基MV(公司制)以1∶1混合所得的培养基等培养基，但不限于这些。

“细胞团块之间的融合”是指多个细胞团块形成连续的结构体，融合的细胞团块可在内部进行自组装而构建连接的血管结构。通过细胞团块的彼此融合，不仅可使细胞团块变得大型，还使得细胞团块变得可形成血管网结构，血管网结构进一步发达，另外，细胞团块的功能可上升。

在本发明中，通过将细胞团块接种在能与细胞黏附的表面上，从接种有细胞团块的面的表面侧及背面侧供给培养基并进行培养而使细胞团块融合。

细胞团块的融合可在细胞能够黏附的面上进行。例如认为在细胞能够黏附的面采用多孔膜的结构时，从融合型的细胞团块可从上下供给营养的点、供给氧的方面而言对融合之后的培养是有利的，但不限于该实施方式。作为细胞能够黏附的面，可以例示：通过大气下电晕放电、真空气体等离子聚合处理(细胞黏附表面处理)等而使得带负电电荷，具有亲水性的那些，表面经明胶处理的那些，用细胞外基质(胶原蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白等)、粘多糖(硫酸肝素，透明质酸，硫酸软骨素等)包被的那些，用碱性合成聚合物(聚-D-赖氨酸等)包被的那些，具有合成纳米纤维表面的那些，为亲水性而具有中性的水凝胶层表面的那些，胶原蛋白膜(KOKEN)等，但不限于这些。在细胞能够黏附的面采用多孔膜的结构的情况下，孔径大小可以为0.4～8μm。作为具有细胞能够黏附的面的培养器材，有Falcon细胞培养板(Corning)，Falcon多孔细胞培养板(Corning)，Falcon细胞培养插件(Corning)等，在本发明中，可以适合地使用。

培养可以为分批培养，半分批培养(补料分批培养)，连续培养(灌注培养)中的任意方法。另外，可以为静置培养，通气培养，搅拌培养，震荡培养，旋转培养中的任一种，优选静置培养。

对细胞团块的融合而言，例如可以在培养器材的细胞能够黏附的面上进行，也可以在异种结构体的细胞能够黏附的面上进行。异种结构体的“异种”含义是指使与细胞团块的来源有别，使与细胞团块的来源有别的结构体，可以是生物体功能或具有与其类似的功能的那些，可以例示来自与细胞团块的来源不同的生物的生物体组织、内脏器官，人工组织、内脏器官等，优选具有管腔结构的那些。作为异种结构体，可以例示：血管，胆管，肠道，食道，胰管，气管，输尿管，输卵管等生物体组织、内脏器官，人工血管，人工气管，细胞片等人工组织、内脏器官，片状结构体，管状结构体，丝状结构体等，但不限于这些。异种结构体可以由生物相容性的材料形成。作为生物体相容性材料，可以例示：金属(例如，不锈钢、钴合金、钛合金等)、玻璃、陶瓷、合成高分子(例如，尼龙、聚丙烯、聚二噁烷酮、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二酯、特氟龙(注册商标))等、生物来源材料(例如，真丝、胶原蛋白、去细胞组织)等，但不限于此。细胞能够黏附的面如上述所述。

对用于细胞团块的融合的培养温度没有特别限定，优选使为25～37℃。

对用于细胞团块的融合的培养期间，没有特别限定，优选使为1～10天。

根据本发明，可以不使用基质胶等支撑体而形成大型的细胞团块。

根据本发明的方法，可以制备φ为100μm以上，φ为1mm以上，φ为2mm以上，φ为2.5mm以上，φ为4mm以上，φ为6mm以上，φ为8mm以上的融合细胞团块。对于φ为100μm以上，φ为1mm以上，φ为2mm以上，φ为2.5mm以上，φ为4mm以上，φ为6mm以上，φ为8mm以上的融合细胞团块而言，分别可能由2～4个，150～200个，300～400个，350～500个，600～800个，1200～1600个，2400～2800个大小80～150μm左右的细胞团块进行制备。

另外，利用本发明的方法制备的融合细胞团块可能形成血管网结构。在后述的实施例中，在融合型肝芽中形成了血管网结构。作为血管网结构，可列举毛细血管，细小动静脉，窦状隙等。另外，在融合型肝芽中可能形成胆管结构。

相比于融合前的细胞团块，根据本发明的方法经融合的细胞团块的功能也可上升。例如，在细胞团块为肝芽的情况下，融合型肝芽与融合前的肝芽相比，肝分化标记(例如：FoxA2，AFP，CYP3A7，CYP7A1)的基因表达水平可上升。另外，与以往方法的肝芽相比，肝功能可上升。例如，融合型肝芽与以往方法的肝芽相比，肝分化标记(例如ALB，OTC，CYP3A7，GLUT2)的基因表达水平，白蛋白产生量、转铁蛋白产生量，氨代谢量可上升。另外，在将经融合的细胞团块移植至生物体中的情况下，相比于融合前的细胞团块，植活率也可上升。进一步，早融合细胞团块具有血管网的情况下，可观察到移植至生物体的融合细胞团块的血管网与主方的血管的吻合及血管灌注。

通过将融合细胞团块移植至人或非人动物，例如可创造出在经移植的组织、内脏器官中构建血管网，开始血液灌注，具有高度有秩序的组织结构的组织、内脏器官。因此，可以将融合细胞团块移植至非人动物中，制备组织或内脏器官。另外，也可以将融合细胞团块移植至人或非人动物中，进行组织或内脏器官的再生或功能恢复。成为移植对象的动物除了人之外，还可以是利用作：实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗狗等的动物，具体地，可以例举：小鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等非人动物。另外，为了避免免疫排斥反应，非人动物优选是免疫缺陷动物。融合细胞团块的移植部位只要是能够移植的部位即可，可以是任何部位，可以例示：血管，颅内，肠系膜，肝，脾脏，肾脏，肾被膜下，门静脉上等。通过将融合细胞团块移植至生物体(人，非人动物等)，可以使功能丧失或者降低的组织、内脏器官再生，另外，如果在非人动物中制备人组织、内脏器官，则可以利用于创制新药筛选。

或者另外，也可以将融合细胞团块在体外培养，使功能进一步提高，并将其作为内脏器官类似体或者内脏器官利用于人类生物学，再生医疗，创制新药筛选等。

在本发明中，通过使细胞团块融合可以创造出大型的血管化类器官(器官芽)，通过大型化，细胞团块的功能提高，在生物体内可形成与血管类似的血管系统(毛细血管，细小动静脉等)。在细胞团块为肝芽的情况下，也可能形成胆管结构。后述的实施例中，通过将由肝细胞、间充质细胞及血管细胞形成的肝芽在体外融合，由此形成了血管网结构和/或胆管结构。因此，本发明提供由肝细胞、间充质细胞及血管细胞形成的肝芽在体外融合，由此制备的具有血管网结构和/或胆管结构的人工内脏器官。在本发明的人工内脏器官中，肝细胞、间充质细胞及血管细胞中的至少1种可以为由人工制备的多潜能干细胞诱导分化成的那些。

通过将融合细胞团块移植至非人动物，植活，可以制备非人嵌合动物。移植了融合细胞团块的非人动物(例如：小鼠)可能模仿细胞团块的来源的生物种类(例如：人)的生理功能。

进一步，可以使用包含选自融合细胞团块，由融合细胞团块制备的组织及内脏器官，及移植了融合细胞团块的非人嵌合动物中的至少一种评价药品。作为药品的评价，可以例举例如，药物代谢的评价(例如，药物代谢概况的预测)、药效评价(例如，筛选作为医药品有效的药品等)、毒性评价、药物相互作用评价等。

药物代谢的评价是通过在选自由源自人或非人动物的细胞制备的细胞团块进行融合而得到的融合细胞团块，由融合细胞团块制备的组织及内脏器官，或移植了融合细胞团块的非人嵌合动物中，提取·分析施用医药品的候选化合物后的生物试样，而可以获得人型的药物代谢分布。由此，使得通过现有技术极难以实现的在人中预测医药品的分布、代谢和***过程成为可能，并且有望飞跃性地加快安全且有效的医药品的开发。

对于作为医药品而言有效的药品的筛选，能够实现通过对选自从由源自人或非人动物的细胞制备的细胞团块进行融合得到的融合细胞团块，由融合细胞团块制备的组织及内脏器官，或移植了融合细胞团块的非人嵌合动物中，施用新型的医药品候选化合物而进行分析。由此，就可以期待有可能能够大幅度改善以往的体外试验中不够充分的、实际中向人施用时的药效的预测精度。

对毒性评价而言，通过在对选自由源自人或非人动物的细胞制备的细胞团块进行融合得到的融合细胞团块，由融合细胞团块制备的组织及内脏器官，或移植了融合细胞团块的非人嵌合动物，施用被测物质后，测定组织损害标记等，能够实现提高损害预测的精度。

对于药物相互作用评价，可以通过如下操作来进行，即，使用选自源自人或非人动物的细胞制备的细胞团块进行融合得到的融合细胞团块，由融合细胞团块制备的组织及内脏器官，或移植了融合细胞团块的非人嵌合动物，施用多种药品后，进行其后的各药品的分布、代谢、***过程等药物动力学、毒性评价、药效评价。

根据本发明的方法制备的融合细胞团块可以作为再生医疗用组合物的有效成分利用。

可以将再生医疗用组合物移植至人或非人动物的生物体内，制备组织或内脏器官。另外，可以将再生医疗用组合物移植至生物体内，进行组织或内脏器官的再生或功能恢复。

将再生医疗用组合物移植至人或非人动物的生物体之后，融合细胞团块可以分化为具有血管网的组织或内脏器官。在该血管网中可以产生血液灌流。认为通过在血管网中产生血液灌流，能够实现创造出具有与成体组织同等或与其接近的高度有序的组织结构的组织和器官。

在再生医疗用组合物中，也可以添加FGF2，HGF，VEGF等组织血管化促进剂，伴随着移植的止血用明胶海绵(商品名：Spongel，Astellas株式会社)，及在移植组织的固定中使用的Bolheal(Teijin Phama株式会社)、Beriplast(CSL Behring株式会社)、Tachocomb(CSL Behring株式会社)，胶原蛋白，基质胶等组织黏附剂等。

实施例

以下通过实施例更详细地描述本发明。

[实施例1]

实验方法

·人的人工多潜能干细胞(iPSC)的培养法

将细胞培养平皿或者细胞培养板用iMatrix-511(Nippi，0.7～0.9μg/cm²)于37℃，包被1小时，用PBS洗涤。将冻存人iPSC(TkDA株或1231A3株，分别从东京大学，京都大学获取)在37℃的热水中浸2分钟，同时用手震荡使其融解。将细胞保存液悬浮在为细胞保存液的9倍量的StemFit培养基(Ajinomoto)中，进行150-200x g，5分钟的离心操作。除去细胞上清，将细胞悬浮在AK02培养基中加入了Y-27632(10uM)的培养基中，以0.36～1.8x10³个细胞/cm²的浓度接种了人iPSC。在培养第1天交换为AK02培养基、以后每隔1天进行培养基交换。关于传代，将使用直径10cm的细胞培养平皿培养一周的人iPSC用PBS洗涤之后，加入Accutase(Innovative Cell Technology) 2ml于37℃处理5分～10分钟，剥离细胞。加入AK02培养基2ml，转移细胞至15ml管中，进行150-200x g，5min的离心操作。除去细胞上清，将细胞悬浮在AK02培养基中加入了Y-27632(10uM)的培养基中，以0.36～1.8x10³个细胞/cm²的浓度接种了人iPSC。

·从iPSC向肝前体细胞的分化诱导法

将细胞培养平皿或者细胞培养板(Falcon)用iMatrix-511(Nippi，0.4～0.6μg/cm²)于37℃包被1小时，用PBS洗涤。用直径10cm的细胞培养皿培养了一周的人iPSC用PBS洗涤之后，加入Accutase 2ml，于37℃处理5分钟至10分钟，剥离细胞。回收细胞并离心后除去细胞上清，将细胞悬浮于在RPMI培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)，B27(2％)，Wnt3a(50ng/ml)，激活素A(100ng/ml)，Y-27632(10uM)的培养基中，在经层粘连蛋白包被的平皿中以5～10x10⁴个细胞/cm²的密度进行接种。在培养第1天和第3天，交换为在RPMI培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)、B27(2％)、Wnt3a(50ng/ml)、激活素A(100ng/ml)、丁酸钠(0.5mM)的培养基。在培养第4天，交换为在RPMI培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)、B27(2％)、Wnt3a(50ng/ml)、激活素A(100ng/ml)的培养基。将培养第6天的细胞作为内胚层细胞定形内胚层(Definitive Endoderm，DE)。在培养第6天和培养第8天，交换为在RPMI培养基中加入了青霉素/链霉素(1％)B27(2％)，碱性FGF(10ng/ml)，BMP-4(20ng/ml)的培养基。将培养第10天的细胞作为肝前体细胞肝内胚层(Hepatic Endoderm，HE)。

·从iPSC向血管内皮细胞的诱导分化法

从iPSC向血管内皮细胞的诱导分化依照已有报道进行(Takebe等，Cell Reports，2017)。简略地说明而言，肝前体细胞同样地接种了iPSC，用在StemFit培养基中加入了Y-27632(10uM)的培养基进行了1天培养。次日，交换为在DMEM/F12培养基中加入了1％Glutamax，1％B27，CHIR99021(8uM)，BMP-4(25ng/ml)的培养基，培养3天后交换为在StemPro-34 SFM培养基中加入了VEGF(200ng/ml)，毛喉素(forskolin)(2uM)的培养基。在从诱导分化开始第7天，通过FACS确认CD31、CD144的表达，由此进行了品质的检查。得到的血管内皮细胞为，使用在StemPro-34SFM培养基中加入了VEGF(50ng/ml)的培养基，在经纤连蛋白包被的培养平皿上传代，进行扩大培养。

·从iPSC向间充质细胞的诱导分化法

从iPSC向间充质细胞的诱导分化依照已有报道进行(Takebe等，Cell Reports，2017)。简略地说明而言，与肝前体细胞同样以2-8x 10³个细胞/cm²的密度接种了iPSC，用在StemFit培养基中加入了Y-27632(10uM)的培养基进行了4-6天培养。交换为在DMEM/F12培养基中加入了1％Glutamax，1％B27，CHIR99021(8uM)，BMP-4(25ng/ml)的培养基，培养3天后交换为在DMEM/F12培养基中加入了1％Glutamax，1％B27，激活素A(2ng/ml)，PDGFBB(10ng/ml)的培养基。3天后交换为在StemPro-34 SFM培养基中加入了FGF2(10ng/ml)，PDGFBB(10ng/ml)的培养基，进行了3天培养。

·人间充质干细胞(MSC)的培养法

将悬浮在MSCGM培养基(Lonza)中的间充质干细胞(Mesenchymal Stem cells，下文中记载为MSC，Lonza，3-5x10⁵个细胞)接种在细胞培养平皿(直径10cm)中。3天进行1次培养基交换。7天后用PBS洗涤后，加入2ml的胰酶/EDTA(Gibco)于37℃处理5分钟，进行细胞剥离。加入2ml MSCGM培养基，转移细胞至15ml管中，进行150-200x g，5min的离心操作。除去细胞上清，将细胞混悬在HCM(不含EGF)培养基(Lonza)中添加了FBS Gold(MPBiomedicals)5％、HGF 10ng/ml、抑癌蛋白M(Oncostatin M)(R&D)20ng/ml、Dexamethazon100nM的培养基与EGM培养基以1∶1的比例混合的培养基(HCM/EGM混合培养基)中，供肝芽的制备。

·人脐静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)的培养法

将悬浮在EGM培养基(Lonza)或EGM-2培养基(Lonza)中的Kusabira Orange标记的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，记载为HUVEC，Lonza，3-5x 10⁵个细胞)，接种在细胞培养平皿(直径10cm)中。3天进行1次培养基交换。7天后用PBS洗涤后，加入2ml的胰酶/EDTA(Gibco)于37℃处理5分钟，进行细胞剥离。加入2ml EGM培养基或EGM-2培养基，转移细胞至15ml的管中，进行150-200x g，5分钟的离心操作。除去细胞上清，将细胞悬浮在HCM/EGM混合培养基中，供肝芽的制备。

·肝芽制备法

关于小型肝芽的制备，在微孔板Elplasia RB 500 400NA(Kuraray)24孔板的每1孔中，于HCM/EGM混合培养基中悬浮并接种人iPSC来源的DE或HE2.3-5x10⁵个细胞，和HUVEC或iPSC-EC0.5-3.5x10⁵个细胞，和MSC或iPSC-MC0.5-3.5x10⁵个细胞。对于以往方法，在48孔板每1孔中，于HCM/EGM混合培养基中悬浮了人iPSC来源的DE或HE5x10⁵个细胞，和HUVEC或iPSC-EC3.5x10⁵个细胞，和MSC或iPSC-MC0.5x10⁵个细胞，接种在预先于37℃凝固了的50％基质胶(基质胶∶EGM＝1∶1，150ul/孔，48孔板)上。肝芽在37℃，5％CO₂的环境中进行了24小时培养，用于肝芽融合。

·肝芽融合方法

制备肝芽24小时后，自微孔板Elplasia RB 500 400NA(Kuraray)回收小型肝芽。将回收的小型肝芽配置于24孔细胞培养插件(Falcon)，12孔细胞培养插件(Falcon)，6孔细胞培养插件(Falcon)，或者PrimeSurface(注册商标)板96U，PrimeSurface(注册商标)板96V(住友BakeLite)，超低黏附表面板96孔平底带盖或96孔透明细胞培养表面处理聚苯乙烯微量板(Corning)，PTFE制人工血管C-Porous多孔性管(中兴化成工业)中，使得肝芽彼此接近。在使用24孔细胞培养插件(Falcon)时，使为HCM/EGM混合培养基500ul/孔，配置小型肝芽600个或常规型肝芽2个。在使用12孔细胞培养插件(Falcon)时，使为HCM/EGM混合培养基1ml/孔，配置小型肝芽1200个。在使用6孔细胞培养插件(Falcon)时，使为HCM/EGM混合培养基2ml/孔，配置小型肝芽2400个。也能够在细胞培养插件上使用硅框(培养插件2孔/3孔，ibidi)。使用了硅框的为图3，9，10。插件表面用胶原蛋白I进行了包被。人工血管表面进行了0.1％明胶包被。在使用PrimeSurface(注册商标)板96U，PrimeSurface(注册商标)板96V(住友BakeLite)，超低黏附表面板96孔平底带盖或96孔透明细胞培养表面处理聚苯乙烯微量板(Corning)时，使为HCM/EGM混合培养基200ul/孔，配置小型肝芽600个或常规型肝芽2个。小型肝芽的密度为都是30000球/ml。之后，在37℃，5％CO₂环境中进行了7天培养。在配置后立即，配置后1天，3天，7，9天后使用荧光显微镜BZ-X710(Keyence)，共聚焦显微镜SP5或SP8进行照片拍摄。培养9天后利用4％PFA/PBS固定，在石蜡包埋后制备7～10μm的切片，进行组织分析。

·对颅窗的肝芽移植

免疫缺陷小鼠NOD/Scid从Sankyo Labo Service株式会社购买。在NOD/Scid小鼠的腹膜内使用***/甲苯噻嗪混合***或者盐酸美托咪定/咪达***/布托啡诺混合液之后，用牙科用钻头将颅骨中钻出圆形并除去。除去硬膜之后加入生理盐水，放置特别定制圆形玻璃(Matsunami)用牙科材料(Coe Tray Plastic)进行封入。1周之后除去玻璃，将小型肝芽或融合型肝芽移植至脑表面上并封入。移植之后，经时地使用荧光实体显微镜(CarlZeiss)或共聚焦显微镜SP5(Leica)或SP8(Leica)进行照片拍摄。观察血流时将Angiosense680(PerkinElmer)注射到尾静脉中。移植3周后，将移植物利用4％PFA/PBS固定，在石蜡包埋后制备7～10μm的切片，进行组织分析。

·使用定量RT-PCR的融合型肝芽的功能评价

将利用Elplasia RB 500 400NA(Kuraray)制备的小型肝芽和融合型肝芽在培养之后第10天回收，使用PureLink RNA mini试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化RNA。cDNA合成使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)进行，使用KAPA SYBR(注册商标)FastqPCR试剂盒(NIPPON Genetics Co，Ltd)和LightCycler(注册商标)480(Roche LifeScience)进行基因的扩增、检测。

·使用ELISA的融合型肝芽的功能评价

在融合型肝芽培养第10天不进行培养基交换，在其24小时后回收培养基，采用市售的ELISA试剂盒(分别为Bethyl Laboratories，Abcam)测定了培养上清液中的白蛋白、转铁蛋白量。

·尿素、氨代谢系统的功能评价

在融合型肝芽培养的第10天不进行培养基交换，在其24小时后回收培养基，采用QuantiChrom尿素分析试剂盒测定了培养上清液中的尿素量。对于氨代谢对，在培养基回收后交换为包含2mM氯化铵的培养基，24小时后进行培养基回收。采用血氨分析仪AMICHECK(Arkray，Inc.)测定培养上清液中的氨量，与将添加包含2mM氯化铵的培养基后即刻的培养基中的氨量的差额作为氨代谢量。

·石蜡切片制备法

将回收的组织在4％多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)中进行16小时固定。将固定组织用PBS洗涤3次之后，分别在70％乙醇，95％乙醇，100％乙醇(2次)中浸30分钟以上，进行组织的脱水。其后，在65℃分别浸入50％乙醇/二甲苯溶液、100％二甲苯溶液、100％石蜡溶液(2次)中同时振动30分钟以上之后，包埋于石蜡中。用切片机将经包埋的组织样品切成7～10μm厚的薄切片。薄切之后，于37度中进行了试样的干燥。

·苏木精和伊红染色

将经干燥的石蜡切片经二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，70％乙醇，Milli-Q水逐步脱石蜡，进行亲水化。用流水洗涤之后，用苏木精溶液染色3分钟，用流水洗涤之后，用伊红溶液染色2分钟。用流水洗涤之后，用醇进行脱水，用二甲苯透化后，在样品上放上非水溶性封入剂，用盖玻片进行封片。

·免疫组织化学分析

将经干燥的石蜡切片经二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，70％乙醇，Milli-Q水逐步脱石蜡，进行亲水化。在10mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中121℃、15分钟抗原活化处理后，在3％过氧化氢水/甲醇液中处理10分钟，以灭活内源性过氧化物酶。用Blocking One溶液(Nacalai Tesque)室温反应1小时之后，与经稀释的第一抗体(hCD31抗体(M0823，DAKO)，hAlbmin抗体(A6684，Sigma)，HNF4α抗体(sc-6556，Santa Cruz Biotechnology)，波形蛋白(Vimentin抗体)(M7020，DAKO))进行室温1小时或4℃过夜反应。用PBS洗涤3次后，使其与HRP标记的或荧光标记的第二抗体室温反应30分钟以上。用PBS洗涤3次后，在为经荧光标记的第二抗体时，在基于DAPI的核染色后封入，进行显微镜观察。在为经HRP标记的第二抗体时，利用DAB试剂(DAKO)反应2～10分钟，进行生色。用纯化水洗涤后，用苏木精染色3分钟，用流水洗涤10分钟后，与0.1％碳酸氢钠反应5分钟，用醇进行脱水，用二甲苯透化后，在样品上放上非水溶性封入剂，用盖玻片覆盖，进行封片。

·细胞团块相对于接种面的占有面积的算出法

在细胞团块占有面积的算出中，使用了图像分析软件ImageJ 1.51s(可以从National Institutes of Health，U.S.A.，http：//imagej.nih.gov/ij下载)。选择包含细胞团块的全部接种面，通过Image→Adjust→Threshold将Color选择为B&W，将图像转换为黑白。根据本条件，细胞团块为白，接种面为黑。设定阈值的最小值(上部)为130，阈值的最大值(下部)为255时，除了细胞团块所占的接种面以外的接种面的比例(％)就在Threshold画面左的图下显示出来。将距100％的差额作为细胞团块占有面积(％)算出。

实验结果

·人iPSC肝芽的凝聚、融合

将多个利用Elplasia板制备的小型肝芽(约80～150uM)或基质胶上制备的以往方法的肝芽(约1～2mm)于次日移动到细胞培养插件，U型底平板，V型底平板中，经时地观察肝芽的凝聚及融合到第7天。其结果，从融合1天后，观察到细胞培养插件，U型底平板，V型底平板，F型底平板，低吸附F型底平板，人工血管上的小型肝芽的凝聚及融合(图1A-F)。在F型底平板中观察到了肝芽的局部融合。对融合型肝芽的大小而言，分别为在细胞培养插件中约4mm，U型底平板中约2mm，V型底平板中约2mm，低吸附F型底平板中约3mm，人工血管上约3mm。关于血管网结构，在于细胞培养插件和人工血管上制备的融合型肝芽中在融合之后保持了3天以上(图1A和1F)。

另一方面，在使用了以往方法的肝芽的情况下，由于肝芽周围覆盖有基质而妨碍肝芽之间的凝聚，直至第7天未观察到U型底平板，V型底平板，细胞培养插件，F型底平板，低吸附F型底平板上的融合(图2A-E)。

·融合型肝芽的组织再构建

根据组织分析，在融合型肝芽中观察到不仅直径5-20μm的毛细血管，还有直径100μm以上的细小动静脉水平的血管的重建(图3A)。另外，也观察到肝细胞标记的HNF4α、人白蛋白阳性的肝细胞细胞群(图3B和3C)。根据使用了导入荧光蛋白质Kusabira-Orange的iPS来源的血管内皮细胞的成像，也确认到血管的重建(图3D，3E)。当将用共聚焦显微镜拍摄的图像利用Imaris进行了3D演绎时，确认了血管(红色)周围存在波形蛋白阳性的周细胞样的细胞(黄色)(图3E)。将融合型肝芽移植至颅窗后，在肝细胞的基础上也观察到胆管结构(图3F)。

·人iPSC融合型肝芽的功能分析

分别从小型肝芽和融合型肝芽培养第8天回收RNA，使用qRT-PCR法进行了肝分化标记计11种基因的表达分析。其结果可知，成为肝分化标记的FoxA2，AFP，CYP3A7，CYP7A1的基因表达水平在融合型肝芽中显著上升(Mann-Whitney’s U-检验，p＜0.05)(图4)。对以往方法的肝芽也同样地进行了比较，可知成为肝分化标记的ALB，AFP，OTC，CYP3A7，GLUT2的基因表达水平在融合型肝芽中显著上升(图5A)。进一步，在融合型肝芽中，确认到白蛋白产生能力、转铁蛋白产生能力，氨代谢上升(Mann-Whitney’s U-检验，p＜0.05)(图5B)。

·人iPSC融合型肝芽的体内移植分析

将培养第4天的小型肝芽和融合型肝芽分别进行了移植至小鼠颅窗下(图6A-F)。通过使用颅窗移植法，能够实现在移植动物活着的状态下对移植物内的血管内皮细胞和主方的血管的吻合、移植物内的肝前体细胞的增殖等的经时观察。在融合型肝芽移植组中，在移植2周后植活了30.8％的移植物，与此相对，在小型肝芽移植组中未观察到移植物的植活(分别为n＝13，n＝4)(图6A-F)。在融合型肝芽移植组中，融合型肝芽内观察到某种人血管网和主方的血管的吻合和血液灌注，显示在融合型肝芽内，重建的人血管网在发挥功能(图6G-H)。

·人iPSC融合型肝芽的细胞构成比率的研究

进行了在多个细胞构成比率条件下(iPS-HE∶HUVEC∶MSC＝10∶7∶1，10-7∶2，10∶7∶4，10∶7∶7)的融合型肝芽的制备。其结果，观察到MSC的比率越提高，血管网的网状结构越细的倾向(图7A-D)。根据该结果显示，能够通过使MSC的比率变化来控制融合型肝芽内的血管网结构。

·人iPSC融合型肝芽的尺寸控制的研究

对进行融合的小型肝芽的数量和融合型肝芽的尺寸进行了研究。在使小型肝芽600个进行融合的情况下，融合型肝芽的直径为约4mm(图8A)。在使小型肝芽1200个进行融合的情况下，融合型肝芽的直径为约6mm(图8B)。在使小型肝2400个进行融合的情况下，融合型肝芽的直径为约8mm(图8C)。根据该结果可知，融合型肝芽的尺寸能够通过进行融合的小型肝芽的数量来控制。

·制备人iPSC融合型肝芽时的细胞团块接种密度研究

对小型肝芽的大小及接种密度进行了研究。当将直径174μm，150μm，137μm的小型肝芽1200个接种到21mm³的细胞能够黏附的面中时，分别使接种密度为93％，85％，76％(图9)。当将直径150μm的小型肝芽600个，300个接种到21mm³的细胞能够黏附的面中时，分别使接种密度为65％，42％(图9)。另外，在培养9天后，在全部组中可得到融合型肝芽，确认到血管形成(图9)。在接种密度低于40％中，未能达成均一的细胞团块融合。

·制备融合型肝芽时的细胞比率的研究

对肝芽材料(HE，EC，MC)的细胞比率进行了研究。将HE∶EC∶MC的比率分别变化为10∶7∶7，10∶4∶4，10∶2∶2，10∶1∶1，10∶1∶2，10∶0.5∶2，制备成细胞团块后与上述同样配置为高密度(图10)。在培养9天后在全部组中可得到融合型肝芽，确认到血管形成(图10)。随着EC、MC的比率变少，观察到较细的重建血管变多的倾向(图10)。MC在为EC∶MC＝1∶0.01以下，或者EC在为EC∶MC＝0.01∶1以下时，细胞团块发生融合但没有观察到血管网的形成。

将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请全文作为参考并入本说明书中。

工业实用性

本发明可以利用在人类生物学、再生医疗、药物评价等中。