具体实施方式

在胎儿发育过程中，主动脉-性腺-中肾(AGM)中的一部分内皮细胞是造血内皮细胞，这些细胞改变其命运，成为最终定殖于胎儿肝脏和骨髓的HSC。然而，刺激造血内皮细胞的因素的特性仍然难以捉摸，限制了造血内皮细胞作为功能性HSC的潜在来源的实用性。血液流动介导的内皮内衬上的剪切应力刺激HSC的内皮出现。但是，使用Cdh5-无效的斑马鱼和鼠模型，确定尽管早期循环停止，但功能性HSC仍会出现。Anderson H,等人,Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin5expression.Blood2015。根据本公开内容，这些cdh5沉默的模型被用作研究触发功能性HSC出现的独立于剪切应力和/或一氧化氮合酶(NOS)的生物力学力的枢纽(pivot)，以研究其中脉冲压力介导的周向拉伸控制HSC出现的其它机制。

在实验室中从造血内皮细胞生成HSC的尝试大都是不成功的，部分是由于缺乏对刺激HSC从造血内皮细胞中出现的因素的了解。现在已经确定，由于来自跳动的心脏的脉动而引起的周向血管拉伸触发功能性HSC从造血内皮细胞中出现，这些HSC最终可以植入并分化为定型谱系(definitive lineages)。此外，在没有心跳和血液流动的情况下，拉伸敏感的瞬态受体电位阳离子通道亚家族香草酸成员4(transient receptor potential cationchannel-subfamily vanilloid member 4,Trpv4)通道的激活拯救了沉默心脏(tnnt2；sih)沉默的胚胎中HSC的形成。参见WO 2017/096215，其全部内容通过引用并入本文。

本公开至少部分地基于以下发现：对机械敏感受体(例如，Piezo1)的生物力学和/或药理激活增强了用于造血干细胞(HSC)形成的Dnmt3b表达。如本文所证明，cdh5-突变体(cdh5-MO)胚胎在没有心输出量和活跃的血液流动的血管中具有心跳介导的脉动。脉动来源的拉伸激活了Piezo1机械敏感通道，进一步增强了AGM中Dnmt3b的表达，以刺激内皮细胞向HSC的转变。对Piezo1进行脉动或药理激活的模拟还产生三倍高量的LT-HSC，它们在连续移植后重建为正常的、功能性多谱系成体血液。

因此，本公开的结果证明心跳介导的生物力学力如何通过激活机械敏感通道以及表观遗传机制来刺激细胞命运的转变和干细胞形成。LT-HSC的发育、扩增和干细胞特性维持是用于治疗血液和骨髓疾病的HSC移植和细胞疗法的主要挑战。本公开提供开发LT-HSC的遗传和药理学靶标。

在一些方面，本发明提供制备HSC的方法，该方法包括，提供包含内皮细胞(例如，HE细胞)的群体，并且在足以刺激HSC形成的条件下增加内皮细胞中DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)和/或GTP酶IMAP家族成员6(Gimap6)的活性或表达。可以恢复HSC以施用于患者。

Dnmt3b(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β)是一种DNA甲基转移酶。Dnmt3b主要位于细胞核，其表达受到发育调节。Gimap6是免疫相关蛋白(GIMAP)家族的GTP酶的成员。GIMAP蛋白包含GTP结合和卷曲螺旋基序。

在一些实施方案中，使内皮细胞与有效量的增加Dnmt3b的活性或表达的机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂接触。在一些实施方案中，机械敏感受体是Piezo1。示例性的Piezo1激动剂是Yoda1。

Yoda1(2-[5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]硫代]-1,3,4-噻二唑-2-基]-吡嗪)是为机械敏感离子通道Piezo1开发的小分子激动剂。Syeda R,Chemical activation of themechanotransduction channel Piezo1.eLife(2015)。Yoda 1具有以下结构：

Yoda1的衍生物可以用于各种实施方案中。例如，在一些实施方案中采用包含2,6-二氯苯基核的衍生物。示例性的激动剂公开于Evans EL,等人,Yoda1analogue(Dooku1)which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation,British J.of Pharmacology 175(1744-1759):2018中。

在一些实施方案中，Yoda1激动剂或衍生物的有效量的范围为约5μM至约500μM，或约5μM至约200μM，或约5μM至约100μM，或在一些实施方案中，约25μM至约150μM，或约25μM至约100μM，或约25μM至约50μM。

可选地，可以在内皮细胞或HE细胞中直接增加Dnmt3b的活性或表达。例如，可以通过将Dnmt3b编码的mRNA转录本递送至细胞，或通过引入编码Dnmt3b的转基因、或无转基因法、不限于引入附加体至细胞，来增加Dnmt3b的mRNA表达，这可使其中具有一个或多个核苷酸修饰(或编码的氨基酸修饰)，以增加或修饰活性。在一些实施方案中，采用基因编辑将基因修饰引入内皮细胞中的Dnmt3b表达元件，从而增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性、或影响RNA剪接。

在一些实施方案中，本发明包括在循环应变或Piezo1激活后单独或与Dnmt3b和/或其它修饰的基因组合在内皮细胞中增加Gimap6的活性或表达。为了增加Gimap6的活性或表达，可以将编码Gimap6的mRNA转录本引入细胞，也可以采用无转基因法，包括但不限于将附加体引入细胞；或可选地，编码Gimap6的转基因，这可使其中具有一个或多个核苷酸修饰(或编码的氨基酸修饰)以增加或修饰活性。在一些实施方案中，采用基因编辑在内皮细胞中向Gimap6表达元件引入基因修饰(例如一个或多个修饰以增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性、或影响RNA剪接)。

在一些实施方案中，例如通过直接化学合成或体外转录来合成产生mRNA和/或附加体(一种或多种)(例如，编码Dnmt3b或Gimap6)，并引入内皮细胞中。可以使用已知的化学修饰来避免细胞中的先天免疫应答。例如，仅包含典型核苷酸的合成RNA可以结合模式识别受体，并且可以在细胞中触发有效的免疫应答。该应答可导致翻译阻滞、炎性细胞因子的分泌、和细胞死亡。包含某些非典型核苷酸的RNA可以逃避先天免疫系统的检测，并可以高效地翻译成蛋白质。参见US 9,181,319，其通过引用并入本文，特别是关于避免先天免疫应答的核苷酸修饰。可以将mRNA通过已知方法一次或周期性地在HSC产生过程中引入细胞。

在一些实施方案中，通过将转基因引入细胞来增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达，这可以指导所需水平的过表达(具有各种启动子强度或表达控制元件的其它选择)。可以使用本领域已知的各种病毒载体或转染试剂引入转基因。在一些实施方案中，通过无转基因法(例如，附加体的递送)增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达。

在一些实施方案中，使用基因编辑技术，例如，引入一个或多个修饰以增加启动子强度、核糖体结合或RNA稳定性，来增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达或活性。各种编辑技术是已知的，包括CRISPR、锌指(ZF)和转录激活因子样效应物(TALE)。在一些实施方案中，通过无转基因法(例如，附加体的递送)增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达或活性。包含一个或多个这些DNA结合结构域和Fokl核酸内切酶的切割结构域的融合蛋白可用于在细胞中DNA的期望的区域中产生双链断裂(参见，例如，美国专利申请公开号US2012/0064620、美国专利申请公开号US 2011/0239315、美国专利号8,470,973、美国专利申请公开号US 2013/0217119、美国专利号8,420,782、美国专利申请公开号US 2011/0301073、美国专利申请公开号US 2011/0145940、美国专利号8,450,471、美国专利号8,440,431、美国专利号8,440,432、和美国专利申请公开号2013/0122581，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，如本领域中已知的，基因编辑是使用CRISPR相关的Cas系统进行的。参见例如US 8,697,359、US 8,906,616、和US 8,999,641，其全部内容通过引用并入本文。

在各种实施方案中，将包含发育可塑性内皮细胞或HE细胞的细胞群体引入生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器提供如WO 2017/096215中所述的循环应变生物力学拉伸，其全部内容通过引用并入本文。循环应变生物力学拉伸增加了Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达。在这些实施方案中，机械装置向细胞施加拉伸力。例如，附接至柔性培养板的尼龙或类似的生物相容性仿生膜的计算机控制的真空泵系统(例如，FlexCell^TM张力系统、Cytostretcher系统、或类似系统)可用于在限定和控制的循环应变条件下将2D或3D圆周拉伸体外施加至HE细胞。

在各种实施方案中，HSC转变由至少选自以下的手段诱导：Piezo1激活，机械拉伸，向Dnmt3b引入mRNA、转基因、无转基因(例如，附加体)、或基因修饰，和/或向Gimap6引入mRNA、转基因、无转基因(例如，附加体)、或基因修饰。

所述HE细胞可获自或源自患有血液、骨髓、代谢、或免疫疾病的受试者。在一些实施方案中，所述受试者没有血液系统恶性肿瘤。可以将HSC的群体施用于接受者。对于自体HSC移植，HE细胞将源自该接受者。

在一些实施方案中，HE细胞获自或源自诱导的多能干细胞(iPSC)、非造血干细胞、或体细胞，包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞。在一些实施方案中，HE细胞获自或源自HLA无效细胞、HLA修饰的细胞、和/或无转基因细胞，或来自内皮细胞对HE细胞的遗传诱导。可以任何方式获得造血内皮细胞(例如，Flkl+CD45+细胞、Flkl+CD41+细胞或CD31+CD43+细胞)，包括从同种异体供体的源细胞或从用HSC处理的受试者中获得。例如，HE细胞可以通过将自体或同种异体细胞化学、遗传、无转基因、或附加体诱导为造血内皮细胞而获得。在一些实施方案中，HE细胞是由iPSC产生的，iPSC是由接受者的细胞、或由HLA修饰的细胞、或由作为HLA无效细胞的细胞产生的。在一些实施方案中，HE细胞获自或源自受试者的细胞，其中受试者是通用相容供体。制备造血内皮细胞的方法是本领域已知的，包括从人多能干细胞中产生。参见，WO 2017/096215和US 2019/0119643，其全部内容通过引用并入本文。还参见Ditadi等人，Nature Cell Biol.17(5)580-591(2015)；Sugimura等人,Nature 2017；545(7655):432-438；Nakajima-Takagi等人,Blood.2013；121(3):447-458；Zambidis等人,Blood.2008年11月1日；112(9):3601-14和Park等人,Cytometry A.2013年1月；83(1):114-126(用于有效hiPSC分化的基于人拟胚体(hEB)造血内皮细胞分化方法)；Choi等人,CellRep.2012年9月27日；2(3):553-567(与OP9共培养的hPSC分化)；Sandler等人,2014年7月17日；511(17509):312-318(内皮细胞到造血细胞)；也参见Sluvkin,Blood 2013122:4035-4046。在一些实施方案中，启动HSC产生的HE细胞的数量为至少约10⁶个细胞、约10⁷个细胞、或至少10⁸个细胞。在一些实施方案中，根据本公开产生的造血干细胞包含长期造血干细胞(LT-HSC)，其表现出优异的植入，并在接受者中重建为功能性多谱系成体血液。在一些实施方案中，HSC包括Lin-/Sca1+/c-kit+细胞。

在各种实施方案中，制备用于细胞疗法的药物组合物，其包含通过本文所述方法制备的HSC的群体，以及药学上可接受的载体。该药物组合物可以包含至少约10²个HSC、或至少约10³个HSC、或至少约10⁴个HSC、或至少约10⁵个HSC、或至少约10⁶个HSC、或至少约10⁷个HSC、或至少10⁸个HSC。例如，在一些实施方案中，施用药物组合物，其包括每千克接受者体重约100,000至约400,000个(CD34+)HSC(例如，约200,000个细胞/kg)。

在一些实施方案中，可以在相对短的时间段，例如少于两个月、或少于一个月、或少于约两周、或少于约一周、或少于约6天、或少于约5天、或少于约4天、或少于约3天产生用于治疗或移植的HSC。在一些实施方案中，以增加的Dnmt3b和/或Gimap6活性或表达培养内皮细胞1至4周。

所述细胞组合物可进一步包含适合于静脉内输注或其它施用途径的药学上可接受的运载体(carrier)或载体，并且可包含合适的冷冻保护剂。示例性运载体是DMSO(例如，约10％DMSO)。可以在单位小瓶或袋中提供细胞组合物，并冷冻保存直至使用。在某些实施方案中，组合物的体积为约一流体盎司至一品脱。

将使用本文所述方法产生的HSC例如通过静脉内输注或骨髓内移植施用给受试者(接受者)。所述方法可以按照清髓性、非清髓性、或基于免疫毒素的(例如抗c-Ki、抗CD45等)调节方案来进行。

本文所述的方法可用于产生HSC的群体，以用于移植方案，例如治疗血液(恶性和非恶性)、骨髓、代谢、和免疫疾病。在一些实施方案中，HSC群体源自自体细胞或通用相容供体细胞或HLA修饰的或HLA无效细胞。即，HSC群体是由HE细胞产生的，所述HE细胞源自发育可塑性内皮细胞或iPSC，它们是由接受者受试者的细胞制备或由供体细胞(例如，通用供体细胞、HLA匹配细胞、HLA修饰的细胞、或HLA无效细胞)制备。在一些实施方案中，使用自体来源的细胞，并且接受者受试者患有选自以下的病况：多发性骨髓瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金病；急性髓系白血病；成神经细胞瘤；生殖细胞瘤；自身免疫病症(系统性红斑狼疮(SLE)，系统性硬化)；骨髓增生异常综合征、淀粉样变性；或使用自体HSC移植可治疗的其它病况。在一些实施方案中，使用自体来源的细胞(例如，HSC是从来自接受者受试者的细胞中产生的)，并且接受者受试者不具有血液系统恶性肿瘤。

在一些实施方案中，接受者受试者患有选自以下的病况：急性髓系白血病；急性淋巴细胞白血病；慢性髓系白血病；慢性淋巴细胞性白血病；骨髓增生性疾病；骨髓增生异常综合征；多发性骨髓瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金病；再生障碍性贫血；纯红细胞发育不全；阵发性夜间血红蛋白尿；范可尼贫血；重度地中海贫血；镰状细胞性贫血；严重的联合免疫缺陷症(SCID)；Wiskott-Aldrich综合征；噬血细胞性淋巴组织细胞增生症；天生的新陈代谢错误；大疱表皮松解；严重的先天性中性粒细胞减少症；Shwachman-Diamond综合征；先天性纯红细胞再生障碍性贫血；和白细胞粘附不足。在一些这样的实施方案中，同种异体来源的或通用相容的供体细胞或HLA修饰的或HLA无效的细胞用于产生HE细胞。例如，HSC从供体受试者即接受者受试者以外的受试者的细胞中产生。在一些实施方案中，基于血液类型和人白细胞抗原(HLA)分型，将供体受试者与接受者受试者配对。

如本文所用，术语“约”是指相关数值的±10％。

现在将通过以下非限制性实施例描述本发明的这些和其它方面。

实施例

在确定的造血作用过程中，第一组HSC是在胎儿发育期间从AGM中的造血内皮细胞中产生的。因此，只要建立存在于AGM微环境中的内在和外在因素库，内皮细胞和/或造血内皮细胞就可以成为临床使用的用于发育或扩增HSC的来源。

诱导七个转录因子(ERG、HOXA5、HOXA9、HOXA10、LCOR、RUNX1、和SPI1)，以及抑制TGFβ和CXCR7或激活BMP和CXCR4，增强人内皮细胞向HSPC的转变。然而，这些方法不赋予内皮细胞或造血内皮细胞以LT-HSC功能和特性。血液流动介导的剪切应力以及随后的NOS激活是引起HSC形成的唯一已知生物力学因素。然而，尽管血液流动存在缺陷，但cdh5-MO胚胎仍会产生HSC，以及L-NAME介导的NOS抑制。因此，至关重要的是确定生物力学力、机械敏感途径、和表观遗传机制，不仅在调节HSC的形成过程中相互影响，而且在开发长期(LT)、自我更新的HSC中具有实用性。

心跳先于并通过在血管中产生脉动来触发循环。然而，在没有循环的情况下，来自血管的主动脉内皮内衬的心跳介导的生物力学力在HSC形成中的直接作用尚不清楚。脉动引起血管的生物力学拉伸并激活机械敏感受体，例如瞬时受体电势(TRP)通道、Piezo通道、退变素(degenerin)/上皮钠通道(DEG/ENaC)、和K1-家族成员。然而，尚不清楚脉动或机械敏感受体激活是否能刺激HSC的形成。即使Lis等人.(Lis R,等人.Conversion of adultendothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells Nature 2017)和Sugimura等人.(Sugimura等人.Haematopoietic stem and progenitor cells fromhuman pluripotent stem cells Nature 2017)展示了一种将人造血内皮细胞转化为HSPC的方法，尚不清楚哪种机制可以永久消除其内皮表观遗传环境而成为LT-HSC。

如本文所公开，本公开说明Piezo1机械敏感途径的心跳和/或脉动介导的生物力学拉伸和/或药理激活如何增强Dnmt3b表达，从而消除内皮的表观遗传环境而形成HSC(例如，LT-HSC)。此外，还开发了一种模拟脉动样条件的生物反应器，并将Piezo1确定为刺激和扩大LT-HSC形成的药理学靶标。

心跳介导的脉动刺激内皮细胞向HSC的转变。

无偏斑马鱼乙基亚硝基脲(ENU)诱变筛选产生了malbec(bw209^mlb)，斑马鱼的cadherin-5(cdh5,ve-cdh)的突变体。尽管存在血液循环缺陷，但malbec和cdh5突变体(MO)胚胎仍显示正常的原始和确定的造血作用。

为了识别刺激内皮细胞向HSC转变的血液流动和与剪切应力无关的生物力学力，在cdh5缺陷型胚胎中分析心脏以及血管的功能和解剖结构。

首先通过在斑马鱼胚胎的两室心脏的心房中注入荧光葡聚糖珠进行微血管造影，然后在循环中跟踪葡聚糖珠。在荧光葡聚糖珠在对照胚胎中通过房室(AV)瓣和心室进入体循环的同时，它们被困在cdh5突变体胚胎的心房中。

为了检查心脏的结构，从对照和cdh5沉默胚胎中分离心脏，并对内皮内衬(gfp)和心肌细胞(mf20)进行了免疫组织化学。发现在cdh5突变体中形成了心房(A)、房室(AV)瓣、心室(V)、和流出道(OT)，但该AV瓣被拉长并变形。

为了研究循环在cdh5沉默胚胎中受损的原因，分析了血管结构，以及在cdh5沉默胚胎中的血液循环、心率、心输出量、和心脏压塞。

在mlb x kdr:dsRED胚胎中分析了内皮内衬的完整性。发现在cdh5缺陷型胚胎中动脉和静脉的结构均完好无损。

在斑马鱼、小鼠和人中，心脏、心跳、血管、血液循环、和HSC形成的时序发育是保守的。在斑马鱼发育过程中，心脏在受精(hpf)后约23小时开始跳动，血液循环大约在24-26hpf时开始，并且确定的HSC在30-48hpf之间从AGM区域中的造血内皮细胞中出现。

为了分析心脏开始跳动前后血管的循环，对对照和cdh5沉默的lcr:eGFP x flk1:mCherry胚胎进行了延时共聚焦成像。

发现即使在心脏开始跳动后，cdh5沉默胚胎的血管中仍积聚了lcr:eGFP⁺红血细胞；证实了尽管心跳开始并形成血管，但cdh5突变体中没有活跃的循环。

为了检查cdh5沉默胚胎中心脏的功能，进行了电生理和超声心动图评估。cdh5-MO胚胎的心率与对照组相当，但cdh5-MO胚胎的每搏输出量(stroke volume)几乎为零。因此，确定cdh5-MO胚胎的心输出量(＝每搏输出量X心率)受损。

cdh5-MO胚胎在心腔中有心囊水肿，这可能是由于血液从心脏回流造成的。心包空间中积聚的液体会导致心室充盈减少以及随后的血液动力学损害。为了检查心脏压塞是否是心包空间液体积聚的一个因素，像心包穿刺术一样，刺穿cdh5-MO胚胎的心脏腔，然后吸出心包液以减少心脏上形成的液体压力。但是，无法挽救cdh5突变体心脏的心输出量不足。

cdh5突变体的心跳是正常的，但是由于心脏的结构缺陷，它们的心输出量受损，导致心包腔中血液的积聚。由于cdh5-MO胚胎具有正常的造血作用，因此假设在没有活跃的循环的情况下，心跳来源的生物力学力影响HSC的形成。

尽管cdh5-MO胚胎具有跳动的心脏并且没有活跃的循环，但是它们在其血管的主动脉内皮中形成了HSC。当放大对照斑马鱼胚胎的AGM时，注意到血管的明显脉动。为了区分独立于循环血细胞和或许是血液流动的血管中脉动的存在，比较血管的脉动频率与循环血细胞的脉动频率以及由于血液流动引起的运动。具体而言，对在lk1:mCherry⁺血管内具有循环lcr:eGFP⁺红细胞的双转基因品系进行延时共聚焦成像，并对来自血管和循环血细胞的信号进行傅立叶分析。发现血管的频谱具有明显的峰。因此，血管中的脉动和血液流动并存，但是它们的存在和性质是相互独立的。

为了研究在36hpf时AGM中脉动的时间、空间和功能存在，对对照斑马鱼胚胎的血管区域进行光片照明显微镜观察(light sheet microscopy)，然后进行傅立叶分析。数据进一步证实了AGM在36hpf时具有明显的脉动频率；这是从flk1:eGFP⁺内皮细胞产生的runx1:mCherry⁺HSPC的延时共聚焦成像中观察到的内皮细胞向造血细胞转变的时间和位置。总之，发现AGM区域是脉动的，并且AGM中的脉动与内皮细胞向造血细胞转变同时发生。

血管承受来自心跳介导的血液压力和流动的恒定机械负荷，从而引起周壁应力和内皮剪切应力。当血液流动在内皮细胞上施加剪切应力并引起血管舒张时，心跳介导的脉动则产生周向拉伸，并对内皮细胞和平滑肌细胞造成机械性扩张。

为了分析cdh5-MO胚胎是否通过或独立于血液流动和剪切应力介导的NOS激活而形成HSC，分析了经NOS抑制剂L-NAME处理的对照和cdh5-MO胚胎中的HSPC表达。已经证明，NOS的抑制减弱了对照胚胎中HSPC的形成，但不影响cdh5-MO胚胎中的HSPC的形成。因此，cdh5-MO胚胎形成HSC与NOS激活无关。

总而言之，心跳介导的脉动刺激内皮细胞向HSC的形成，而与循环无关。

拉伸激活Piezo1以形成HSC。

由于生物力学力刺激细胞的形状和命运转变，因此推测脉动介导的造血内皮的周期性拉伸刺激了HSC的形成。

为了试验脉动在内皮细胞向HSC形成中的功能，开发了一种生物反应器，其可以对从E11.5小鼠胚胎收集的AGM细胞施加循环应变(图2A，上图)。造血细胞集落的形成和流动分析实验表明，10％的循环应变可增强多能造血祖细胞的形成，这种细胞可被GdCl₃介导的拉伸激活受体(SAR)的泛药理抑制作用所减弱。GdCl₃也将斑马鱼胚胎中的HSPC表达减至sih-MO胚胎水平。

SAR家族成员具有四个子类别：K1-家族成员以及Piezo、TRP、和DEG/ENaC通道。组织表达和计算分析显示，内皮和造血组织中存在Piezo1和Trpv4，因此在内皮细胞向HSC的转变中试验它们的作用。

trpv4和piezo1的功能丧失分析和药理抑制作用消除了HSPC标志物的表达以及内皮细胞向HSC的转变(图1A)。相反，trpv4或piezo1的药理激活增强了对照胚胎中HSPC标志物的表达，并挽救了sih胚胎中的HSPC表达。通过时空分析，在36hpf时斑马鱼胚胎的AGM区域中未检测到trpv4，而Piezo1在E11.5 AGM中与Cd31(内皮细胞)和c-Kit(造血细胞)共定位。

为了巩固潜在的拉伸介导的HSC形成的分子机制，进行了用循环应变或Piezo1的药理激活剂处理的AGM的全转录组分析。发现循环应变和Piezo1活化激活产生相似的基因标签(图1B)。

Piezo1的药理激活进一步增强了多能造血祖细胞的形成(图1C)，而Piezo1的药理抑制作用减弱了循环应变介导的HSPC形成的诱导(图1D)。总之，循环应变介导的生物力学拉伸激活Piezo1以刺激内皮细胞向HSC的转变。

生物力学拉伸或Piezo1激活产生LT-HSC。

为了分析循环应变或Piezo1激活是否产生长期的、自我更新的HSC(LT-HSC)，进行连续移植分析。循环应变或Piezo1活化剂处理的AGM的初次移植体显示更高的植入和正常的多谱系重建(图2A，图2B)。同样，移植有循环应变或Piezo1活化剂处理的AGM的初次接受者的骨髓，显示出Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺Cd48^-Cd150⁺HSC的2至3倍高的量。将初次接受者来源的分选的Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺HSPC移植到免疫受损的二次接受者内，也导致更高的植入和正常的多谱系重建(图2C，2D)。因此，预测循环应变和/或Piezo1激活均会产生较高量的正常LT-HSC。为了检验该假设，通过将分级量的Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺HSPC移植到免疫受损的三次接受者内进行有限稀释测定。三次移植分析表明，循环应变产生两至三倍高的量的LT-HSC。

为了研究AGM-HSC(供体)是否植入并重建到成体正常血液中，接着在移植有对照、循环应变或Piezo1活化剂处理的AGM的初次接受者中分析重建的血液谱系的分子特征和功能特性。在Bcl11a存在的情况下，以胚胎球蛋白为代价，对供体来源的红系细胞在骨髓中的分析显示Cd71⁺/Ter119⁺的表达，以及成体球蛋白标志物的增强的表达(图3A)。进一步的骨髓和血液血清中的供体来源的髓系细胞的分析显示足够量的Gr1⁺/Mac1⁺髓系细胞，以及它们的髓过氧化物酶(MPO)的产生(图3B)。接下来，对淋巴结，胸腺、和脾脾脏中的供体来源的嵌合体、Mac1⁺髓系细胞、Cd19⁺B细胞、以及Cd4⁺/Cd8⁺T细胞进行分析，证明了供体HSC来源的祖细胞在造血龛中循环并定殖，以重建为成体血液谱系。在对初次移植体来源的血液血清进行分析时，还发现它们产生了预免疫的免疫球蛋白(Ig)例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA和IgM的正常库(图3C)。脾脏中供体来源的Cd3⁺T细胞的分选显示T细胞受体β(TCRβ)重排，而这在脾脏中供体来源的Mac1⁺髓系细胞(阴性对照)中是不存在的(图3D)。为了分析初次移植体中T细胞的功能特性，迟发型超敏反应测定法通过用绵羊红血细胞注射使初次移植体致敏，证明了抗原特异性功能性T细胞在脚掌中的成功募集(图3E)。因此，AGM或造血内皮细胞的循环应变或Piezo1激活产生植入造血龛并重建为功能性多谱系成体血液的HSC。

生物力学拉伸和Piezo1激活上调Dnmt3b，使内皮细胞向HSC转变。

由于AGM是异质组织，因此尚不清楚拉伸介导的Piezo1激活如何刺激主动脉内皮细胞命运转变为HSC。开发从E10.5 AGM分选的内皮细胞、造血内皮细胞、和HSC的差异基因表达签名。在AGM来源的内皮细胞、造血内皮细胞、和HSC的背景下，在AGM的循环应变或Piezo1激活下产生的基因签名的层次聚类还提供过表达的生物过程、分子途径、基因表达簇、及其基因本体(GO)术语的定量概述。内皮细胞向HSC转变过程中的循环拉伸和/或Piezo1激活介导的基因的上调的维恩图分析确定Dnmt3b是导致HSC形成所需的内皮机制沉默的潜在候选机制(图4)。另外，确定Gimap6也是导致HSC形成所需的内皮机制沉默的潜在候选机制。

为了验证生物信息学和计算分析，分析了Dnmt3b在E11.5 AGM中的时空蛋白表达。免疫组织化学测定表明，Dnmt3b与Cd31⁺内皮细胞和c-Kit⁺造血细胞共定位。因此，假设Dnmt3b可以刺激内皮细胞向HSC的转变。

尽管Dnmt3b和Dnmt3a具有高度同源性，并且在HSC维持或分化中具有独特的功能，但它们在AGM中内皮细胞向HSC的潜在作用尚不清楚。基因签名和组织表达分析排除了Dnmt3a参与AGM中HSC的形成的任何可能。为了区分Dnmt3b和Dnmt3a的独特或重叠的造血作用，在循环应变或Yoda1处理的AGM细胞的细胞核部分中分析Dnmt3b和Dnmt3a的蛋白水平，从而确定循环应变或Piezo1激活在E11.5 AGM细胞中刺激Dnmt3b蛋白表达，而不是Dnmt3a蛋白表达(图5A)。

为了分析在没有血液流动的情况下血管的脉动是否通过Dnmt3b激活来刺激HSC形成，在用Dnmt3b抑制剂七尾霉素处理的cdh5-MO胚胎中测定HSPC标志物的表达。Dnmt3b的药理抑制作用减弱了对照和cdh5-MO胚胎中的HSPC标志物表达。

接下来，本实施例的实验分析了生物力学拉伸或Piezo1激活是否通过Dnmt3b激活刺激内皮细胞向造血细胞的转变。发现Dnmt3b的抑制减弱了生物力学拉伸或Piezo1激活介导的多能造血祖细胞形成的诱导(图5B)，以及内皮细胞向造血细胞的转变(图5B)。尽管七尾霉素处理将造血细胞还原为表型内皮细胞，但这种内皮细胞没有功能。经七尾霉素处理或dnmt3b-MO注射的同时用Yoda1处理或不用Yoda1处理的斑马鱼胚胎的HSPC标志物的整体原位杂交，以及内皮细胞向HSC转变的延时成像进一步证实了dnmt3b的抑制或丧失减弱了Piezo1激活介导的HSC形成的增加(图5C)。总之，脉动介导的Piezo1激活增强AGM中Dnmt3b的表达，以刺激内皮细胞向HSC的转变。

由人iPSC产生的HE细胞产生HSC

如((Sugimura等人.2017；Ditadi等人.2015)中所述进行胚状体和造血内皮分化。简而言之，在37℃下用0.05％胰蛋白酶将hiPSC集落解离5分钟，用PBS+2％FBS洗涤，然后重悬于补充有L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素/链霉素(10ng/ml)、抗坏血酸(1mM)、人全-转铁蛋白(150μg/ml,Sigma T0665)、一硫代甘油(MTG,0.4mM)、BMP4(10ng/ml)、和Y-27632(10μM)的StemPro-34(Invitrogen,10639-011)中。将五百万个细胞接种到10cm的培养皿(Ezsphere,Asahi Glass)中以形成球状体。在第1天，将bFGF(5ng/ml)和BMP4(10ng/ml)添加到培养基中。在第2天，用补充有SB431542(6μM)、CHIR99021(3μM)、bFGF(5ng/ml)、和BMP4(10ng/ml)的StemPro-34更换培养基。在第3天，将培养基替换为补充有VEGF(15ng/ml)和bFGF(10 ng/ml)的StemPro-34。在第6天，将培养基更换为补充有bFGF(5ng/ml)、VEGF(15ng/ml)、白介素(IL)-6(10ng/ml)、IGF-1(25ng/ml)、IL-11(5ng/ml)、SCF(50ng/ml)和EPO(2IU)的StemPro-34。将细胞维持在5％CO₂、5％O₂和95％湿度的培养箱中。所有细胞因子均购自Peprotech。

为了分离CD34⁺细胞，将胚状体(从第8天开始)用0.05％的胰蛋白酶解离，通过70μm过滤器过滤，通过CD34磁珠染色分离CD34⁺细胞，然后通过LS柱(Miltenyi)。通过FACS对每批样品进行试验，以验证其板的纯度。使用了以下抗体：CD34-PEcy7(Clone 581；Biolegend)、FLK1-PE(CLONE#89106；BD)、和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。

将分离的CD34⁺细胞重悬于StemPro-34培养基中，该培养基包含Y-27632(10μM)、TPO(30ng/ml)、IL-3(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-11(5ng/ml)、IGF-1(25ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、bFGF(5ng/ml)、BMP4(10ng/ml)、和FLT3(10ng/ml)(Ferrel等人2015)。将细胞以每孔50,000个细胞的密度接种到薄层基质胶包被的24孔板上。接种后一天，将Yoda1(介于6.25和100μM)添加到培养物中。7天后，收集漂浮的细胞并进行FACS分析。为了进行FACS分析，将细胞用CD34-PEcy7(Clone 581；Biolegend)和CD45-APC(clone 2D1；Biolegend)染色。所有细胞因子均购自Peprotech。

Yoda1在人iPSC来源的HE细胞中诱导内皮细胞向造血细胞的转变(数据未显示)。该作用是剂量依赖性的。

结论

长期HSC的发育、扩增、和维持一直是干细胞生物学和造血作用的圣杯。基于对斑马鱼的延时共聚焦、光片照明、和傅立叶变换分析，不仅建立了可扩展的生物反应器来模拟血管中的脉动，而且还将Piezo1激活确定为内皮细胞转化为LT-HSC的药理学靶标。这项研究提供了一种新型的无转基因方法，可以在连续移植下开发可以植入、自我更新、和重建为多谱系功能性成体血液的LT-HSC。

心跳介导的脉动产生周向拉伸，并引起内皮细胞和平滑肌细胞的机械性扩张。然而，Piezo1在E11.5 AGM中的内皮细胞和造血细胞之间共表达，但在血管的血管平滑肌细胞中却不表达，这表明生物力学拉伸和Piezo1激活的造血作用是AGM-内皮细胞固有的。

血管的生物力学拉伸可以激活Piezo1、Trpv4、K1-家族成员、以及DEG/ENaC通道。Piezo1和Trpv4激活均刺激内皮细胞向造血细胞的转变。但是，只有Piezo1抑制作用减弱了拉伸介导的造血作用，这表明Piezo1和Trpv4可能具有部分重复的作用。

Dmnt3b激活使内皮机制沉默，赋予HSC自我更新和多谱系重建的能力。尽管对Dnmt3b的抑制使造血细胞恢复为表型内皮细胞，但这些细胞缺乏功能性内皮细胞特性。这表明Dnmt3b在内皮细胞向造血细胞转变中的时空作用是不可逆的。生物力学拉伸或Piezo1激活增强Dnmt3b的时空表达，而不会影响Dnmt3a的表达。数据表明，在HSC发育和分化过程中，Dnmt3b的造血作用与Dnmt3a的白血病作用之间存在区别。

本文公开的发现证明了生物力学力如何通过调用表观遗传机制来刺激细胞命运的转变和赋予干细胞自我更新能力。这项研究还提供了从多能干细胞(PSC)或供体细胞来源的内皮细胞或造血内皮细胞中获得LT-HSC的平台。尽管我们的目标是开发通用相容的HSC，但当通用相容的非转基因来源的细胞可用于治疗患有良性和恶性血液、代谢，免疫、和骨髓疾病的患者时，本文公开的生物仿生型生物反应器便是踏脚石。

材料和方法

所有程序均已获得布里格姆妇女医院和波士顿儿童医院动物的保护和使用委员会(the Animal Care and Use Committees of Brigham and Women’s Hospital andBoston Children’s Hospital)的批准。

从Jackson实验室购买小鼠Cd45.2(C57BL6/J)和Cd45.1(SJL)，从GeneTools购买吗啉代斑马鱼(zebrafish morpholinos)。通过将荧光标记的葡聚糖染料注入斑马鱼心脏的心房进行微血管造影术，并通过实时成像记录其通过。斑马鱼心脏和小鼠AGM的免疫染色使用倒置荧光显微镜分析。使用明场成像或延时共聚焦显微镜分析斑马鱼胚胎中的心脏压塞、心跳、脉动频率。使用延时共聚焦成像分析斑马鱼转基因胚胎中血管中红血细胞的运动以及内皮细胞向HSC的转变。

使用Flexcell FX-4000机器在体外刺激脉动血管等状况。为了分析药理学靶标在调节内皮细胞向HSC转变的调控中的作用，将小鼠胚胎来源的AGM或整个小鼠胚胎离体暴露于生物力学拉伸、化学品、或药物。接下来，通过将小鼠AGM来源的细胞在StemCell M3434培养基中孵育7天来进行造血集落形成测定。对致命照射的SJL小鼠进行AGM来源的HSC的连续移植。使用有限稀释测定法分析生物力学拉伸后的干细胞频率。为表征初次移植体中AGM-HSC来源的血细胞的特性，使用FACS测定嵌合和重建百分比，使用定量逆转录酶-PCR分析球蛋白转录本，使用PicoKine ELISA试剂盒测定髓过氧化物酶量，使用TCR-β基因座的PCR分析TCR-β重排，使用Thermo-Fisher小鼠Ig分型试剂盒分析预免疫IG检测，和通过在预致敏小鼠的脚掌中注射绵羊RBC(Rockland Immunochemicals)来分析迟发型超敏反应。

进行RNA测序分析以测定用循环应变或药理学调节剂处理的小鼠AGM中的基因表达模式。使用计算算法，对差异表达的基因进行层次聚类，以及测定它们过度显示的生物学过程和途径。分析差异表达基因的基因表达簇，并比较它们在整个细胞群中的平均表达水平。接下来，构建上基因和下基因的维恩比较，以分析对循环应变或药理学调节剂介导的内皮细胞向HSC转变重要的候选物(一种或多种)。此外，使用EqiQuick测定试剂盒分析小鼠AGM细胞的细胞核部分中的Dnmt3b和Dnmt3a蛋白的表达。除非另有说明，否则数据表示为平均值±s.d。统计分析是通过配对或未配对的学生t检验进行的。在P<0.05设定显著性。

动物

实验使用野生型AB、Casper、和转基因斑马鱼品系lcr:eGFP、flk1:mCherry、flk1:eGFP、cd41:eGFP。胚胎使用长达4天。实验使用来自Jackson实验室的Cd45.2(C57BL6/J)和Cd45.1(SJL)小鼠。

吗啉代

获得吗啉代反义寡核苷酸(Gene Tools；序列如下)，并将其注射入一细胞期casper斑马鱼胚胎中。将注射和未注射的胚胎在E3培养基中于28℃孵育，直至固定。

cdh5-MO(5’-TACAAGACCGTCTACCTTTCCAATC-3’；SEQ ID NO:1)

sih-MO(5’-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3’；SEQ ID NO:2)

piezo1-MO(5’-CAAAGTTCAGTTCAGCTCACCTCAT-3’；SEQ ID NO:3)

dnmt3bb.1-MO1(5’-TTATTTCTTCCTTCCTCATCCTGTC-3’；SEQ ID NO:4)

dnmt3bb.1-MO2(5’-CTCTCATCTGAAAGAATAGCAGAGT-3’；SEQ ID NO:5)

胚胎的化学处理

用以下化学调节剂在E3鱼培养基中处理斑马鱼胚胎：100uM L-NAME(FisherScientific)、50uM洋地黄毒苷配基(Sigma)、25-50uM Yoda1(Cayman Chemical)、1uM七尾霉素(Nana；Fisher Scientific)、100uM氯化钆(GdCl₃；Sigma),5-10uM 4α-佛波醇12,13-二癸酸酯(4α-phorbol 12,13-didecanaote)(4Αpdd；Sigma)、或GSK205(10uM)。

微血管造影术

将荧光染料标记的葡聚糖珠注射到对照和cdh5-MO胚胎的心房中，并使用NikkonSMZ1500立体显微镜捕获实时明场视频。

心率和心输出量

在带有5倍物镜的Axioplan(Zeiss)立式显微镜上使用集成的白炽灯照明和带有512×480像素灰度图像传感器的FastCam-PCI高速数码相机(Photron)，获取活斑马鱼心脏的图像。以每秒250帧获取图像，每种情况下获取1088帧(′8个心动周期)。使用定制软件(在MATLAB中实现)从顺序图像文件中确定心率。对于每个视频，使用ImageJ手动测量舒张期和收缩期的心室长轴和短轴，并用于估计使用标准几何假设的心室体积。对于每个吗啉代剂量至少十个胚胎，将心输出量测量为心脏舒张心室体积减去心脏收缩心室体积，乘以心率(Shin等人，2010)。

周期性分析

将斑马鱼Casper胚胎包埋入含有三卡因(Sigma)的0.8％低熔点琼脂糖中，并固定在培养皿中。接下来，使用配备NIS Elements(Nikon)软件的Nikon SMZ1500立体显微镜捕获AGM区域中脉动血管的实时明场视频。视频被用来量化血管中的脉动频率。

明场实时成像

为了进行明场实时成像，将斑马鱼Casper胚胎包埋入含有三卡因(Sigma)的0.8％低熔点琼脂糖中，并固定在培养皿中。使用配备NIS Elements(Nikon)软件的NikonSMZ1500立体显微镜捕获实时明场视频和静止图像。

共聚焦显微镜

将cd41:eGFP融合至flk1:mCherry斑马鱼和具有lcr:eGFP的flk1:mCherry斑马鱼，并在其转基因胚胎中注入吗啉代。将转基因胚胎置于低熔点琼脂糖中，并使用旋转盘共聚焦显微镜从30至42hpf对由flk1⁺内皮细胞产生的cd41:eGFP⁺HSC进行延时共聚焦成像。在flk1:mCherry⁺内皮细胞的背景下分析lcr:eGFP⁺红血细胞的相对运动。我们使用Imaris(Bitplane)软件进行图像分析。

整体原位杂交

如前所述进行整体原位杂交。

心脏压塞

在48hpf时使用微注射针刺穿心包膜囊并释放cdh5-MO注射的斑马鱼胚胎的心脏周围积聚的液体。

免疫染色

收获E10.5嵌合小鼠胚胎，包埋在石蜡块中，进行横向切片，并用一抗Piezo1(兔抗小鼠IgG；Abcam)、Cd31(驴抗小鼠IgG；R&D Systems)、c-Kit(兔抗小鼠IgG；R&D Systems)、或Dnmt3b(驴抗小鼠IgG；Abcam)和4,6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)抗体，以及二抗AlexaFluor 488(驴抗兔IgG；Fisher Scientific)和Alexa Fluor 647(驴抗山羊IgG；Abcam)进行免疫染色以检测其在E10.5 AGM区域的表达。

在从对照和cdh5-MO沉默的斑马鱼胚胎中分离的心脏中测定flk1(GFP)、mf2(mCherry)、和DAPI(violet)的表达。

AGM外植体

从C57BL6/J Cd45.2小鼠胚胎中收获E11.5 AGM，并将三胚当量的单细胞悬浮液接种到BioFlex六孔培养板(FlexCell)的每个孔中。我们施加循环应变(FX-4000^TM张力系统)和/或用化学调节剂(25-50μM Yoda1、1μM七尾霉素、100μM Gdcl₃、1uM GsMTx4、5-20μM 4αPDD、10uM GSK205)处理，将细胞过夜培养。接下来，将收获的细胞用于进行移植、荧光激活细胞分选(FACS)分析、和集落形成单位(CFU)测定。

药物与胚胎的离体孵育

E11.5小鼠胚胎从定期交配的怀孕雌性的子宫中获得，放入装有FBS、1mM葡萄糖、1％青霉素-链霉素、和/或选定的化学调节剂(25-50μM Yoda1,1μM七尾霉素、5-20μM 4αPDD、或10uM GSK205)的无菌玻璃小瓶中。我们将玻璃小瓶放在离体培养箱(BTCEngineering,Cambridge,UK)中，该培养箱由滚筒设备(旋转至～30rpm)、恒定气体供应量(21％0₂、5％CO₂、余量为N₂)和37℃恒温组成。24小时后，收获AGM以通过FACS和CFU测定分析造血细胞的形成。

移植

对于初次移植，将三胚当量的未经处理或已处理(循环应变或25μM Yoda1)的AGM加脾脏辅助细胞(每只小鼠约500,000个)通过眼眶后注射注入致死剂量辐射(分割剂量为10.5cGy)的Cd45.1(SJL)小鼠。对于二次和三次移植，从移植小鼠中分离出骨髓(腿、臂、骨盆骨、脊柱、胸骨)。将骨髓加载到Ficoll梯度(-1083,Sigma-Aldrich)上，并将血沉棕黄层的细胞与结合生物素的谱系抗体和链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec)一起孵育。接下来，使用MACS LS色谱柱(Miltenyi Biotec)分离谱系阴性(Lin^-)细胞，并使用MoFlo Beckman Coulter分选仪分选供体Cd45.2 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺(LSK)细胞。随后，将分选的Cd45.2 LSK细胞与Cd45.1脾脏辅助细胞混合(每只小鼠约500,000个)，并通过眼眶后注射移植到Cd45.1辐射(分割剂量为10.5cGy)的SJL小鼠中。

存活接受者被计为有限稀释测定的反应：根据泊松分布，由ELDA计算1/(干细胞频率)的置信区间。

CFU和FACS测定

为了进行CFU测定，将来自AGM外植体或离体的细胞接种在MethoCult GF M3434培养基(StemCell Technologies)中。接种后7天，我们分析了它们形成粒细胞、红系、巨噬细胞、巨核细胞(GEMM)、粒细胞巨噬细胞(GM)、粒细胞(G)、巨噬细胞(M)、和红系(E)集落的能力。

用Sca1-Pacific-Blue(E13-161.7,Biolegend)和Flk1-APC-Cy7(Avas 12α1,BD)对来自外植体和离体的AGM细胞进行染色。用以下抗体混合物对移植小鼠的血液进行染色：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Cd3-PE(145-2C11,Biolegend)、Cd8-PE(53-6.7,Biolegend)、Mac1-APC(M1/70,Biolegend)、Gr1-APC(108412,Biolegend)、Cd19-APC-CY7(6D5,Biolegend)、B220-APC-CY7(RA3-6B2,Biolegend)。

来自E11.5 AGM细胞移植小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、和淋巴结的细胞用以下抗体组染色：骨髓LT-HSC:Cd45.2-FITC(104,Biolegend)、Ter119-生物素(TER-119BD)、Gr1-生物素(RB6-8C5,BD)、Cd5-生物素(53-7.3,BD)、Cd8a-生物素(53-6.7,BD)、B220-生物素(RA3-6B2,BD)、链霉亲和素-Pacific Blue(eBioscience)、Sca1-PE-CY7(D7,eBioscience)、cKit-APC(2B8,eBioscience)、Cd48-APC-CY7(HM48-1,BD)、Cd150-PE-CY5(TC15-12F12.2,Biolegend)。骨髓中红系发育RI-RV：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Ter119-APC(TER-119,Biolegend)、Cd71-PE(R17217,eBioscience)。骨髓粒细胞：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Gr1-PE,(RB6-8C5,BD)；Mac1-APC(M1/70,Biolegend)。脾脏、胸腺和淋巴结T细胞：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Cd8-PE(53-6.7,Biolegend)、Cd4-APC(RM4-5,eBioscience)。脾脏、胸腺和淋巴结骨髓和B细胞：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Cd19-APC-CY7(6D5,Biolegend)、Mac1-APC(M1/70,Biolegend)。我们在BD Fortessa细胞仪上进行所有FACS分析。移植16周后，我们进行造血器官分析。

定量逆转录酶-聚合酶链反应分析(qRT-PCR)

FACS用于从AGM移植小鼠中分离出的未溶解的骨髓中分选红系前体(Cd45.2⁺,Ter119⁺,Cd71⁺)。使用RNAeasy Minikit(QIAGEN)分离总RNA，并使用Superscript III(Invitrogen)进行cDNA合成。使用SYBR Green(QuantaBio)在MX3000P机器上使用所示引物进行实时定量PCR(Sankaran等人,2009)。我们将表达标准化为3-磷酸甘油醛-脱氢酶(Gapdh)(Ochida等人,2010)。

髓过氧化物酶(MPO)表达

将中性粒细胞(Cd45.2⁺,Gr1⁺,Mac1⁺)从16周初次移植小鼠的分离的骨髓中进行FACS分选，并在24孔板中在含10％FBS的IMDM中过夜培养(500,000个细胞/mL)。收集上清液，并使用小鼠MPO/髓过氧化物酶PicoKine^TMELISA试剂盒(Boster)测定MPO浓度。还测定血液血清中的MPO浓度。

TCR-β重排的PCR测定

将T细胞(Cd45.2⁺,Cd3⁺)和髓系细胞(Cd45.2⁺,Mac1⁺)从16周初次移植小鼠的脾细胞中进行FACS分选。接下来，提取基因组DNA，并对TCR-β基因座内的DHβ2.1-JHβ2.7重排进行PCR。将我们的样品变性(94℃,1分钟)，退火(63℃,2分钟)，并延伸(72℃,2分钟)35个循环。引物序列如下：DHβ2.1的5'：5'-GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT-3'；SEQ ID NO:6，和JHβ2.7的3'：5'TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT；SEQ ID NO:7(Lu等人,2017)。

预免疫Ig检测

从16周初次移植的小鼠中分离出血液血清，并通过小鼠Ig分型试剂盒(ThermoFisher)对预免疫Ig同种型进行定量。

迟发型超敏反应

通过皮下(下背部)和皮内注射(右脚掌)，用绵羊红血细胞(sRBC，10⁹个细胞/mL，每个部位50μL，Rockland Immunochemicals)致敏移植小鼠。敏化六天后，在左脚掌中用2x10⁹个sRBC/mL和在右脚掌中用等体积PBS激发预敏小鼠(作为对照)。激发48小时后，用微型卡尺测量脚掌厚度。我们在第6天将每个脚掌的预激发厚度归一化为百分比变化。

DNA甲基转移酶表达

使用EpiQuik细胞核提取试剂盒(Epigentek Group Inc.)收获来自AGM外植体的细胞核提取物。根据制造商的说明，使用比色EpiQuik测定试剂盒(Epigentek Group Inc.)分析Dnmt3b和Dnmt3a蛋白水平。Dnmt3b和Dnmt3a的浓度是相对于1μg细胞核提取蛋白而言的。

RNAseq和计算分析

使用RNAeasy MiniKit(QIAGEN)分离E11.5小鼠AGM外植体培养物中的总RNA(对照、拉伸、Yoda1和4αPDD情况)。我们的cDNA文库是由BGI Americas Corporation生成的，并使用HiSeq4000设备(Illumina)进行测序，每个泳道有八个样本。我们使用基因组短读段核苷酸比对程序(2012-07-20版)将测序的读段片段映射到小鼠参考基因组GRCm38(ENSEMBL版本69)。DESeq2和DEXSeq分别用于试验差异表达(FDR＝0.1)和差异外显子的使用。分析差异表达基因的基因表达簇，并比较它们在整个细胞群中的平均表达水平。接下来，对上基因和下基因进行维恩比较，以分析对循环应变或药理学调节剂介导的内皮细胞向HSC转变重要的候选物(一种或多种)。具体来说，我们使用R(R Development Core Team，2012)中的gplots包(Warners等人，2017)通过引导程序分析进行层次聚类。对于GO分析，我们使用Fisher精确检验试验我们在GO类别或途径上差异表达基因的过量表达，并使用Bonferroni方法进行了多次试验的校正。我们进行了如前所述的GO项富集分析，使用0.001的P值作为具有统计学上显著富集的最小值。

统计分析

除非另有说明，否则数据以平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)表示。统计分析是通过配对或未配对的学生t检验进行的。在P<0.05设定显著性。