一种组织单细胞悬液的制备方法
阅读说明：本技术 一种组织单细胞悬液的制备方法 (Preparation method of tissue single cell suspension ) 是由 徐福桥 朱月艳 孙子奎 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种组织单细胞悬液的制备方法,1)配制试剂与培养基,2)组织预处理,3)组织初步消化解离,4)组织二次消化彻底解离,5)μm细胞过滤器过滤,6)获取目的组织单细胞悬液；7)测活细胞得率,本发明制备组织单细胞悬液的方法,能够实现低成本、快速、高效获得组织单细胞悬液,并保证解离的细胞保持良好活力,可应用于大范围的动物细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立,为动物的单细胞、基因功能及遗传育种研究提供重要参考资料。(The invention discloses a preparation method of a tissue single cell suspension, which comprises the following steps of 1) preparing a reagent and a culture medium, 2) pretreating tissues, 3) preliminarily digesting and dissociating the tissues, 4) secondarily digesting and completely dissociating the tissues, 5) filtering a micron cell filter, and 6) obtaining the target tissue single cell suspension; 7) the method for preparing the tissue single cell suspension can realize low-cost, quick and efficient acquisition of the tissue single cell suspension, ensures that dissociated cells keep good activity, can be applied to dissociation, separation and purification of animal cells and establishment of cell lines in a large range, and provides important reference data for research on single cells, gene functions and genetic breeding of animals.)
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种组织单细胞悬液的制备方法。
背景技术
近年来，随着生物研究领域技术的飞速发展，单细胞测序技术应运而生，它是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。单细胞测序能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达情况，对细胞进行分类比较，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、免疫学、微生物学等领域发挥重要作用。
不同的组织具有各自独特的生理特性，是导致组织细胞培养成为世界性难题的主要原因。现存的实验技术仍不能获得细胞活力较好的组织单细胞悬液，制约着组织的细胞培养、细胞系的建立和功能基因验证等方面研究工作。因此，高效制备组织单细胞悬液有助于建立和优化成体组织细胞的体外培养技术，为细胞系的建立提供重要的参考资料，并在功能基因、遗传育种等研究领域具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的提供一种组织单细胞悬液的制备方法。
本发明的方案是：
一种组织单细胞悬液的制备方法，包括下列步骤：
1)配制试剂与培养基，所述培养基包括两种培养基分别为无血清培养基与完全培养基，配制细胞清洗液，配制胶原酶Ⅱ解离原液；
2)组织预处理，在无菌无RNA酶细胞培养皿中加入适量1*DPBS溶液，离体组织剪碎成0.5～1mm2小块后，置于已含有1*DPBS溶液的无菌无RNA酶细胞培养皿中，并用1*DPBS溶液冲洗1-2次，直至把血液、脂肪层等多余组织去除干净；
3)组织初步消化解离，胶原酶Ⅱ解离原液，加入至干净的15ml tube管内，并在管壁做好标记，用镊子将步骤2)处理好的的组织小块夹入含有胶原酶Ⅱ解离原液的15mltube管内，消化孵育，37℃摇床，50rpm，20～30min；
4)组织二次消化彻底解离，将经加入初步消化的组织及胶原酶Ⅱ解离原液转移至50ml tube,并加入15ml所述步骤1)中无血清培养基，离心去上清液，离心条件300g，5～10min；重悬孵育，加入5ml无血清培养基与0.25％Trypsin-EDTA，再加入10U/ml DNase I，37℃孵育10min；用移液枪轻轻吹打，直至组织完全裂解，肉眼观察不见明显团块，终止消化，加入等体积的步骤1)中的完全培养基，轻轻吸打混匀，获得细胞悬液；
5)μm细胞过滤器过滤，将获取的所述细胞悬液通过的细胞过滤器缓慢倒入新的tube管中，并在管壁上标记；
6)获取目的组织单细胞悬液；
7)测活细胞得率，吸取台盼蓝染色与等体积的步骤6)的目的组织单细胞悬液充分混匀后吸取充入计数板中的池中，由细胞计数仪测得活细胞比率。
作为优选的技术方案，每100ml所述无血清培养基中含有99ml的基础培养基与1ml的Penicillin-Streptomycin，每100ml所述完全培养基中含有89ml的基础培养基、10ml的FBS与1ml的Penicillin-Streptomycin，所述基础培养基为RPM1640或DMEM/F12培养基其中的一种。
作为优选的技术方案，所述细胞清洗液包括1*DPBS与BSA，每100ml 1*DPBS溶液中加入0.04g BSA。
作为优选的技术方案，所述胶原酶Ⅱ解离原液包括胶原酶Ⅱ冻干粉与无血清基础培养基，每10ml的无血清基础培养基中加入20mg胶原酶Ⅱ冻干粉制得胶原酶Ⅱ解离原液，所述无血清基础培养基为RPM1640或DMEM/F12培养基其中一种。
作为优选的技术方案，所述步骤)5中细胞过滤器为40μm的细胞过滤器。
作为优选的技术方案，步骤1)中5ml无血清培养基与0.25％Trypsin-EDTA的按照1:1的体积比混合后加入。
作为优选的技术方案，所述步骤6)中获取目的组织单细胞悬液的方法如下：
稀释，将步骤5)中过滤的细胞悬液混匀，吸取10μl打入计数板，细胞计数板计数，并根据细胞数量将悬液用1*DPBS稀释至2～2.2*106cells/ml；
1*DPBS洗涤，经300g,5min离心后弃上清液，加入500μl的1*DPBS，轻轻吸打混匀；
获取目的组织单细胞悬液，300g，5min离心后弃上清液，加入500μl的含有0.04％BSA的1*DPBS溶液重悬细胞。
制备的组织单细胞悬液，组织单细胞悬液在单细胞测序中的应用。
由于采用了上述技术方案一种组织单细胞悬液的制备方法，1)配制试剂与培养基，所述培养基包括两种培养基分别为无血清培养基与完全培养基，配制细胞清洗液，配制胶原酶Ⅱ解离原液；2)组织预处理，在无菌无RNA酶细胞培养皿中加入适量1*DPBS溶液，离体组织剪碎成0.5～1mm2小块后，置于已含有1*DPBS溶液的无菌无RNA酶细胞培养皿中，并用1*DPBS溶液冲洗1-2次，直至把血液、脂肪层等多余组织去除干净；3)组织初步消化解离，胶原酶Ⅱ解离原液，加入至干净的15ml tube管内，并在管壁做好标记，用镊子将步骤2)处理好的的组织小块夹入含有胶原酶Ⅱ解离原液的15ml tube管内，消化孵育，37℃摇床，50rpm，20～30min；4)组织二次消化彻底解离，将经加入初步消化的组织及胶原酶Ⅱ解离原液转移至50ml tube,并加入15ml所述步骤1)中无血清培养基，离心去上清液，离心条件300g，5～10min；重悬孵育，以1:1的体积比加入步骤1)中5ml无血清培养基与0.25％Trypsin-EDTA，再加入10U/ml DNaseI，37℃孵育10min；用移液枪轻轻吹打，直至组织完全裂解，肉眼观察不见明显团块，终止消化，加入等体积的步骤1)中的完全培养基，轻轻吸打混匀，获得细胞悬液；5)μm细胞过滤器过滤，将获取的所述细胞悬液通过的细胞过滤器缓慢倒入新的tube管中，并在管壁上标记；6)获取目的组织单细胞悬液；7)测活细胞得率，吸取台盼蓝染色与等体积的步骤6)的目的组织单细胞悬液充分混匀后吸取充入计数板中的池中，由细胞计数仪测得活细胞比率。
本发明的优点：本发明制备组织单细胞悬液的方法，能够实现低成本、快速、高效获得组织单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，可应用于大范围的动物细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为动物的单细胞、基因功能及遗传育种研究提供重要参考资料。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种组织单细胞悬液的制备方法以解决上述背景技术中的问题。
一种组织单细胞悬液的制备方法，包括下列步骤：
1)配制试剂与培养基，所述培养基包括两种培养基分别为无血清培养基与完全培养基，配制细胞清洗液，配制胶原酶Ⅱ解离原液；
2)组织预处理，在无菌无RNA酶细胞培养皿中加入适量1*DPBS溶液，离体组织剪碎成0.5～1mm2小块后，置于已含有1*DPBS溶液的无菌无RNA酶细胞培养皿中，并用1*DPBS溶液冲洗1-2次，直至把血液、脂肪层等多余组织去除干净；
3)组织初步消化解离，胶原酶Ⅱ解离原液，加入至干净的15ml tube管内，并在管壁做好标记，用镊子将步骤2)处理好的的组织小块夹入含有胶原酶Ⅱ解离原液的15mltube管内，消化孵育，37℃摇床，50rpm，20～30min；
4)组织二次消化彻底解离，将经加入初步消化的组织及胶原酶Ⅱ解离原液转移至50ml tube,并加入15ml所述步骤1)中无血清培养基，离心去上清液，离心条件300g，5～10min；重悬孵育，以1:1的体积比加入步骤1)中5ml无血清培养基与0.25％Trypsin-EDTA，再加入10U/ml DNase I，37℃孵育10min；用移液枪轻轻吹打，直至组织完全裂解，肉眼观察不见明显团块，终止消化，加入等体积的步骤1)中的完全培养基，轻轻吸打混匀，获得细胞悬液；
5)μm细胞过滤器过滤，将获取的所述细胞悬液通过的细胞过滤器缓慢倒入新的tube管中，并在管壁上标记；
6)获取目的组织单细胞悬液；
7)测活细胞得率，吸取台盼蓝染色与等体积的步骤6)的目的组织单细胞悬液充分混匀后吸取充入计数板中的池中，由细胞计数仪测得活细胞比率。
每100ml所述无血清培养基中含有99ml的基础培养基与1ml的Penicillin-Streptomycin，每100ml所述完全培养基中含有89ml的基础培养基、10ml的FBS与1ml的Penicillin-Streptomycin，所述基础培养基为RPM1640或DMEM/F12培养基其中的一种。
所述细胞清洗液包括1*DPBS与BSA，每100ml 1*DPBS溶液中加入0.04g BSA。
所述胶原酶Ⅱ解离原液包括胶原酶Ⅱ冻干粉与无血清基础培养基，每10ml的无血清基础培养基中加入20mg胶原酶Ⅱ冻干粉制得胶原酶Ⅱ解离原液，所述无血清基础培养基为RPM1640或DMEM/F12培养基其中一种。
所述步骤)5中细胞过滤器为40μm的细胞过滤器。
步骤1)中5ml无血清培养基与0.25％Trypsin-EDTA的按照1:1的体积比混合后加入。
所述步骤6)中获取目的组织单细胞悬液的方法如下：
稀释，将步骤5)中过滤的细胞悬液混匀，吸取10μl打入计数板，细胞计数板计数，并根据细胞数量将悬液用1*DPBS稀释至2～2.2*106cells/ml；
1*DPBS洗涤，经300g,5min离心后弃上清液，加入500μl的1*DPBS，轻轻吸打混匀；
获取目的组织单细胞悬液，300g，5min离心后弃上清液，加入500μl的含有0.04％BSA的1*DPBS溶液重悬细胞。
制备的组织单细胞悬液，组织单细胞悬液在单细胞测序中的应用。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例：
第一步：配置试剂和培养基
1.分别准备以下两种培养基
(1)无血清培养基：分装的RPM1640或DMEM/F12培养基中含有1％的Penicillin-Streptomycin；99ml RPM1640或DMEM/F12培养基加入1mlPenicillin-Streptomycin
(2)完全培养基：分装的RPM1640 or DMEM/F12培养基中含有10％FBS和1％Penicillin-Streptomycin；89ml RPM1640或DMEM/F12培养基加入10ml FBS和1mlPenicillin-Streptomycin
2.准备细胞清洗液：含0.04％BSA的1*DPBS溶液：100ml 1*DPBS溶液中加入0.04gBSA
3.配制胶原酶Ⅱ解离原液：将20mg胶原酶Ⅱ冻干粉(Sigma，货号C6885-1G)的冻干粉溶于10ml的无血清RPM1640 or DMEM/F12培养基中，待完全溶解后分装到1.5ml离心管中，并保存于-20℃冷冻柜中，避免反复冻融。
第二步：组织预处理
在无菌无RNA酶细胞培养皿中加入适量1*DPBS溶液。组织剪碎成0.5-1mm2小块后，置于已含有1*DPBS溶液的细胞培养皿中，并用1*DPBS溶液冲洗1-2次，直至把血液、脂肪层等多余组织去除干净。
第三步：组织初步消化解离
1.稀释配制好的胶原酶Ⅱ解离原液，加入至干净的15ml tube管内，并在管壁做好标记。
2.用镊子将洗干净的组织小块夹入含有胶原酶Ⅱ解离液的15ml tube管内。消化孵育：37℃摇床，50rpm，20-30min.(可根据每次碎块组织的大小决定胶原酶Ⅱ消化孵育时间)。
第四步：组织二次消化彻底解离
1.将经加入初步消化的组织及胶原酶Ⅱ解离液转移至干净的50ml tube,并加入15ml配制好的无血清培养基溶液，离心去上清液。离心条件：300g，5-10min。
2.重悬孵育：以1:1的体积比加入配制好的5ml无血清培养基溶液和0.25％Trypsin-EDTA，再加入10U/ml DNase I，37℃孵育10min。
3.用移液枪轻轻吹打，直至组织完全裂解(肉眼观察不见明显团块)
4.终止消化：加入等体积的配制好的完全培养基溶液，轻轻吸打混匀，获得细胞悬液。
第五步：μm细胞过滤器过滤
将获取的细胞悬液通过40μm的细胞过滤器缓慢倒入干净的tube管中，并在管壁上标记。
第六步：获取目的组织单细胞悬液
1.稀释：将过滤的细胞悬液混匀，吸取10μl打入计数板，Bio-Rad TC20细胞计数板计数，并根据细胞数量将悬液用1*DPBS稀释至大约2-2.2*106cells/ml。
2.1*DPBS洗涤：经300g,5min离心后弃上清液。加入500μl的1*DPBS，轻轻吸打混匀。
3.获取鸡胸肉的肌肉组织单细胞悬液：300g，5min离心后弃上清液。加入500μl的含有0.04％BSA的1*DPBS溶液重悬细胞。
第七步：测活细胞得率
吸取10μl台盼蓝染色和等体积的单细胞悬液，充分混匀后吸取10μl充入计数板中的池中。由Bio-Rad TC20细胞计数仪测得活细胞比率。
结果如下表所示，总细胞数在1.10-1.44*106cells/ml之间，活细胞数在8.72*105-1.15*106cells/ml之间，活细胞率在67-90％之间。一共做了8个样本的单细胞悬液如下表1所示，其中，木质化组的200标本、239标本、323标本，正常组的252标本、308标本、337标本共6个标本成功进行建库，等待上机测序。
表1如下：
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。