具体实施方式

在一方面，本文提供了一种适用于以工业规模生产造血细胞以满足细胞治疗需求的新方法。从3D培养的PSC开始，这些细胞首先被分化为造血内皮细胞(HEC)，其是具有双潜能的中间群体，既可以成为造血细胞系又可以成为内皮细胞系(Ditadi等.2015；Feng等.2014；Swiers等.2013)。转移到适合造血定向和扩增的条件后，大量的造血祖细胞(HPC)可以从3D球体中释放出来。可收获处于多个扩增阶段的祖细胞，分析其表型和功能，并冷冻保存。整个生产过程是在3D悬浮培养条件下开发的，可以方便地应用于市售的一次性搅拌罐生物反应器或其他大规模细胞生产装置。本文公开的方法是高效且可重复的，在过程中的任何时间都易于细胞取样和收获。本系统可定制用于生产各种分化阶段和不同谱系的细胞，例如HEC，造血干/祖细胞，红系/巨核细胞祖细胞，髓样祖细胞，淋巴样祖细胞，以及成熟的红细胞，血小板，T淋巴细胞和NK细胞。

在一些实施方式中，提供了一种高度可重复和可缩放的细胞生产平台技术，该技术能够以良好控制的逐步的方式高效地转变人PSC球体，首先成为包含高百分比HEC的球体。所述富含HEC的球体可随后转换成具有高造血活性的球体，能够释放大量都具有造血谱系潜能的HPC。这些HPC能稳定地分化成所有造血谱系细胞，包括但不限于：巨核细胞/血小板和自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，这些源自人PSC的NK细胞可以作为现成的产品用于癌症免疫疗法。

显然，使用本文公开的方法，在不含任何饲养细胞或运载体的明确的3D悬浮培养条件下生成细胞，能够方便地适用于各种形式的一次性生物反应器。其次，本文公开的3D培养方法和系统能够用于生产多种造血细胞。第三，本文公开的3D培养方法和系统是工艺友好的，因为HPC从球体自然地释放，这允许收获高活力高功能的细胞。

在一些实施方式中，估计本文公开的3D培养方法和系统输入输出比(PSC∶HPC)为至少1∶5，1∶10，至少1∶20，至少1∶30或约1∶31。例如，PSC∶HPC比率1∶31允许在工作体积为3升的单个生物反应器中生产高达5.6x10¹⁰个HPC。该平台的简单性为生产不同谱系细胞所需的任何系统调整提供了坚实的基础。该3D平台的可扩展性也使其成为生产用于自体和同种异体治疗的大规模细胞的理想选择。

定义

方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求中使用的特定术语汇集在此。除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所属领域普通技术人员通常所理解的含义。

本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例而言，“一个元件”表示一个元件或者一个以上的元件。

本文所用术语“约”表示在20％以内，更优选10％以内并且最优选5％以内。术语“基本(上)”表示超过50％，更优选超过80％并且最优选超过90％或95％。

本文所用“多个/多种”表示超过1个/种，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个/种，例如25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个/种，或其间任何整数。

如本文所用，术语“包含”或“包括”是针对存在于给定实施方式中的组合物、方法及其各自的组分来使用的，为开放式，可包含未指定要素。

如本文所用，术语“基本上由......组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明的该实施方式的基本和新颖的或功能的特征的附加要素。

术语“由......组成”指本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除了在该实施方式的描述中未列举的任何要素。

术语“胚胎干细胞”(ES细胞或ESC)是指已经作为细胞系连续传代的源自囊胚或桑椹的胚内部细胞团的多能干细胞。ES可以源自卵细胞与精子或DNA的受精、核移植、孤雌生殖等。术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)指人ES细胞。ESC的生成公开于美国专利号5843780；62000806，获自源自体细胞核移植的囊胚内细胞团的ESC述于美国专利号5945577；5,994,619；6235970，通过引用其全部纳入本文。胚胎干细胞的显著特征决定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，那么该细胞将具有胚胎干细胞的表型，从而使该细胞可以与其他细胞区别开来。示例性的不同胚胎干细胞特征包括但不限于基因表达概况、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的反应性等。

本文所用术语“多能”是指在不同条件下具有分化为一种以上分化细胞类型能力的细胞，并且优选分化为具有所有三种生殖细胞层特征的细胞类型。多能干细胞的主要特征是其使用例如裸鼠畸胎瘤形成试验分化为多种细胞类型，优选分化为所有三个胚层的能力。这类细胞包括hES细胞、人胚胎源性细胞(hEDC)和成人源性干细胞。多能干细胞可以是经遗传修饰的。在一些实施方式中，所述多能干细胞是未经遗传修饰的。遗传修饰的细胞可以包括标志物，诸如荧光蛋白，以便于其识别。多能性还通过胚胎干细胞(ES)标志物的表达证明，但多能性的优选测试是证明分化为三个胚层中每一层的细胞的能力。应当注意的是，仅仅培养这些细胞并不能使它们自身成为多能的。相对于在培养中通常仅具有有限数量的分裂能力的原代细胞亲本而言，重编程多能干细胞(例如，本文所定义的术语iPS细胞)还具有延长的传代而不损失生长潜能的能力的特征。

如本文所用，术语“iPS细胞”和“诱导型多能干细胞”可互换地使用并且是指例如通过诱导一个或多个基因的强制表达由非多能干细胞(通常是成体体细胞)人工衍生的(例如，诱导的或通过完全逆转的)多能干细胞。

本文所用术语“重编程”是指改变或逆转体细胞分化状态的过程，从而使细胞核的发育时钟被重置；例如，重新设定成体分化细胞核的发育状态，使其可以执行早期胚胎细胞核的遗传程序，使胚胎发育所需的所有蛋白质都能合成。本文所公开的重编程涵盖体细胞向多能或全能细胞分化状态的完全逆转。重编程通常涉及在合子发育成成体的细胞分化过程中发生的至少一些核酸修饰(例如甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等遗传模式的改变，例如逆转。

术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中互换使用，用于指干细胞通过在长时间和/或数月到数年内分裂成相同的非特化细胞类型来自我更新的能力。在一些情况下，增殖是指通过单细胞反复分裂成两个完全相同的子细胞来扩增细胞。

本文所用术语“培养”或“饲养”是指用于维持细胞活力和/或增殖的体外实验室程序。

术语“无运载体三维球体”培养或饲养是指在非贴壁条件下培养细胞以使细胞可以在没有任何运载体的情况下自行形成球体的技术。用于培养具有粘附性的细胞的常规方法的特征在于将细胞在诸如培养皿(二维培养)的容器的平面上培养。相反，在三维培养方法中，未向细胞提供贴附支持，并且培养在很大程度上依赖于细胞间接触。如本文所用，“运载体”或“微载体”是指由塑料、陶瓷或其他材料诸如明胶或水凝胶制成的固体球状珠，设计成为悬浮细胞培养物提供贴壁表面。其它形式或形状的运载体也有报道，如纤维结构。

术语“支架”是指被工程改造以引起理想的细胞间相互作用从而有助于形成用于组织工程改造和再生的新功能组织的固体或半固体材料。在一些实施方式中，细胞通常被接种到这些能够支持三维组织形成的结构中。支架模拟天然组织的细胞外基质，再现了体内环境，并允许细胞影响其自身微环境。它们通常至少达到以下目的之一：允许细胞接触和迁移，递送和保持细胞和生物医学因子，使得活细胞的营养物质和表达产物能够扩散，发挥某些机械性和生物性影响以调整细胞行为。为了达到组织重建的目的，支架必须满足某些特定需求。高孔隙率和足够的孔径对于促进细胞接种和扩散是必需的。支架材料必须是生物相容性的。在一些实施方式中，使用生物可降解材料。在一些实施方式中，支架可通过酶处理或物理条件的改变例如pH和/或温度等的改变溶解，以促进支架内细胞的回收或收获。在一些实施方式中，多孔支架还可以用作最佳细胞分化和生产的运载体。支架的物理表征，例如孔径，刚性，细胞外基质内容物和形状，都可以为组织的最优生长定制，所述组织例如但不限于骨，心脏，肝和皮肤组织。在一些实施方式中，所述支架可选择模拟体内生态龛以促进谱系特化，例如NK细胞，T淋巴细胞等。

术语“球体”或“球状体”是指三维球形或基本球形的细胞团或聚集体。在一些实施方式中，细胞外基质可以用于帮助细胞在其球体内移动，类似于细胞在活组织中移动的方式。最常见的ECM类型是基底膜提取物或胶原蛋白。在一些实施方式中，也可使用无基质或无支架球体培养物，其中细胞悬浮在培养基中生长。这可以通过连续旋转或使用低贴附板来实现。在实施方式中，可通过单次培养或共培养技术诸如悬滴法(hanging drop)、旋转培养法(rotating culture)、强制漂浮法(forced-floating)、搅拌法(agitation)或凹板法(concave plate)来创建球体(参见例如，Breslin等，Drug Discovery Today 2013，18，240-249；Pampaloni等，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2007，8，839-845；Hsiao等，Biotechnol.Bioeng.2012，109，1293-1304；和Castaneda等，J.CancerRes.Clin.Oncol.2000，126，305-310；均通过引用纳入)。在一些实施方式中，球体的大小可在3D培养期间增长。

如本文所用，“无饲养细胞”指的是所述组合物不包含添加的饲养细胞的情况。如本文所用，“饲养细胞”指的是和PS细胞共培养且为所述PS细胞提供支持的非PS细胞。支持可能包括通过产生一种或多种生长因子促进PS细胞培养物的生长和维持。饲养细胞的实例可以包括有结缔组织表型的细胞，例如鼠成纤维细胞、人成纤维细胞。

术语“培养基”可与“培养介质”互换使用，并指任何允许细胞增殖的培养基。合适的培养基不需要促进最大增殖，只需要可测量的细胞增殖。在一些实施方式中，培养基保持细胞处于多能状态。在一些实施方式中，所述培养基鼓励细胞(例如，多能干细胞)分化为例如HEC和HPC。本文使用的一些示例性基础培养基包括：DMEM/F-12(杜贝克氏改良的依格培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)/营养混合物F-12(Nutrient Mixture F-12)；可购自赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher Scientific))，无生长因子的培养基，其不含bFGF或TGFβ(无GF的可购自生物工业公司(Biological Industries))，hPSC XF(生物工业公司)，mTeSR^TM1(STEMCELL技术公司(STEMCELL Technologies Inc.))，mTeSR^TM2(STEMCELL技术公司)，TeSR^TM-E8^TM(STEMCELL技术公司)，StemSpan^TM-ACF(STEMCELL技术公司)，(欧文科技公司(Irving Scientific))，和造血祖细胞扩增培养基DXF(PromoCell GmbH)。各自可以补充下述一种或多种物质：合适的缓冲液(例如，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))，化学限定的补充物，诸如N2(0.1-10％，例如1％)和B27(0.1-10％，例如1％)无血清补充物(可购自赛默飞世尔科技公司)，抗生素，诸如青霉素/链霉素(0.1-10％，例如1％)，MEM非必需氨基酸(伊格尔极限必需培养基(Eagle′s MinimalEssential Medium)(MEM)，其由平衡的盐溶液、氨基酸和维生素组成，他们对培养细胞的生长是必需的，并且当补充非必需氨基酸时，产生MEM非必需氨基酸溶液)，葡萄糖(0.1-10％，例如0.30％)，L-谷氨酰胺(例如，GlutaMAX^TM)，抗坏血酸和/或DAPT(N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯甘氨酸叔丁酯)。如本文所公开的用于诱导分化的因子，例如肝素，骨形态发生蛋白4(BMP4)，制瘤素M(OSM)，血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板生成素(TPO)，干细胞因子(SCF)，可溶性δ样蛋白1(sDLL-1)，促红细胞生成素(EPO)，FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)，白介素(IL)-3，IL-6，IL-9，IL-7，IL-15，Y27632，CHIR99021，SB431542和/或StemRegenin 1(SR1)也可添加到培养基中。

本文所用术语“分化细胞”是指正在分化成体细胞谱系或已终末分化的任何细胞。在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的”或“分化”是相对的术语，意指“分化的细胞”是相比与之进行比较的细胞而言，在发育过程中进一步发展下去的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(诸如中胚层干细胞)，其可以进一步分化为其他类型的前体细胞(如造血祖细胞)，然后分化为终末期分化细胞，其将在某些组织类型中发挥特征作用，并且可能会也可能不会保留进一步扩增的能力。

术语“富集”和“富含”在本文中可交换地使用，并意指一种类型细胞的产率(分数)比该类型细胞在起始培养物或制剂中的分数增加至少10％。

本文所用术语“试剂”或“物质”(agent)指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。试剂可以是任何化学物质、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白性和非蛋白性实体。在一些实施方式中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体，在某些实施方式中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳香族或杂环基部分，包括大环内酯类、轻肌蛋白(leptomycin)和相关天然产物或其类似物。化合物可以已知具有所需活性和/或性质，或者可以选自多种化合物的库。

术语“小分子”指具有多个碳-碳键且分子量小于1500道尔顿的有机化合物。通常这类化合物包含一个或多个官能团，其介导与蛋白质的结构相互作用的结构，例如氢键，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，并且在一些实施方式中，为至少两个化学官能团。小分子试剂可以包含环状碳或杂环结构，和/或用一个或多个化学官能团和/或杂原子取代的芳香族或多环芳烃结构。

本文所用术语“标志物”用于描述细胞的特征和/或表型。标志物可以用于选择包含感兴趣特征的细胞。标志物会因特定细胞而异。标志物是特性，既可以是特定细胞类型的细胞形态、功能或生化(酶促)特性，也可以是由该细胞类型表达的分子。优选地，这类标志物是蛋白质，并且更优选地，具有本领域可及抗体或其他结合分子的表位。然而，标志物可由细胞中任何存在的分子组成，包括但不限于，蛋白质(肽和多肽)，脂质，多糖，核酸和类固醇。形态特征或特性的示例包括但不限于形状、大小和核质比。功能特性或特性的示例包括但不限于粘附特定基材的能力、纳入或排除特定染料的能力、特定条件下迁移的能力和沿着特定谱系分化的能力。可以通过本领域技术人员可及的任何方法来检测标志物。标志物也可以是形态特征的缺乏或蛋白质、脂类等的缺乏。标志物可以是有无多肽以及其他形态特征的一组独特特征的组合。

本文所使用的关于分离的细胞群的术语“分离群”指已经由混合或异质细胞群中移出和分离的细胞群。在一些实施方式中，相较于从中分离或富集细胞的异质群，分离群是基本上纯的细胞群。

就特定细胞群而言，术语“基本纯(的)”指相对于构成总细胞群的细胞而言，至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％且最优选至少约95％纯的细胞群。就确定的内胚层细胞群而言，重述术语“基本纯(的)”或“基本上纯(的)”指这样的细胞群，其含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的不是确定的内胚层细胞或其后代的细胞，如本文术语定义。在一些实施方式中，本公开包括扩增确定的内胚层细胞群的方法，其中扩增的确定的内胚层细胞群是基本上纯的确定的内胚层细胞群。类似地，述及多能干细胞的“基本纯的”或“基本上纯的”群体，指含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％的细胞群。

如本文所用“造血谱系细胞”指的是由PSC和/或其后代体外分化来的细胞，可以包含下述中的一种或几种：成血管细胞，造血内皮细胞(HEC)，造血干细胞，造血祖细胞(HPC)，红系/巨核细胞祖细胞，红细胞，巨核细胞，血小板和淋巴谱系细胞。术语“淋巴谱系细胞”包含以下一种或几种：淋巴样祖细胞，淋巴细胞(例如T淋巴细胞)，自然杀伤(NK)细胞，髓样祖细胞，粒单核细胞祖细胞，单核细胞，巨噬细胞和树突细胞。

“造血内皮细胞”指的是由PSC体外分化获得造血潜能并能产生多谱系造血干、祖细胞的细胞。人HEC标志物包括CD31，CD144，CD34和CD184。

“造血祖细胞”是指保持有丝分裂并能产生更多祖细胞或前体细胞或能分化为终末造血细胞谱系的细胞。人HPC标志物包括：CD31，CD34，CD43，CD133，CD235a，CD41和CD45，其中CD41+表示巨核细胞祖细胞，CD235a+表示红细胞祖细胞，CD34⁺CD45⁺表示早期淋巴样/髓样谱系祖细胞，CD56⁺表示NK谱系祖细胞，以及CD34⁺CD133⁺表示造血干细胞。

术语“治疗”或“处理”意指包括下述的目的施用物质：(i)预防疾病或病症，即，导致疾病或病症的临床症状不发展；(ii)抑制疾病或病症，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)减轻疾病或病症，即导致临床症状消退。

本文所用术语“癌症”是指或描述典型特征为细胞生长失控的哺乳动物生理病症。癌症的例子包括但不限于：黑色素瘤，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。癌症的更具体的例子包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞状癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，包括胃肠道癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。

如本文所用，术语“疾病抗原”是指包括与疾病相关的所有蛋白质或肽的大分子。在一些实施方式中，抗原是可以引起免疫应答的分子，例如涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体产生。T细胞受体还识别抗原(尽管其肽或肽片段与MHC分子复合的抗原)。任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以是抗原。抗原也可以源自基因组重组体或DNA。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都编码“抗原”。在实施方式中，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也不需要完全由基因编码。在实施方式中，抗原可以合成或可以衍生自生物学样品，例如组织样品，肿瘤样品，细胞或具有其他生物学组分的流体。如本文所用，“肿瘤抗原”或可互换使用的“癌症抗原”包括存在于癌症，例如，癌症细胞或肿瘤微环境上或与之相关的可以激发免疫应答的任何分子，其包含肿瘤相关抗原。

“肿瘤相关抗原”(TAA)是肿瘤细胞产生的抗原物质，其引发宿主的免疫应答。肿瘤抗原在肿瘤细胞鉴定中是有用的诊断检测肿瘤标志物，在肿瘤治疗中是潜在使用候选物。在一些实施方式中，所述TAA可来自癌症，其包括但不限于原发或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。TAA可以是患者特异性的。在一些实施方式中，TAA可能是p53、Ras、β-连环蛋白、CDK4、α-辅肌动蛋白-4、酪氨酸酶、TRPl/gp75、TRP2、gplOO、Melan-A/MART 1、神经节苷脂、PSMA、HER2、WT1、EphA3、EGFR、CD20、MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、端粒酶、生存素，或其任意组合。

下面进一步详细描述本公开的各个方面。在整个说明书中提供了其他定义。

多能干细胞

在各种实施方式中，造血细胞可以产生自人多能干细胞(hPSC)，包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人类孤雌生殖干细胞(hPSC)、核移植衍生的干细胞和诱导型多能干细胞(iPSC)。获得这类hPSC的方法在本领域是众所周知的。

多能干细胞在功能上被定义为这样的干细胞：(a)当移植到免疫缺陷型(SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化成所有三个胚层(例如，外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)的细胞类型；和(c)表达一种或多种胚胎干细胞标志物(例如，OCT4，碱性磷酸酶，SSEA-3表面抗原，SSEA-4表面抗原，NANOG，TRA-1-60，TRA-1-81，SOX2，REX1等)。在某些实施方式中，多能干细胞表达选自下组的一个或多个标志物：OCT4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。例如，示例性的多能干细胞可以使用本领域已知的方法生成。示例性多能干细胞包括衍生自囊胚阶段胚胎的ICM的胚胎干细胞，以及衍生自卵裂阶段或桑椹胚阶段胚胎的一个或多个卵裂球的胚胎干细胞(任选地不破坏胚胎的剩余部分)。这类胚胎干细胞可以由通过受精或无性方式产生的胚胎材料生成，包括体细胞核转移(SCNT)、孤雌生殖和雄性生殖。其它示例性多能干细胞包括通过表达因子(本文称为重编程因子)组合对体细胞进行重编程而生成的诱导型多能干细胞(iPSC)。可以使用胎儿、出生后、新生儿、青年或成人体细胞生成iPSC。

在某些实施方式中，可以用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，OCT4(有时称之为OCT3/4)，SOX2，c-Myc，和Klf4的组合。在其他实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，OCT4、SOX2、NANOG和LIN28的组合。在某些实施方式中，至少两个重编程因子在体细胞中表达以成功地重编程体细胞。在其它实施方式中，至少三个重编程因子在体细胞中表达以成功地重编程体细胞。在其它实施方式中，至少四个重编程因子在体细胞中表达以成功地重编程体细胞。在其它实施方式中，鉴定其它重编程因子并单独使用或与一个或多个已知的重编程因子组合使用，以将体细胞重编程为多能干细胞。诱导型多能干细胞在功能上被定义并且包括使用多种方法(整合载体、非整合载体、化学手段等)中的任何一种进行重新编程的细胞。多能干细胞可经基因修饰或以其他方式修饰以增加寿命、效力、归巢，以防止或减少同种异体免疫反应，或向分化自这类多能干细胞的细胞递送所需因子。

诱导型多能干细胞(iPS细胞或iPSC)可以通过体细胞中重编程因子的蛋白质转导产生。在某些实施方式中，至少两个重编程蛋白质被转导到体细胞中以成功地重编程体细胞。在某些实施方式中，至少三个重编程蛋白质被转导到体细胞中以成功地重编程体细胞。在某些实施方式中，至少四个重编程蛋白质被转导到体细胞中以成功地重编程体细胞。

多能干细胞可以来自任何物种。胚胎干细胞已经成功地衍生于例如小鼠，非人灵长类动物的多种物种和人，并且胚胎干样细胞已经由多种其他物种中生成。因此，本领域技术人员可以由任何物种生成胚胎干细胞和胚胎衍生的干细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家养和野生狗)、猫(家养和野生猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、沙鼠、松鼠、豚鼠、山羊、大象、熊猫(含大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸鱼等)等。在某些实施方式中，该物种是濒危物种。在某些实施方式中，该物种是目前已灭绝的物种。

类似地，iPS细胞可以来自任何物种。已经使用小鼠和人细胞生成这些iPS细胞。此外，已经使用胚胎、胎儿、新生儿和成人组织成功地生成了iPS细胞。因此，可以使用来自任何物种的供体细胞容易地生成iPS细胞。因此，可以由任何物种产生iPS细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(老鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家养和野生狗)、猫(家养和野生猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸鱼等)等。在某些实施方式中，该物种是濒危物种。在某些实施方式中，该物种是目前已灭绝的物种。

诱导型多能干细胞可以使用任何发育阶段的几乎任何体细胞作为起点来生成。例如，细胞可以来自胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成人供体。可使用示例性体细胞包括成纤维细胞，如通过皮肤样品或活检组织获得的真皮成纤维细胞，来自滑膜组织的滑膜细胞，包皮细胞，脸颊细胞或肺成纤维细胞。虽然皮肤和脸颊提供了现成的和容易获得的适当细胞来源，几乎任何细胞都可以使用。在某些实施方式中，体细胞不是成纤维细胞。

诱导型多能干细胞可通过在体细胞中表达或诱导一种或多种重编程因子的表达来产生。体细胞可以是成纤维细胞，如真皮成纤维细胞，滑膜成纤维细胞或肺成纤维细胞，或非成纤维体细胞。体细胞可通过导致至少1、2、3、4、5种重编程因子的表达(诸如通过病毒转导、整合或非整合载体等)和/或与之接触(例如，使用蛋白质转导结构域、电穿孔、微注射、阳离子两亲物、与含脂质双层物的融合体、洗涤剂透化等)来重编程。重编程因子可以选自：OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28、C-MYC和KLF4。可以通过使体细胞与诱导重编程因子表达的至少一种试剂(例如有机小分子试剂)接触来诱导重编程因子的表达。

其它示例性多能干细胞包括通过表达或诱导因子(“重编程因子”)的组合表达来对体细胞进行重编程而产生的诱导型多能干细胞。iPS细胞可以获自细胞库。制备iPS可能是产生分化细胞的第一步。iPS细胞可以使用来自特定患者或匹配供体的材料特异性地生成，其目的是生成组织匹配的造血细胞。iPSC可以产生自在预期受体中基本上不具免疫原性的细胞，例如，产生自自体同源细胞或由与预期受体组织相容的细胞。

体细胞也可以使用组合方法进行重编程，其中重编程因子被表达(例如，使用病毒载体、质粒等)并且重编程因子的表达被诱导(例如，使用有机小分子)。例如，可以通过使用病毒载体如逆转录载体或慢病毒载体进行感染来在体细胞中表达重编程因子。同样，可以使用非整合载体(如附加体质粒)在体细胞中表达重编程因子。参见例如，Yu等，Science.2009年5月8日；324(5928)：797-801，通过引用其全部内容纳入。当使用非整合型载体表达重编程因子时，可以使用体细胞的电穿孔、转染或转化(使用载体)在细胞中表达因子。例如，在小鼠细胞中，使用整合型病毒载体表达四种因子(OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4)足以重编程体细胞。在人类细胞中，使用整合型病毒载体表达四种因子(OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28)足以重编程体细胞。

一旦重编程因子在细胞中表达，就可以培养细胞。随着时间的推移，培养皿中出现具有ES特征的细胞。可以基于例如ES形态或基于可选择或可检测标志物的表达来选择细胞并传代培养。可以培养这些细胞以产生类似ES细胞的细胞培养物(它们是假定的iPS细胞)。

为了证实iPS细胞的多能性，可以一个或多个多能性试验中测试细胞。例如，可测试细胞是否表达ES细胞标志物；当将细胞移植到SCID小鼠体内时可以评估其产生畸胎瘤的能力；可以评估细胞分化以产生所有三个胚层的细胞类型的能力。一旦获得多能iPSC，其可用于产生本文公开的细胞类型。

获得hPSC的另一种方法是通过孤雌生殖。“孤雌生殖”(“孤雌生殖激活的”和“通过单性生殖激活的”在本文中可互换使用)指在没有精子穿透的情况下发生卵母细胞激活的过程，并且指早期胚胎的发育，其包括滋养外胚层和通过激活包含所有雌性源DNA的卵母细胞或胚胎细胞(例如卵裂球)获得的内细胞团。在相关方面中，“孤雌生殖体”指通过这类激活获得的细胞。在另一个相关方面，“囊胚”指受精的激活卵母细胞的卵裂阶段，包括由外部滋养层细胞和内部细胞团(ICM)构成的空心细胞球。在另一相关方面中，“囊胚形成”指这样的过程：在卵母细胞受精或激活后，卵母细胞随后在培养基中培养一段时间以使其发育成由外部滋养层细胞和ICM组成的空心细胞球(例如，5-6天)。

获得hPSC的另一种方法是通过核移植。如本文所用，“核移植”指将供体细胞或来自供体细胞的DNA融合或移植到合适的受体细胞，通常是相同或不同物种的卵母细胞，其在移植或融合之前、同时或之后经处理以去除或使内源性核DNA失活。用于核移植的供体细胞包括胚胎细胞和分化细胞，例如体细胞和生殖细胞。供体细胞可以处于增殖细胞周期(G1、G2、S或M)或非增殖细胞周期(GO或静止)。优选地，供体细胞或来自供体细胞的DNA源自增殖哺乳动物细胞培养物，例如成纤维细胞培养物。任选地，供体细胞可以是转基因的，即，其可包含一个或多个基因添加、取代或缺失修饰。

获得hPSC的另一种方法是通过细胞重编程来获得诱导型多能干细胞。Takahashi等(Cell 131861-872(2007))已经公开了这样的方法，所述方法用于在不使用任何胚胎或ES(胚胎干)细胞的情况下对分化细胞进行重编程，并建立具有与ES细胞相似的多能性和生长能力的可诱型多能干细胞。分化成纤维细胞的核重编程因子包括下述四个基因的产物：Oct家族基因；Sox家族基因；Klf家族基因；和Myc家族基因。

优选地，通过在适当条件下培养细胞，例如，通过在成纤维细胞饲养层或另一饲养层或培养物(其包括白血病抑制因子(LIF))上培养来维持细胞的多能性状态。这类培养细胞的多能性状态可以通过多种方法来确认，例如：(i)确认多能细胞的特征性标志物的表达；(ii)产生含有表达多能干细胞基因型的细胞的嵌合动物；(iii)向动物(例如，SCID小鼠)注射细胞，在体内产生不同的分化细胞类型；和(iv)观察细胞体外分化(例如，在没有饲养层或LIF的情况下培养)成为胚状体和其他分化细胞类型。

本公开中使用的细胞的多能性状态可以通过多种方法来确认。例如，可以测试细胞是否存在特征性ES细胞标志物。在人ES细胞的情况中，鉴定上述标志物(作为示例)，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT4，并且为本领域已知。

此外，可以通过将细胞注射到合适的动物(例如SCID小鼠)中并观察分化细胞和组织的产生来确认多能性。确认多能性的另一方法是使用对象多能细胞来生成嵌合动物并观察导入的细胞对不同细胞类型的贡献。

确认多能性的另一种方法是观察在有利于分化的条件下培养(例如，去除成纤维细胞饲养层)，ES细胞分化为胚状体和其他分化的细胞类型。该方法已经被应用，并且已经证实对象多能干细胞在组织培养中产生胚状体和不同的分化细胞类型。

通过常规传代，hPSC可以在培养中保持多能状态，直到需要衍生造血谱系细胞为止。

3D基质和无运载体球体培养以产生造血细胞

造血干细胞(HSC)可形成所有造血谱系的细胞。如何由PSC制备造血细胞已经取得了重大进展。然而，仍然没有适合大规模工业化生产的方法，这是将干细胞转化为临床应用的明显障碍。

在一些实施方式中，本文提供了高度可重复，可缩放的，明确的3D球体分化系统，以将人PSC转化为HEC和HPC，其进而可稳健地分化为几乎所有谱系的造血细胞，包括但不限于MK/血小板，RBC和NK细胞。

与先前报道的方法相比，本文公开的所述3D球体系统在下述技术方面有显著优势(不限于)：

(1)在分化起始时良好控制的PSC球体大小，这对于人PSC向中胚层谱系的高效和小变异性的同类特化是重要的。理想的球体大小均匀性能够允许氧气、营养物质和分化诱导因子/分子穿透到球体中心核心，导致同步分化过程以形成纯谱系特异性群体，这是自发形成的胚状体(EB)和其他所谓的类器官系统所缺乏的。本公开的系统适用于以最小的球体尺寸优化努力从不同的hESC或iPSC系生产HEC，HPC和造血细胞；

(2)在本公开的3D球体平台中不需要饲养细胞，血清，未明确的基质或运载体，因此使其对用于潜在临床应用的cGMP合规的细胞生产友好；

(3)PSC扩增和分化的整个过程是在3D悬浮培养条件下进行的，其可以容易地放大成任何的理想工作体积的市售的一次性生物反应器；

(4)HPC能够天然地自动地以单细胞释放到悬浮液中，无需任何处理(例如酶促解离)。释放出来的HPC保持高活性，这使得它们对于下游工艺有高耐受性，例如体积减小，过滤，低温保存以及富集/耗尽，如果需要；

(5)本公开的3D球体平台中可以获得其他中胚层谱系副产物例如间充质干细胞(MSC)，内皮细胞和平滑肌细胞。

可以使用多种3D球体培养操作，例如包括强制漂浮方法，其修饰细胞培养表面并因此通过防止细胞附着于其表面来促进3D培养形成；悬滴法，其支持细胞悬浮生长；搅拌/旋转系统，其鼓励细胞相互贴附形成3D球体。

用于生成3D球体的一种方法是通过修饰器皿表面来防止3D球体附着于该表面，从而导致细胞被迫漂浮。这促进了细胞间接触，进而促进了多细胞球体形成。示例性表面修饰包括聚-2-甲基丙烯酸羟乙酯(聚HEMA)和琼脂糖。

3D球体产生的悬滴法使用小等分试样(通常为20ml)的单细胞悬浮液，将其滴入托盘的孔中。类似于强制漂浮，接种悬浮液的细胞密度(例如，50、100、500个细胞/孔等)可根据所需球体大小进行相应的改变。在细胞接种后，随后将托盘倒置，并使细胞悬浮液的等分试样由于表面张力而变成保持在原位的悬滴。细胞在液滴尖端、液气界面积聚，并允许增殖。

用于产生3D球体的基于搅拌的方法可以大致分为两类：(i)旋转瓶生物反应器和(ii)旋转培养系统。这些方法背后的通用原理是将细胞悬浮液置于容器中，并使悬浮液保持运动，即轻轻搅拌或旋转容器。悬浮细胞的连续运动意味着细胞不会贴附于容器壁，而是形成细胞间相互作用。旋转瓶生物反应器(通常称为“旋转器”)包括用来容纳细胞悬浮液的容器和用来确保细胞悬浮液连续混合的搅拌元件。旋转细胞培养生物反应器以与旋转瓶生物反应器相似的方式工作，但是其并不使用搅拌棒/杆来保持细胞悬浮液移动，而是旋转培养容器本身。

在一些实施方式中，本文提供了基于旋转瓶的3D球体培养方案。在没有饲养细胞和基质的情况下，可以在具有限定培养基的旋转瓶中连续培养多个hPSC为基本一致的球体。培养基可以是任何限定的、无异源物质的、无血清的细胞培养基，旨在支持hPSC(如hiPSC和hES)的生长和扩增。在一个示例中，培养基是培养基(生物工业公司)。在一些实施方式中，培养基可以是mTeSR^TM1，mTeSR^TM2，TeSR^TM-E8^TM培养基(干细胞技术公司)或其他干细胞培养基。培养基可以补充有小分子抑制剂，所述小分子是Rho相关的，含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)诸如Y27632或其他ROCK抑制剂如噻唑维文(Thiazovivin)、ROCKII抑制剂(如SR3677)和GSK429286A。利用该悬浮培养体系，hPSC培养物可以连续传代，并持续扩增至少10代。3D-hiPSC球体的典型传代间隔可以为约3-6天，此时球体可以生长至尺寸约为230-260μm直径。球体的大小可以通过取等分试样培养物并用显微镜观察来监控。然后可以使用例如用于分离原代和干细胞系以及组织的具有蛋白水解酶和胶原水解酶活性的酶将球体解离成单个(或基本上单个)细胞。在一个示例中，酶是(创新细胞技术有限公司(Innovative Cell Technologies，Inc)，或TrypLE(赛默飞世尔科技公司)，或胰蛋白酶/EDTA。此后，在例如60-70RPM的连续搅拌下，解离的细胞可以重新聚集以在旋转瓶中重组球体。在至少3-5次重复传代后，球体逐渐增大，同时保持了一致的结构和高多能性标志物表达(OCT4)和正常的核型。如本文所用，“传代”应当理解为意指由单细胞生长成理想大小的球体的细胞球体培养物，此时球体被解离成单细胞并再次进行接种用于另一传代。对于3D-hiPSC球体，传代可能需要3-6天，或更长或更短，这取决于hPSC的类型和培养条件。一旦获得足够量的3D-hPSC球体，它们就可以进行3D球体分化，如下更详细地描述。

在一些实施方式中，hiPSC细胞可被培养在基质上，例如Laminin 521或Laminin511在hPSC XF培养基中(美国生物工业公司(Biological IndustriesUSA))。融合且未分化的hiPSC可以用或TripLE传代，并以在补充有1μM Y27632的中6-8x10⁴个细胞/cm²的密度接种到涂覆有减小(1/2)浓度的基质的表面，培养3-7天。hiPSC可在此条件下扩增3-5代，或根据需要扩增多代。流式细胞术分析检测Oct-4的表达水平来定量hiPSC的未分化状态(Oct-4阳性率超过95％)。

为了起始3D悬浮培养，用Accutase或TripLE解离融合未分化的hiPSC，并以例如在补充了Y27632(约1μM)的中1x10⁶个细胞/mL的密度接种到旋转瓶中。所述细胞可在30-mL旋转瓶(Abel Biott)中以50-80RPM的搅拌速率不间断地培养48小时。接种后48小时，可取出小样品，在显微镜下检查形态和球体大小。周期性地更换培养基，直到球体尺寸达到直径250-300微米。为了传代，用PBS(Mg^-，Ca^-)洗涤hiPSC球体，然后用例如Accutase或TripLE的酶解离。然后，解离的hiPSC单细胞以所需的密度接种，以扩增或起始造血分化。

为了由hPSC生成HEC和造血谱系，可以采用明确的生长因子和小分子(图2)以逐步方式直接诱导悬浮液中的3D-hPSC球体。在一些实施方式中，这可在3D旋转瓶或其它3D球体培养方法中完成。在各种实施方式中，连续3D球体培养可与多个解离/重新聚集步骤整合，同时可以在不同的阶段添加生长因子和小分子以诱导分化。

如图2所示，hPSC(如hiPSC)可以所需的密度(例如0.5-1.5x10⁶个细胞/ml，取决于细胞大小)以单细胞接种在补充了Y27632(约1μM)的HEC诱导培养基M1(例如mTeSR^TM1，mTeSR^TM2，TeSR^TM-E8^TM或其他适合3D悬浮培养的培养基)，培养约6-24或约12小时直到所需的球体尺寸。典型的球体尺寸直径为60-150微米，约70-120微米或约80-100微米之间，取决于接种密度。不希望囿于理论，据信球体的大小会影响HEC分化，这是因为几何学，细胞与细胞间接触，以及可在球体外形成梯度的营养和生长因子的可及性。在一些实施方式中，在起始HEC分化之前监测球体尺寸(例如使用显微镜)直径在约60-110微米，约70-100微米或约80-90微米范围内。

为了起始HEC分化，去除M1并替换为补充了浓度为约10-100ng/mL，约25-50ng/mL，或约30-40ng/mL的BMP4，VEGF和bFGF的HEC诱导培养基M2(例如无生长因子hPSC XF培养基，mTeSR^TM1，mTeSR^TM2，TeSR^TM-E8^TM或适合在3D悬浮培养中促进中胚层分化的其他培养基)。M2中的hiPSC球体可在缺氧条件(约5％氧气)下培养约1-10天或3-8天或4天，随后在约20％的正常氧气浓度下再培养约1-5天或约2天。不希望囿于理论，据信缺氧条件能模拟早期胚胎发育条件，从而诱导分化。

所述细胞处于缺氧条件下一段时间(例如1-5天)后添加浓度为约1-10μM，约2-5μM，或约3μM的小分子CHIR99021。与CHIR99021同时或随后(例如CHIR99021添加后0-3天)以约1-10μM，约2-5μM或约3μM添加小分子SB431542。在图2的示例中，在第3天和第4天添加CHIR99021，在第4天和第5天添加SB431542。随后，从培养基中除去CHIR99021和SB431542。

在HEC分化的后期阶段(例如在第6天或之后)，细胞球可以通过酶处理(例如TrypLE或胰蛋白酶/EDTA在37℃处理15-30分钟)解离成基本上单细胞的悬浮液。使用流式细胞术分析HEC特异性表面抗原CD31，CD144(VE-钙粘蛋白)，CD34和CD43的表达。将所述HEC的基本单细胞悬浮液接种到模拟体内造血生态龛的支架中。可以通过在生物材料的存在下培养所述细胞模拟生态龛，所述生物材料例如基质，支架和代表控制细胞命运的关键调控信号的培养基材。所述生物材料可以是天然的，半合成的和合成的生物材料和/或它们的混合物。适用于所述支架的合成材料包括选自多孔固体，纳米纤维和水凝胶的聚合物，例如壳聚糖，聚乳酸，聚苯乙烯，包括自组装肽的肽，由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇富马酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚醋酸纤维素和/或它们的共聚合物构成的水凝胶(参见，例如，Saha等，2007，Curr.Opin.Chem.Biol.11(4)：381-387；Saha等，2008，Biophysical Journal 95：4426-4438；Little等，2008，Chem.Rev.108，1787-1796；Carletti等，Methods Mol Biol.2011；695：17-39；Geckil等，Nanomedicine(Lond).2010年4月；5(3)：469-484；全部通过引用其全部内容纳入本文)。一旦接种，所述细胞可在支架内并在合适的培养基及合适的生长因子存在下培养，以分化为所需的淋巴谱系细胞，例如淋巴细胞(例如T淋巴细胞)，自然杀伤(NK)细胞，髓样共同祖细胞，粒单核细胞共同祖细胞，单核细胞，巨噬细胞，和/或树突细胞。本领域普通技术人员将理解，合适的培养基和合适的生长因子是根据所需要的淋巴谱系细胞选择的。

或者，所述包含HEC的球体(未酶解)可转到造血定向和扩增培养基M3(基础培养基，例如StemSpan^TM-ACF(STEMCELL技术公司)，(欧文科技公司)，造血祖细胞扩增培养基DXF(PromoCell GmbH)和其他适于造血干细胞在3D悬浮培养中扩增的培养系统)以诱导向造血祖细胞(HPC)的分化和扩增。在1期扩增的约3-10天，约4-8天或约5天，M3可补充有下述物质的一种或多种：TPO(10-25ng/ml)，SCF(10-25ng/ml)，Flt3L(10-25ng/ml)，IL-3(2-10ng/ml)，IL-6(2-10ng/ml)，SR1(0.75μM)，OSM(2-10ng/ml)和EPO(2U/ml)。HPC可以从所述球体中自动释放(无需酶解球体)。

进一步分化和扩增可在造血分化/增殖培养基M4(基础培养基例如StemSpan^TM-ACF(STEMCELL技术公司)，(欧文科技公司)，造血祖细胞扩增培养基DXF(PromoCell GmbH)和其他适合在3D悬浮培养中对巨核细胞、红系、髓系和淋巴系的各种造血细胞进行谱系特异性扩增和成熟的培养系统)中实现。在这种2期扩增(达到40天或更长)，M4可补充有下述物质的一种或多种：TPO(10-25ng/ml)，SCF(10-25ng/ml)，Flt3L(10-25ng/ml)，IL-3(2-10ng/ml)，IL-6(2-10ng/ml)，SR1(0.75μM)，OSM(2-10ng/ml)和EPO(3U/ml)。本领域普通技术人员将理解，不同的培养基和生长因子可用于促进分化为不同的细胞类型，例如红系/巨核细胞共同祖细胞，红细胞，巨核细胞，血小板，淋巴样共同祖细胞，淋巴谱系细胞，淋巴细胞(例如T淋巴细胞)，自然杀伤(NK)细胞，髓样共同祖细胞，粒单核细胞共同祖细胞，单核细胞，巨噬细胞和/或树突细胞，或任意两个或更多上述细胞的混合物。

在分化过程中可每天更换培养基。当从第一种培养基换成第二种培养基时，可以通过第一种培养基和第二种培养基的连续稀释实现对第二种培养基的逐渐适应。例如，由100％所述第一种培养基向100％所述第二种培养基的逐渐适应可以包括依次以75％∶25％、50％∶50％和25％∶75％，用第一种培养基和第二种培养基进行中间培养，其中细胞在各种培养基组合物中培养2-6天。也可使用其它连续稀释。

在各种实施方式中，本文提供了一种新型、高效的和明确的3D球体平台，以由hPSC产生所需的细胞，具体地说，可用于各种目的的细胞治疗的HEC和造血细胞。

造血细胞的使用

重要的是，如本文所证明，用本公开的3D PSC分化系统产生的HPC具有形成所有血液谱系尤其是CD34⁺群体的多种细胞类型的能力，该细胞可以稳健地形成多种类型的CFU，类似于多潜能HSC的特征。此外，在特定条件下培养后，CD235a⁺CD41⁺双阳性HPC(可能代表MK和红系细胞的共同祖先)分别优先产生MK/血小板和红细胞。人PSC源MK/血小板和RBC不仅可用于输血治疗，还可作为治疗性蛋白的运载体。为了实现这一目的，主PSC库可被工程改造为表达治疗性蛋白，用于生产可在伤口或肿瘤位点活化时释放治疗性蛋白的MK/血小板。由于血小板α-颗粒信号序列已经被表征，编码治疗性重组融合蛋白的基因可被导入PSC。在分化为MK细胞后，这些蛋白将被包装在α-颗粒内，并在需要的位点释放以实现治疗的目的。这些蛋白包括但不限于：在通过在损伤部位局部递送治疗血友病的因子VIII；用于加速纤维蛋白诱导的伤口愈合响应的(促)红细胞生成素，例如用于糖尿病溃疡和烧伤的治疗；以及胰岛素样生长因子1，碱性成纤维细胞生长因子，抗血管生成/抗肿瘤蛋白等。类似地，用于生产通用RhD阴性O型RBC的工程改造的主PSC库可以用于产生表达治疗性蛋白，例如参与抗原特异性免疫耐受诱导的蛋白质的通用RBC。在其表面或内部表达特异性抗原的通用RBC可以移植到超敏感对象体内。当RBC循环、老化并被清除时，所述特异性抗原将会被免疫系统的自然机制处理以防止自身免疫。

淋巴谱系潜能的获得长期以来被视作主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros)(AGM)区域内永久造血(definitive hematopoiesis)的重要指标，这与胚胎内卵黄囊内的原始造血(primitive hematopoiesis)形成对比(Park等.2018)。如本文实施例所示，从本公开的3D分化PSC球体获得的HPC产生CD56^+高NK细胞，这表明本公开定义的系统支持永久造血的发育。先前的一些报道已经表明了淋巴样细胞的生产，但其中的大多数研究使用了饲养细胞和/或血清(de Pooter和Zuniga-Pflucker 2007；D′Souza等2016；Zeng等2017；Ditadi等2015)，这限制了其潜在的临床应用。

因此，本公开的另一个重大技术进步是在无血清无饲养细胞的3D条件下产生纯的真正的NK细胞。这使得从PSC(例如hESC和iPSC)生产临床相关剂量的NK细胞成为可行，该细胞可携带用于癌症免疫治疗的靶向肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体(CAR)。利用工程改造的CAR-T细胞的过继细胞治疗在治疗B细胞恶性肿瘤患者中显示出临床的成功(Grupp等.2013；Kochenderfer等.2010)。然而，由于自体T细胞生产过程和输注，CAR-T细胞有严重的局限性，因为同种异体T细胞输注导致严重移植物抗宿主病(GVHD)的风险(Mehta和Rezvani2018)。不同于T细胞和B细胞，NK细胞不表达重排的抗原特异性受体。NK细胞受体是种系编码的，在与靶细胞上的特异性配体结合时有激活或抑制的功能。KIR是最常研究的NK细胞受体，其识别HLA I类分子。其他受体例如NKG2A，-B，-C，-D，-E和-F识别非经典的HLA I类分子(HLA-E)。健康细胞通过抑制性NK受体识别其表面的“自身”HLA分子免于NK细胞的侵袭(Lanier 2001；Yokoyama1998)。肿瘤或病毒感染的细胞通常下调或丢失其HLA分子，作为逃避T细胞攻击的伪装(Costello，Gastaut和Olive 1999；Algarra等.2004)。自体NK细胞过继疗法的早期临床研究证明在癌症治疗中无效(Burns等.2003；deMagalhaes-Silverman等.2000)。然而，同种异体反应性的NK细胞在HSC移植(Ruggeri等.2002)和癌症疗法(Bachanova等.2014)中的临床益处证明了有希望的结果。因此CAR-NK细胞用于同种异体细胞疗法据信是比CAR-T更优异的选择。

然而，有限的NK细胞资源已经阻碍了CAR-NK的发展。NK细胞可以从外周血(PB)、骨髓(BM)和脐带血(CB)中收集。所述过程实施繁琐，可能给供体造成不必要的健康风险(Winters 2006；Yuan等.2010)。收获的NK细胞扩增能力有限，且被少量T细胞或B细胞污染可能导致GVHD。从CB中收获的NK细胞已经用于进行中的临床试验，但必须通过与GMP级别的人工抗原呈递细胞共培养以显著扩增(Shah等.2013)。NK-92细胞系用于几个CAR-NK临床试验(在中国)。NK-92细胞系源自NK细胞淋巴瘤患者。这些细胞可以是EBV阳性，并且携带在淋巴瘤中发现的多种细胞遗传异常(MacLeod等.2002)。因此，NK-92衍生的CAR-NK细胞在输注给患者之前必须经过辐照，这对其在体内的持久性和功能有不良影响(Schonfeld等.2015)。人PSC(hESC和iPSC)已被证明能够产生NK细胞(Knorr等.2013；Li等.2018二Zeng等.2017)。早先报道的研究依赖于旋涂EB产生(Knorr等.2013；Li等.2018)，这不适合放大工艺。异源饲养细胞被用于PSC培养(Knorr等.2013)和NK分化(Zeng等.2017)。我们新开发的3D NK生产工艺，结合了3D球体分化和模拟器官结构微环境的3D支架，与以往报道的工艺相比具有显著的优势：(1)可扩展性无限制；(2)我们的NK特异性培养基是明确的，无血清的和无饲养细胞的；(3)NK细胞群体纯净，无T细胞和B细胞污染。我们也已经建立了不表达HLAI类分子(A，B，C)但表达非经典I类分子HLA-E的hiPSC系。通过将NK-定制的CAR工程改造到这类hiPSC系中，建立主PSC库，我们能够生产通用型CAR-NK细胞作为真正的现成的治疗性产品。

因此，除了从可再生hPSC生产HEC和HPC的稳健且明确的3D球体平台外，本文还提供了从其衍生的谱系特异性造血细胞。该系统不仅适合于大规模生产工作，而且消除了对饲养层细胞、动物血清和基质的依赖，从而使其对cGMP合规的细胞生产方案友好并使该过程更适合于临床转化。使用单独或集成的多阶段生物反应器，任何造血细胞都可以按需生产。正如本领域技术人员所理解的，这种技术进步的应用将是无限的。

在一些实施方式中，本文提供的细胞组合物可用于细胞疗法。细胞疗法可选自，例如过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法。

在一些实施方式中，所述细胞组合物可以以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物配制。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分(例如，纳米颗粒的生物活性蛋白)的生物活性的有效性的无毒材料。在一些实施方式中，此类组合物可包含盐，缓冲剂，防腐剂和任选地其他治疗剂。在一些实施方式中，药物组合物还可包含合适的防腐剂。在一些实施方式中，药物组合物可以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。在一些实施方式中，适合于肠胃外给药的药物组合物包含纳米颗粒的无菌水性或非水性制剂，在一些实施方式中，其与受体对象的血液等渗。该制剂可以根据已知方法配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。

本文公开的组合物具有多种治疗用途，包括例如癌症、自身免疫疾病和传染病的治疗。本文所述的方法包括通过使用本文所述的细胞治疗对象的癌症。还提供了用于减少或改善对象的癌症症状的方法，以及用于抑制癌症的生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在实施方式中，本文描述的方法在给予了本文描述的或本文描述的药物组合物的对象中减小了肿瘤的大小和/或减少了癌细胞的数量。

在实施方式中，癌症是血液癌症。在实施方式中，血液癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“血液癌症”是指造血或淋巴组织的肿瘤，例如，影响血液，骨髓或淋巴结的肿瘤。示例性的血液癌症包括，但不限于：白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，毛细胞白血病，急性单核细胞白血病(AMoL)，慢性髓单核细胞白血病(CMML)，青少年髓单核细胞白血病(JMML)或大颗粒性淋巴细胞性白血病)，淋巴瘤(例如与AIDS相关的淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主导的霍奇金淋巴瘤)，真菌病(mycosis fungoides)，非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(真菌病，间变性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞淋巴瘤))，原发性中枢神经系统淋巴瘤，Sézary综合征，巨球蛋白血症)，慢性骨髓增殖性疾病，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，或骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤。

在实施方式中，癌症是实体癌。示例性的实体瘤癌包括，但不限于：卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域癌，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，卡波济肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，子宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊髓轴肿瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，所述癌症的转移性病变或其组合。

在实施方式中，以适合于待治疗或预防的疾病的方式给予细胞。通过诸如患者状态这样的因素以及患者疾病的类型和严重程度确定给药的数量和频率。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医师可以考虑对象的肿瘤大小，感染或转移程度，年龄，体重和状况的个体差异来确定要给予的药物组合物的精确量。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，例如10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量给予，包括那些范围内的所有整数值。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以这些剂量多次给予。在实施方式中，本文描述的药物组合物可以使用免疫疗法中描述的输注技术给予(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.Med.319：1676，1988)。

在实施方式中，所述细胞肠胃外给予对象。在实施方式中，将细胞静脉内，皮下，肿瘤内，结节内，肌内，皮内或腹膜内给予给对象。在实施方式中，将细胞直接给予(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在实施方式中，以输注(例如，如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988中所述)或静脉内推注方式给予细胞。在实施方式中，细胞以可注射的储库制剂形式给予。

在实施方式中，对象是哺乳动物。在实施方式中，对象是人，猴，猪，狗，猫，牛，绵羊，山羊，兔，大鼠或小鼠。在实施方式中，对象是人。在实施方式中，所述对象是儿科对象，例如小于18岁，例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或以下。在实施方式中，对象是成年人，例如，至少18岁，例如，至少19、20、21、22、23、24、25、25-30、30-35、35-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90岁。

实施例

实施例1：3D球体分化适合所有造血谱系

hiPSC从2D过渡到3D悬浮培养

图1A说明了在本公开中使用的典型小生物反应器。在更大规模实验中也可以使用工作体积在250m1至3L之间的旋转瓶。从2D hiPSC培养物至3D悬浮培养物成功过渡的表征为hiPSC以圆形球体形式形成和随后生长，如图1B和1C所示。为了监测3D转变的hiPSC的多能性，通过流式细胞术检测多能性标志物Oct-4的表达。高质量的未分化多能干细胞是Oct-4阳性的(≥95％，图1D)。在3D球体条件下培养的hiPSC也有正常的核型(图1E)。

逐步诱导hiPSC为造血内皮和造血谱系

诱导hiPSC成为HEC和HPC的策略示于图2。为了获得高产率且纯的HEC群体，仅使用Oct-4表达阳性率＞95％的3D转化hiPSC是非常重要的(如图1D和3B所示)。对于每个细胞系，重要的是在HEC诱导开始时确定最佳球体大小。正如在图3A中所示，一个hiPSC系的代表性结果证明，从球体尺寸为直径80-85微米起始比尺寸大于100微米起始获得更高的HEC产生效率。因此，在本研究中指出的大多数分化是从尺寸为80-85微米之间的球体开始的。

HEC的产生效率主要通过典型HEC标志物CD31，CD144，CD34和CD184以及造血标志物CD43的表达来监测，以确保HEC群体将向造血谱系分化。如图3B所示，在分化诱导之前(第0天)球体细胞没有表达CD31和CD34，而95％的球状细胞是Oct-4阳性。早在第3天，一个小但独特的CD31⁺群体(31.2％)出现了，随后是CD34表达(15.7％)。此时CD43的表达(2％)非常低。在这个阶段Oct-4的表达已经显著降低到2.9％，证实了多能性的丧失。HEC的数量通常在分化球体的第6天达到峰值。如图3B所示，66％的悬浮球体中整个群体CD31和CD144(VE-钙粘蛋白)均为阳性，两者都是HEC的标志物。另外，如图3B和3C所示，15.2％的CD31⁺群体为CD43⁺，表明HEC群体强早期定向为造血谱系。CD31⁺群体中也出现了显著的CD34⁺群体(21.4％)。部分HEC也表达CD235a(23.5％)，但几乎没有检测到CD45表达，这表明造血祖细胞早期定向为红系谱系(Palis 2016)。大部分的CD31⁺HEC也是CD184⁺；但也有一些CD31-细胞是CD184⁺。有趣的是，在CD43⁺群体中，造血谱系定向似乎伴随着CD34表达的降低。这些结果清楚地证实了我们的分化过程在产生高质量的HEC方面是高效的，这些HEC对于后续的造血分化是理想的。

3D谱系特异性造血分化的形态变化

3D悬浮培养工艺的主要技术优势之一是对长过程不同阶段形态变化取样和监测的能力。在3D悬浮条件下，在整个分化过程中观察到显著的形态学变化。未分化的hiPSC球体呈均匀的圆形，具有微小的尺寸变化范围(图4A)。早在分化的第3天，随着大多数球体内部形成空腔，尺寸变化显著增加(图4B)。在第6天(图4C)球体长到更大(尺寸和内腔)。从第6天到第9天，在培养基内存在大量悬浮细胞，表示HPC开始从球体释放(图4D)。如图4E和4F所示，从第9天到第15天及以后，更多的HPC被释放。较大放大倍数的图像(图4G)显示了典型的未附着圆形HPC形态。

需要强调的是，在悬浮液中大量HPC的天然自释放对于在大规模生产中的收获过程的发展极为有利，这可以通过定期的介质补充来实现。悬浮液中的HPC能够通过减少体积的方法容易地收获，例如为工业规模生产设计的离心或切向流过滤(TFF)(Cunha等.2015)。

不同分化阶段3D培养球中HEC标志物的组织学和免疫荧光分析

为了观察在造血分化的不同阶段细胞球内部进行性的形态变化，用苏木精(图5顶行)或CD31、CD34和CD43的抗体(图5下3行)对球体切片染色。在未分化的hiPSC的第0天，细胞球更致密，核染色模式最显著，反映了典型多能干细胞的大核质比。在第0天没有发现CD31，CD34和CD43表达。在第6天的HEC群体峰值时，在所有球体中观察到从上皮(第0天)到间充质形态的清晰过渡。在所有球体内有强烈的CD31⁺群体，表示从hiPSC到HEC的高效过渡。CD34⁺细胞的存在以及少量但独特的CD43⁺细胞进一步证明了这一点。在第9天球体变大，内部有空腔形成。CD31和CD34在整个群体中仍然高表达。球体内CD43⁺细胞相对较低的百分比表明大部分CD43⁺细胞被释放到培养基中(图5)。在第14天，大多数球体内出现更大空腔，以及CD31⁺和CD34⁺的更致密的细胞核心。CD43⁺HPC也出现在球体内。在分化的第23天平均球体变得更大，有一个大空腔。在这一时期，这种球体的细胞核心内CD34表达仍强，指示稳健的长期造血分化。

在分化的不同时期谱系特异性标志物的动态变化

为了定义获得最佳长期造血分化效率的最佳条件，在许多不同培养基条件下测试了3D球体造血分化(数据未示出)。在所有测试的条件中，我们鉴定了适合本研究的两个最佳条件(标示为条件A和条件B)。

条件A和B实验的起始hiPSCS数相同，都为20x10⁶个细胞。从分化的第0天到第19天，通过流式细胞术分析细胞球中谱系特异性标志物CD31，CD34，CD43，CD235a和CD45的表达。如图6A-6E所示，在实验条件A和B之间观察到全部五个标志物表达概况的显著变化。在条件A中，球体内CD31⁺，CD34⁺和CD43⁺细胞的百分比显著高于条件B，确认在HEC产生中条件A是效率更高的最佳条件(图6A-6C)。在第19天的后续分化阶段，条件B的球体细胞内CD34⁺和CD31⁺的百分比与条件A相当(图6B)。CD235a在祖细胞上的表达确定了红系谱系潜能。条件A中CD235a⁺球体细胞的百分比显著较高，并且在第8天达到峰值。相较之下，条件B中在分化的第5天球体细胞内CD235a的表达被完全抑制。在早期造血中，先前的报道表明HEC中CD235a表达抑制通过操控Wnt信号传导通路促进永久造血但抑制原始造血(Sturgeon等.2014)。球内CD45⁺细胞百分比在第12天之前较低，在条件A和条件B下，从第12天到第19天显著增加(图6E)。总之，我们得出结论，条件A是球体中产生高百分比HEC的最佳条件。如图6A-6E所示，从条件A的球体中早期收集的HPC适合产生红细胞和巨核细胞。或者，在条件B中抑制原始造血可能促使球内早期造血转为永久表型。联同表1A和1B中所示数据，条件B中的球体表现出更高的总细胞数和更高的CD34⁺细胞百分比并释放更多的HPC，尤其是在随后的分化阶段。这些观察结果有力地表明条件B是生产永久造血细胞例如CD34⁺CD133⁺造血干细胞(HSC)的更优选择。总之，我们已经鉴定了3D球体造血分化的两个条件，您可以根据不同的生产目的从中选择。

大量HPC的释放和收获

如图4A-4I所示，从3D球体造血分化培养的第8天到第9天开始大量的HPC被释放出来。从第9天开始，释放的HPC数量逐渐增加。每天或每隔天从实验条件A和B中收集HPC，每次收集的总细胞数目示于图7A和7B中。在条件A中，HPC的合并总收获为285.6x10⁶个；而条件B的HPC合并总收获达到了624.14x10⁶个。在第9天和第10天，条件A的球体比条件B的球体释放更多HPC。然而，从第14天到第23天，条件B的球体释放的HPC明显多于条件A。从球体释放HPC的这种反向趋势与图5和6A-6E所示的球体细胞的造血谱系标志物表达谱(CD31、CD34、CD43、CD235a、CD41和CD45)一致，表明在这两种条件下(相对于原始造血)明显偏好永久造血。我们在球状细胞和释放的HPC上的结果清楚地证明我们已经成功地开发了一个高效的3D造血分化工艺。在优化的条件下，每个输入hiPSC在我们当前的方案中最多可以产生31个HPC。一个1000ml的生物反应器将能够容纳600-1000x10⁶个未分化的hiPSCs，预测25天生产过程的最终HPC产量可达3.1x10¹⁰个细胞。

收获的HPC的表征

流式细胞术分析收获的HPC造血谱系特异性标志物的表达。如图8A所示，在第9天的代表性实验中收获的HPC为97.6％CD31⁺CD43⁺，这表明它们的HEC来源以及造血谱系完全定向。也有CD34⁺CD45⁺HPC的强烈存在，但这一时期不存在CD133⁺HPC。高百分比(68％)的HPC为CD41⁺，表明如先前所报道的，主要是巨核细胞谱系潜能(Feng等.2014)。大部分的HPC是巨核细胞/红系谱系共同祖细胞(CD41⁺CD235a⁺)或红系/髓系谱系共同祖细胞(CD45⁺CD235a⁺)，只有很少数细胞是巨核细胞/髓系共同祖细胞(CD41⁺CD45⁺)。

如图8B所示，在各分化阶段收集的HPC均为CD31⁺CD43⁺，证实其高纯度。CD34⁺CD45⁺HPC被认为具有多谱系潜能，不仅能够产生髓系细胞，也能产生淋巴谱系细胞例如NK细胞(Knorr等.2013)。在图8C所示的一个代表性实验中，从第8天到第17天每天跟踪HPC上CD34和CD45的表达，并且从第8天到第13天释放的HPC群体中有显著百分比(＞60％)是CD34⁺CD45⁺，然后这些细胞从第14天(34％)到第17天(2％)逐渐减少。

如图8D所示，早期(第8天和第9天)HPC主要是CD41⁺和CD235a⁺，然而，该HPC群体逐渐被CD45⁺HPC所取代。相似地，CD41⁺CD235⁺MK/红系共同祖细胞的百分比在第8天最高，从第9天至第14天逐渐减少。有趣的是，从第10天到第14天也观察到了其他共同祖细胞例如CD45⁺CD235a⁺和CD41⁺CD45⁺HPC。

我们的结果证明，我们的新方法可以产生大量可变的造血祖细胞，这些造血祖细胞适用于将来生产淋巴细胞(NK或T细胞)或髓细胞(巨噬细胞，中性粒细胞等)。这些细胞是新一代免疫疗法例如CAR-NK和CAR-巨噬细胞的关键组成部分。

CD34⁺造血干细胞在3D球体中的分离和表征

在我们的系统中，大量的HPC从球体释放到培养基内，清楚地表明了在3D球体结构内部有强大的活跃且动态的造血作用。因此我们推测多能造血干细胞(HSC)可能是在这些球体内部产生。在分化的不同时间，细胞球被解离成单细胞，并分析CD34⁺和其他细胞。如表1A所示，在条件A和条件B中都观察到显著的细胞扩增。在第0天起始为20x10⁶个hiPSC，在第8天和第23天分别获得173x10⁶个(条件A)和288x10⁶个(条件B)球体细胞，以及获得50x10⁶个(条件A)和183x10⁶个(条件B)细胞。在这些细胞中，约10％来自条件A和22％来自条件B的细胞是CD34+造血干细胞。由于在各种分析的整个过程中，有大量的球体被去除，从游离的球中收获的实际细胞数应该明显更高。这些结果表明，这种新的3D球体环境足以支持造血细胞健康的长期生长和分化。

为定量地评估CD34⁺细胞的造血谱系潜能，在第22天从条件A和条件B解离的单个细胞分成CD34⁺和CD34^-群体。CD34^-部分进一步分离为CD34^-CD45⁺和CD34^-CD45^-群体。如表1B所示，在延长解离过程后，解离的球体细胞保持活力。从条件B中获得了较高产量的CD34⁺群体，这也是产生释放HPC数量最高的(参见图7A-7B)。

与CD34^-组分相比，CD34⁺组分的细胞显示出克隆形成能力增加(图9A和9B)。CD34⁺组分的流式细胞术分析证明了该群体的14％也是CD133⁺(图9C)，证实CD34⁺CD133⁺可移植HSC亚群的存在(Drake等.2011)。如图9D-9I所示，从CD34⁺细胞中产生BFU-E(图9D)和CFU-E(图9E，9F和9H)的大量的红色或混合红色(图9G和9I)集落。还观察到髓系谱系的集落，如CFU-G(图9J)，CFU-M(图9K和9L)。在CFU培养物中出现大量的大混合红色集落，强烈地表明在分化后期的分化球内存在HSC。还可以使用本文公开的方法产生能够在人源化小鼠中长期植入的长期CD34⁺细胞。

实施例2：特定造血谱系的产生和表征

如先前报道的那样，NK和淋巴谱系的其他细胞的体外分化显示需要与过度表达Notch信号传导配体DLL-1/4的饲养细胞共培养(Watarai等.2010；Zeng等.2017；Ditadi等.2015)。此处，我们提出了一个新的可扩展的3D系统，在明确的无血清和无饲养细胞的条件下，稳健地从人PSC产生几乎纯的NK细胞群体。我们的发现代表了发展大规模细胞生产的突破性技术，不仅是NK细胞，还有其他淋巴和造血谱系的细胞类型。此外，如本文所示，我们的3D造血分化系统不同于所有可用的多能干细胞(PSC)分化方法，其适用于工业规模生产现成的免疫细胞产品，例如用于肿瘤免疫疗法的NK和T细胞。

从造血祖细胞形成血小板和RBC

收获的HPC的一个重要潜在应用是用于大规模制造巨核细胞和血小板，如先前所报道(Feng等.2014；Thon等.2014)。如早先发表的(Feng等.2014)在第8-10天收获的HPC在MK促进培养基中培养5-7天。如图10A所示，在MK促进培养基中孵育3天后观察到显著的前血小板形成(白色箭头所指)。如前所述(Feng等.2014)收获MK培养基中的血小板并分析了血小板(如图10B中门P1所示)和MK(图10B中门P2)上的MK特异性CD41a和CD42b的表达。CD41a⁺CD42b⁺的巨核细胞百分比达到83.4％，还获得了66.2％的CD41⁺CD42⁺的血小板(图10C和10D)。先前的报道证实，在2D培养系统中以类似方式获得的血小板具有完全的功能，并显示出与循环中的人类血小板相似的超微结构形态(Feng等.2014)。从我们的3D球体系统衍生的MK显示出等效特征。总之，在完全3D培养系统下产生巨核细胞和血小板比我们和许多其他实验室报道的2D系统具有主要的优势，不仅在可扩展性上，而且由于持续存在的剪切力模拟体内循环，在功能相关性上也有优势。

如图8所示，从第8-10天收获的早期HPC主要是CD235a⁺，表明其红系谱系。我们观察到当这些CD235a⁺HPC接种在CFU形成培养基(图10E)中时形成非常大的CFU-e集落，这表明CD235a⁺HPC适合于大规模生产设计的RBC，其可以用于输血或作为靶向药物运载体(目前正在被美国马萨诸塞州剑桥的Rubius疗法公司(Rubius Therapeutics，Cambridge，MA)作为新技术开发中)。

早期HPC中CD56⁺NK的来源与特征

NK细胞在下一代癌症免疫疗法中有重要作用。当前，通过从自体收获的外周血细胞扩增获取大量NK细胞在技术上是具有挑战性的。本文中我们证明了在我们的3D分化系统中产生的造血祖细胞能够高效地分化为NK细胞。从第8天(标示为HPC-A)，第11天(HPC-B)和第18天(HPC-C)的收获的HPC在为NK细胞分化成熟所配制的两种培养基(#1和#2)中培养另外21天。如图11A所示，这些在不同时间收获的HPC显示出不同的造血表面标志物概况：分别有大约60-70％和40％的HPC-A表达CD34和CD45；CD34的表达保持相似，但几乎100％的HPC-B是CD45阳性的；在HPC-C中CD34的表达几乎不可检测，但100％的HPC-C表达CD45，表明向造血细胞成熟。我们还观察到在不同时间收集的所有三种HPC群体中大约30％表达低水平CD56，这与图8C中所示结果一致。在两种培养基中培养后，从第6天到第13天，CD56低细胞在所有三种HPC收集物中逐渐丢失。此外，在培养基1中的第21天，HPC-A、HPC-B和HPC-C中没有出现CD56⁺细胞(图11C)。相反，在培养基#2中培养21天后重新出现了大量的CD56^高细胞，尤其是HPC-A，从中观察到明显的CD56^高细胞群(图11D)。该重新出现的CD56⁺群体比其HPC前体表达更高水平的CD56(图11B，第天HPC比第8+21天培养基#2)表示产生了具有NK谱系的CD56^+高细胞。

整合3D支架和3D球体在无血清无饲养细胞条件下产生纯NK细胞

之前的研究表明，胸腺的3D结构为T淋巴细胞发育提供了最佳环境(Mohtashami和Zuniga-Pflucker 2006)。为了改善无血清无饲养细胞条件下NK的分化和产生，第6天HEC被接种到模拟体内生态龛的3D支架中以促进NK特化。在支架内观察到优良的HEC生长和分化，并且从第16天起大量细胞被释放。在10天时间内，从最初接种的2x10⁶个HEC中收集了约10x10⁶个细胞。如图12A-12D所示，从支架中释放出来的细胞表现出与典型的圆形HPC截然不同的形态(图12A和12B)。流式细胞术分析的前向和侧向散射图表明释放的细胞是高度均一的(图12C，左上)。这些细胞中超过96％是CD56^+高(图12C和12D)，表示纯NK群体。不像PBMC中的T淋巴细胞(右上)，所述释放的CD56⁺NK细胞不表达T细胞受体(TCR)(图12C，中上)，也不表达泛T细胞标志物CD3(图12C，左下)，但是大部分PBMC表达CD3抗原(中下)。此外，在hiPSC衍生的NK细胞中未检测到B细胞标志物CD19(图12C，右下)。NKG2D是跨膜蛋白，属于在人NK细胞上表达的C型凝集素样受体的CD94/NKG2家族(Houchins等.1991)。NKp44(Vitale等.1998)和NKp46(Sivori等.1997)是NK特异性表面分子，参与触发人体内NK活性。我们证明了hiPSC-CD56^+高细胞是NKD2G⁺(96％)，NKp44⁺(95％)和NKP46⁺(90.9％)的(图12D，左图)。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是I型跨膜糖蛋白家族，在NK细胞和少数T细胞质膜上表达(Yawata等.2002；Bashirova等.2006)它们通过与主要组织相容性(MHC)I类分子相互作用调控这些细胞的杀伤功能。不同百分比的CD56⁺细胞是KIR2DS4⁺(49.2％)和KIR2DL1/DS1⁺(31.8％)，几乎所有这些CD56⁺细胞都是KIR3DL1/DS1^-(97％，图12D，右图)，表明它们在我们的3D系统中产生了hiPSC-NK群体KIR类型多样性。这些观察结果证明这些CD56^+高细胞是真正的NK细胞。

iPS-NK对K562靶细胞的细胞毒活性

如图13中左栏所示，NK效应细胞(P2)与靶K562细胞相比有截然不同的前向/侧向散射谱。K562细胞是GFP⁺，而iPS-NK细胞是GFP^-(示于中栏)。在与效应NK细胞孵育2小时后，几乎所有靶GFP⁺K562细胞都被iPS-NK细胞破坏，无论示于从第二排到底排的E∶T比率。剩余的少量K562细胞大部分是无活力的，如左栏所示。该结果证实了我们在这一新技术平台上产生的所述iPS-NK细胞不仅共享NK细胞的所有细胞标志物，还能以致死效率杀伤潜在的靶细胞。

RNAseq分析证实人iPS-NK细胞是真正的NK细胞

概要：通过对比RNAseq分析，人iPS-NK细胞与原代人NK细胞比较，结果证实人iPS-NK细胞聚集至原代NK细胞。

为了研究iPS-NK细胞是否为真正的人NK细胞，将人iPS-NK细胞的RNA-seq表达谱与两个公开获得的具有不同类型人免疫细胞的高质量RNAseq数据集对比。数据集1(Racle等.2017)包含从由三项研究(Racle等.2017)建立的人血液中分选的免疫细胞的参考基因表达谱，包含B细胞，CD4，CD8，单核细胞，中性粒细胞和NK细胞。数据集2(Calderon等.，在www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE118165处可获得)包含来自8个健康供者的25种血细胞类型的166个人类样本分选得到的免疫细胞的参考基因表达谱(Calderon等.，在www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE118165处可获得)。将人iPS-NK细胞原始计数(iPS-NK3，iPS-NK8和iPS-NK12)转化为基于人类基因组版本h19的TPM(转录本每百万读数)。基于匹配的独特基因符号在人iPS-NK数据和参考数据之间结合表达谱，并通过所有样本的总强度归一化。不同免疫细胞类型的细胞标志物来自Racle等人。使用参考数据集中1000个最易变基因通过皮尔逊相关性计算任意两个样本的相似度。基因表达谱热图和相关性用TMev显示。

基于特定细胞标志物表达分析和整体基因表达谱相似性，人iPS-NK细胞聚集至人原代NK细胞。(数据集1：平均相关：人iPS-NK与自身：0.89，与原代NK细胞：0.53，与其他细胞类型：0.31；数据集2：平均相关：人iPS-NK与自身：0.891，与原初NK：0.283，与活化的NK：0.229，与其他细胞类型：0.082)。然而，三批人iPS-NK细胞显示出一些差异，并且iPS-NK3样本(约95％CD56+细胞)与原代人NK细胞紧密匹配，而iPS-NK8和iPS-NK12的样本与两个参照数据集相比表达一些巨噬细胞和单核细胞的标志物，例如典型标志物CD14、CD33和CSF1R。这些巨噬细胞/单核细胞的特征与这两批人iPS-NK细胞的纯度一致(iPS-NK8和iPS-NK12样本分别有87％和75％CD56+)。总之，基于与两个不同公共RNAseq数据集的对比分析，这些结果非常一致，证实人iPS-NK细胞是真正的NK细胞。

高百分比(＞80％)的人iPS-NK细胞是CD56+CD8+效应细胞

概要：我们意外地发现，使用我们的技术平台生产的人iPS-NK细胞中超过80％是CD56⁺CD8⁺，表示细胞毒性效应细胞的强烈存在。

在人外周血中描述了NK细胞的不同亚集。大多数外周血NK细胞是CD56暗淡CD16+(CD56dimCD16+)细胞，而淋巴结常驻NK细胞主要是CD56明亮CD16-(CD56brightCD16-)NK细胞(Ahmad等.2014)。使用我们的3D体外人iPS分化系统，我们发现人iPS-NK细胞超过95％是CD56明亮CD16-。这些结果表明我们的造血细胞球可能与体内淋巴结组织类似，为NK细胞的分化和发育提供理想的生态龛环境。

约30％的人外周血NK细胞表达CD8标志物(Ahmad等.2014；Addison等.2005)。如图14所示，令人惊喜地发现衍生自我们的3D HSC分化系统的人iPS-NK细胞超过80％为CD56+CD8+。先前的报道证实CD56+CD8+人NK细胞比CD56+CD8-亚集NK细胞展示出更高的细胞溶解功能(Addison等.2005)。高频率的CD8+NK细胞与HIV感染的疾病进展较慢相关(Ahmad等.2014；Rutjens等.2010)。这些结果证明我们的3D分化平台优先产生高细胞毒性的CD56+CD8+亚集NK细胞。以CD56+CD8+NK细胞为主的过继转移可转化为更好的抗癌或抗病毒感染疗法的临床转归。

在无饲养细胞条件下体外扩增产生高产量高纯度的人iPS-NK细胞

概要：为了改善从生物反应器中收获的iPS-NK细胞的产量和纯度，我们已经证明收获的NK可以通过无饲养细胞明确的培养基进一步扩增和富集。

由于缺乏来自外周血或脐带血的足够的NK细胞，供体来源的NK细胞需要扩增，以便产生治疗剂量的人NK细胞用于细胞疗法。供体NK细胞的高效扩增依赖于饲养细胞的存在，例如人工抗原呈递细胞(iAPC)。由于在2D条件下NK谱系特异性分化低，先前报道的人iPS衍生NK细胞也需要饲养细胞依赖的扩增(Li等，2018)。使用改良的肿瘤饲养细胞不仅繁琐而且具有被NK细胞群体中不需要的细胞污染的风险。

除了本文所述的3D生物反应器人iPS-NK分化和生产系统的优越的可扩展性之外，还研究了人iPS-NK细胞的无饲养细胞扩增。如图15A-15D所示，结果证明在分化的各个阶段收获的5个不同批次的人iPS-NK细胞使用本文所述的无饲养细胞扩增系统扩增了约3至5倍。更重要的是，该系统不仅扩增这些细胞还富集CD56+NK细胞群体。在1到2周的扩增后，CD56+低于40％的群体被富集为CD56+达到＞95％的细胞。这些数据证明，不同分化阶段的人iPS-NK细胞/祖细胞可以在无饲养细胞条件下进一步扩增，产生纯度明显提高的CD56+NK细胞。

从3D造血分化平台产生CD3与T淋巴细胞

概要：除了人iPS-NK细胞，我们已经证明我们的系统可以高效地产生CD3⁺iPS-T细胞，这有力地表明我们已经成功地在我们的3D球体培养系统中重建了永久表型的长期造血生态龛环境。

T淋巴细胞的谱系特异性分化在技术上具有挑战性。大多数先前报道的从hES/iPS细胞分化T淋巴细胞是使用饲养细胞依赖的方法。发展可缩放的3D生物反应器系统以工业规模产生纯的T淋巴细胞对于未来的免疫癌症疗法极具吸引力。使用同样的平台并做出一些修改用于产生iPS-NK细胞，在两个单独的实验中产生了相对纯(＞60％)的CD3 T淋巴细胞样祖细胞(图17)。这些结果具有重要意义，原因如下：(1)CD3-NK细胞和CD3+T细胞可来自同样的淋巴样共同祖细胞；(2)在我们的3D分化系统中，这些淋巴样共同组细胞是在经历造血分化的球内高效地产生；以及(3)这些晚期球内的造血具有永久表型。进一步优化有利于T淋巴细胞谱系的3D球体分化系统将显著提高iPS-T细胞的产量、纯度和功能。这些结果进一步证实了最初所述，该3D造血分化系统是通用的平台技术，可适用于生产包括造血干细胞在内的所有造血谱系细胞。

人iPS-NK选择性地杀伤K562癌细胞而非正常细胞

概要：另外对人iPS-NK细胞针对正常细胞和癌细胞的细胞毒性分析证实，人iPS-NK细胞选择性地杀伤癌细胞而非正常细胞。

上文中已经证明了针对K562癌细胞的强大细胞毒活性。在OCI-AML3和GMB白血病细胞以及BxPC-3胰腺癌细胞中观察到了相似的抗癌细胞毒性效力。为了证实具有强大的细胞毒活性的人iPS-NK细胞能够区分正常细胞和癌细胞，将荧光标记的正常人外周血单核苷酸细胞(PBMC)和K562细胞与人iPS-NK细胞以1∶1的比例混合并孵育2小时。如图18所示，超过80％的K562细胞被杀死，然而对正常人PBMC没有观察到的明显细胞毒活性，证明人iPS-NK细胞的针对异常(癌)细胞，而非正常细胞的细胞毒性特异性。

实施例3：在500ml生物反应器中再现NK谱系特异性分化

概要：为了证实我们的3D悬浮培养系统能被放大到满足工业需求，我们还证明了在较小的30mL生物反应器中的人iPS-NK谱系特异性分化能够在500mL生物反应器中复制。

本公开的3D分化系统的主要优势之一是其可缩放性。为了验证谱系特异性分化是否能在大体积生物反应器中再现，在小的30m1和大的500m1生物反应器中使用相同的iPS细胞进行平行的NK谱系特异性分化。为了证实造血内皮(HE)谱系的早期诱导，在分化的第3天和第5天分析球内的HE标志物CD31，CD144(VE-Cad)和CD34以及造血标志物CD43。如图16A所示，虽然第3天30ml生物反应器的球体中CD31和CD144表达比500ml生物反应器中的高，但是第5天两种标志物都达到了相似水平(60-70％)。30ml和500ml生物反应器的球体中CD34和CD43的表达在第3天和第5天非常相似。数据证实，在500ml生物反应器内的造血内皮谱系诱导与30ml生物反应器内的几乎相同。

将一个500ml生物反应器的CD56+NK细胞生成动力学与3个单独的30mL生物反应器的结果进行了比较。如图16B所示，500mL生物反应器中CD56+NK细胞的出现(实线所示)与所有三个30ml生物反应器中的相差无几(在第46天＞90％的细胞是CD56+)。第46天收获的细胞显示出均一的iPS-NK形态(图16C)，这些细胞的大多数还表达NK细胞特异性激活受体NKG2D和NKp46。这些细胞中分别有约25％和35％对激活受体NKP44和抑制受体KIR呈阳性(图16D-16G)。这些结果证明NK谱系特异性分化过程能在更大的生物反应器中重复。合理预期使用大于500mL(例如，1升、10升、100升等)的生物反应器进一步放大iPS-NK细胞的生产也是可行和实用的。

实施例4：方法和材料

细胞系和试剂

通过使用StemRNA^TM-NM重编程试剂盒(Stemgent，目录号00-0076)从人正常皮肤成纤维细胞(hNDF)细胞中生成了本研究中使用的四种人诱导性多能干细胞(hiPSC)系。在定向分化为HEC和造血谱系之前，hiPSC在0.25μg/cm² iMatrix-511干细胞培养基材(重组层粘连蛋白511)(重组细胞)XF/FFTM培养基(生物工业公司)中作为集落体外生长至少15代。hiPSC是用Versene(赛默飞世尔科技公司)以细胞团块的形式传代，或是用Accutase或TripLE以单细胞的形式传代。为了保证hiPSC的基因组稳定性，以每隔5代的频率周期性地进行G-带核型分析。本研究只使用正常核型的hiPSC。

重组蛋白BMP4和制瘤素M(OSM)购自Humanzyme。VEGF，bFGF，TPO，SCF，IL-3，IL-6，IL-9，IL-7，IL-15，sDLL-1购自派普泰克公司(Peprotech)。EPO购自eBioscience(赛默飞世尔科技公司)。小分子Y27632购自Stemgent/Reprocell。CHIR99021购自TOCRIS生物科学公司(TOCRIS Bioscience)。小分子SB431542购自Reagent Direct公司。SR1购自干细胞技术公司。

用于CD31，CD144，CD34，CD43，CD235a，CD41a，CD42b，CD56，CD16，CD19，CD45，CD3，TCR，NKG2D，NKp44，NKp46的流式细胞术分析的荧光染料偶联抗体购自BD生物科学公司(BDBiosciences)。CD133-APC和KIR2DS4-PE，KIR2DL1/DS1-PE和KIR3DL1/DS1-PE购自美天旎生物技术公司(Miltenyi)。Oct-4 FITC购自细胞信号公司(Cell Signaling)。CD31，CD34，CD43的非偶联的小鼠抗-人抗体购自大科公司(DAKO)/安捷伦(Agilent)。

用于3D分化的hiPSC的预调节

hiPSC细胞可被培养在基质上，例如Laminin 521或Laminin 511在hPSC XF培养基中(美国生物工业公司(Biological Industries USA)。融合且未分化的hiPSC可以用Accutase(创新细胞技术有限公司)或TripLE(赛默飞世尔科技公司)传代，并以在补充有1μM Y27632的中6-8x10⁴个细胞/cm²的密度接种到涂覆有减小(1/2)浓度的基质的表面，培养3-7天。hiPSC可在此条件下扩增3-5代。流式细胞术分析检测Oct-4的表达水平来定量hiPSC的未分化状态(Oct-4阳性率超过95％)。为了起始3D悬浮培养，用Accutase或TripLE解离融合未分化的hiPSC，并以在补充了Y27632(1μM)的中1x10⁶个细胞/ml的密度接种到旋转瓶中。所述细胞在30-ml旋转瓶(AbelBiott)中以50-80的搅拌速率不间断地培养48小时。接种后48小时取出小样品并检查形态和球体大小。周期性地更换培养基，直到球体尺寸达到直径250-300微米。为了传代，用PBS(Mg^-，Ca^-)洗涤hiPSC球体，然后用Accutase或TripLE解离。然后，解离的hiPSC单细胞以所需的密度接种，以扩增或起始造血分化。

逐步诱导hiPSC为HEC和造血谱系

此新的3D分化工艺是专门为了实现以下4个目的而开发的：(1)HEC群体的一致高效生成；(2)HEC中间产物向造血谱系的高效过渡；(3)在长期培养中维持强CD34⁺群体；和(4)最大限度地获得具有所有谱系特异性的高质量HPC。

为了确定高效HEC分化的最佳接种密度，将解离的hiPSC悬浮液以3种不同密度(0.67、1和1.33x10⁶个细胞/ml)接种在HEC诱导培养基M1(补充有Y27632)中12小时。测量hiPSC球体平均尺寸。典型的球体尺寸直径为80-150微米之间，取决于接种密度。为了起始HE分化，去除补充有Y27632的并替换为以25-50ng/ml的浓度范围补充了BMP4、VEGF和bFGF的HEC诱导培养基M2(无生长因子hPSC XF培养基)。M2中的hiPSC球体在缺氧条件(5％氧气)下培养4天，随后在20％的正常氧气浓度下再培养2天。每天更换培养基，在第3天和第4天以3μM补充小分子CHIR99021，并在第4天和第5天以3μM补充小分子SB431542(参见图2)。在HEC分化的第6天，细胞球在37℃下被TripLE处理15-30分钟，解离成单细胞悬浮液。使用流式细胞术分析HEC特异性表面标志物CD31，CD144(VE-钙粘蛋白)，CD34和CD43的表达。成功的HEC分化产出30-70％CD31⁺和CD144⁺细胞，以及15-30％CD34⁺和7.5-20％CD43⁺细胞。包含HEC的球体可过渡到造血定向和扩增培养基M3(图2)。

造血祖细胞释放、收获和表征

HEC是双潜能中胚层中间细胞群体，能够成为内皮谱系或造血谱系。为了在我们新开发的平台上最大化造血谱系产出，在1期扩增中使用补充有TPO(10-25ng/ml)、SCF(10-25ng/ml)、Flt3L(10-25ng/ml)、IL-3(2-10ng/ml)、IL-6(2-10ng/ml)、SR1(0.75μM)、OSM(2-10ng/ml)和EPO(2U/ml)的造血扩增培养基M3培养5天。补充有TPO(10-25ng/ml)，SCF(10-25ng/ml)，Flt3L(10-25ng/ml)，IL-3(2-10ng/ml)，IL-6(2-10ng/ml)，SR1(0.75μM)，OSM(2-10ng/ml)和EPO(3U/ml)的造血分化/扩增培养基M4用于2期扩增(达到40天)。每天更换培养基，并通过离心从培养基中收获释放的祖细胞，分析表面谱系特异性标志物例如CD41(巨核祖细胞)，CD235a(红细胞祖细胞)，CD34⁺CD45⁺(早期淋巴样/髓系谱系祖细胞)，CD56⁺(NK谱系祖细胞)和CD34⁺CD133⁺(造血干细胞)。

在3D细胞球内逐步诱导HEC群体的形态学和免疫荧光分析

从第0天开始，将未分化的hiPSC球体，以及过程中各阶段的分化球体收集起来，并在PBS中4％多聚甲醛中4℃固定1小时。然后洗涤球体(用PBS洗一次)并用OCT在-20℃包埋1小时。冷冻的球体用莱卡(Leica)CM1900低温恒温器以厚度10-15微米切片。切片被固定到带正电的玻片上并在室温下空气干燥至少1小时。用新鲜制备的冷的(4℃)4％多聚甲醛(PFA)的PBS再次固定球体切片10分钟，然后在PBS中洗涤3次。对于组织学检查，玻片用苏木精溶液染色30秒，用自来水冲洗，并用水性固定剂(载体实验室公司(Vector Lab))固定。在明场显微镜下用彩色成像系统记录球体形态。

为了进行免疫荧光染色，样品在室温下用封闭溶液(大科/安捷伦)处理30分钟，然后在室温下用或不用未偶联的一抗(CD31、CD34、CD43，用封闭溶液以1∶50-100的比例稀释)孵育1小时。载玻片用PBS洗涤3遍并用以1∶200或1∶400比例稀释在封闭溶液中的配对的驴抗小鼠Alexa 488-偶联抗体(赛默飞世尔科技公司)室温下孵育1小时。载玻片再用PBS洗涤3次并用含DAPi的封固剂固定。通过荧光显微成像系统(尼康(Nikon)，Eclipse)观察细胞球切片上HEC和/或造血标志物的表达。

CD34⁺群体的纯化和表征

将各分化阶段的细胞球收集并解离成单细胞以进行CD34⁺群体富集。用TripLE在37℃孵育仅15分钟到1小时就能够解离早期球体(直到第12天)。对于第12天以后的球体，需要另外用浓度1mg/ml的胶原酶IV(赛默飞世尔科技公司)在37℃预孵育3-24小时，然后用TripLE解离。在解离的最后，细胞悬液通过40μm网格的过滤器过滤以去除任何大的细胞团块。使用美天旎CD34和CD45微珠试剂盒(美天旎生物技术公司)进行特定细胞群体富集。按照生产商的说明使用CD133微珠试剂盒(美天旎生物技术公司)分离CD133⁺和CD133^-HPC群体。不同组分的细胞通过流式细胞术分析CD34、CD45和CD133的表达。

在分化日从球体中纯化的CD34⁺，CD34^-CD45⁺和CD34^-CD45^-群体用于造血集落形成检测。简言之，将来自三个组分中每一个的2,000个细胞与1ml Methcult H4436(干细胞科技公司)混合，并接种到24孔超低附着板中。每天通过显微镜观察监测集落的生长直到第25天。用照相法和手工计数法记录造血集落的形态和数量。

巨核细胞(MK)谱系特异性分化及由HPC产生血小板

收集从分化的第8天到第10天释放的HPC并使用先前报道的有利于MK谱系的条件在体外培养(Feng等.2014；Thon等.2014)。StemSpan^TM-ACF(干细胞技术公司)培养基补充有TPO，SCF，IL-6和IL-9及肝素(5U/ml)在超低附着板(康宁公司(Corning)中。在培养的前3天添加5微摩尔Y-27632，细胞在39℃下在7％CO₂中孵育。每天监测细胞密度并添加新鲜的培养基以保持前4天10⁶个细胞/ml。通过分析CD41a和CD42bMK表达，监测来自MK祖细胞(MKP)的MK的成熟。一旦观察到前血小板形态(图12)，连续3-5天收集血小板并分析CD41a/CD42b的表达。

HPC的体外NK谱系特异性分化

收集在分化第8天、第11天和第18天释放的HPC并使用如所报道(Kaufman 2009；Knorr等.2013)的有利于NK谱系发育的条件在体外进行改良培养。两种不同的基础培养基进行比较，补充有10％FBS，SCF(10ng/mL)，Flt-3(5ng/mL)，IL-7(5ng/mL)，IL-15(10ng/mL)，sDLL-1(50ng/mL)，IL-6(10ng/mL)，OSM(10ng/mL)和肝素(3U/mL)。所有细胞以2x10⁶个细胞/ml的密度在超低附着表面上培养。隔天更换培养基，并监测NK谱系标志物CD56的表达直到25天。对于使用细胞支架的NK谱系发育，根据生产商的说明将从第6天的球体中收获的2-4x10⁶个HEC加载到Cell-Mate 3D μGel 40试剂盒(BRTI生命科学公司(BRTI LifeSciences)中。将负载的支架在无血清版本的NK促进培养基中悬浮培养，该培养基补充了IL-3(2-10ng，仅在前5天)、IL-7(5-20ng/ml)、IL-15(5-20ng/ml)、SCF(10-100ng/ml)、Flt3L(10-100ng/ml)、sDLL-1(20-100ng/ml)和肝素。隔天更换培养基。悬浮液中从支架中释放的细胞被监测NK特异性标志物CD56、NKp44、NKp46、NKG2D、KIR、TCR、CD3和CD19长达50天。

人iPS衍生NK细胞对K562红白血病细胞的细胞毒性

用于定量测定NK细胞的细胞毒活性的试剂盒购自德国海德堡Glycotope生物科技GmbH公司(Glycotope Biotechnology GmbH(Heidelberg，Germany)。简言之，解冻靶细胞(T)K562 GFP细胞，测定细胞存活率(＞92％)。用完整的培养基(提供)将K562浓度调节至1x10⁵个细胞/ml。从NK培养物中收获的iPS-NK不经纯化直接用作效应细胞(E)。用完全培养基调节效应细胞浓度至5x10⁶个/ml。在12x75mm培养管中，加入或不加入IL-2(200U/ml)的效应细胞与靶细胞分别以1∶50、1∶25和1∶12.5的T∶E比混合，单独K562细胞用作对照。振荡所有管，将管在120g离心2-3分钟。在CO₂培养箱中孵育管120分钟。每个试管加入50ml DNA染色液，振荡并在冰上孵育5分钟。用GFP和PE的流动通道，加入DNA染色液后30分钟内测量细胞悬液。

等同形式

本公开尤其提供了体外细胞培养系统及其应用。虽然已经讨论了本主题公开的特定实施方式，但是以上说明书是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书后，本公开的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。本公开的全部范围应该通过参考权利要求及其等同物的全部范围和说明书以及这些变化来确定。

通过引用纳入

本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，就好像每个单独的出版物或专利均被明确地和单独地指出通过引用并入。

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