粗壮女贞总黄酮、制备方法和应用
阅读说明：本技术 粗壮女贞总黄酮、制备方法和应用 (Ligustrum robustum total flavone, preparation method and application ) 是由 张倩茹 荆晶 何芋岐 谭道鹏 秦琳 杜艺玫 王阳 于 2020-08-14 设计创作，主要内容包括：本申请公开了中药材制备和应用技术领域中的粗壮女贞总黄酮的应用,通过动物实验验证,粗壮女贞总黄酮的LD50>500mg/kg,证明粗壮女贞总黄酮毒性较低,可有效改善酒精对小鼠的胃肠道、神经方面的毒性,对预防急性酒精性肝损伤小鼠具有一定的药效作用和安全性。(The application discloses application of ligustrum robustum total flavonoids in the technical field of traditional Chinese medicine preparation and application, and animal experiments prove that the LD50 of the ligustrum robustum total flavonoids is more than 500mg/kg, so that the ligustrum robustum total flavonoids is low in toxicity, can effectively improve the toxicity of alcohol to gastrointestinal tracts and nerves of mice, and has certain pharmacodynamic effect and safety in preventing acute alcoholic liver injury of the mice.)
技术领域
本发明涉及中药材制备和应用技术领域，具体涉及粗壮女贞总黄酮、制备方法和应用，更具体的是粗壮女贞醇提物的制备方法和应用以及粗壮女贞总黄酮、制备方法和应用。
背景技术
各种酒精饮料包括白酒、红酒、啤酒一直受到人们的喜爱。适量饮酒能够促进血液循环、驱寒祛湿、消肿止痛以及舒筋活血，但长期大量饮酒会引起酒精中毒及酒精性肝损伤。酒精性肝损伤是我国常见的肝脏疾病之一，酒精性肝损伤进而可发展为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。人在大量饮酒后，会根据人体内的酒精含量而出现不同的症状：轻者可见恶心呕吐、心情烦躁及语无伦次等情况；重者将会损伤脏器功能，导致呼吸减缓，甚至死亡。近年来我国酒精性肝损伤发生率逐年升高，已成为影响人们健康生活的重大隐患。
粗壮女贞(Ligustrum robustum(Roxb.)Blume)为木樨科女贞属植物，因其具有“清热解毒保肝”的作用被收录在《中华本草·苗药卷》(贵州科技出版社,2005)。粗壮女贞叶制成的苦丁茶，在我国西南三省被作为清热解毒、生津止渴、提神醒脑、祛暑利尿的饮品。粗壮女贞的主要化学成分有黄酮类、萜类、苯乙醇类等。现代药理研究表明，粗壮女贞具有抗氧化、调节血压、降血脂、保肝、降血糖、抗炎镇痛、抗菌、抗癌等作用。前期研究发现，粗壮女贞乙酸乙酯提取物能有效改善高脂饮食诱导的脂肪肝症状，并降低血脂水平。而其他相关研究亦证实，特女贞苷对急性肝损伤小鼠具有保护作用；女贞总苷对急性肝损伤小鼠也具有一定的保肝作用。目前尚没有关于粗壮女贞总黄酮(LTF)在预防及治疗急性酒精性肝损伤的相关研究。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，对粗壮女贞总黄酮进行提取纯化，同时建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，研究粗壮女贞总黄酮对小鼠急性酒精性肝损伤的治疗效果。
本发明的目的之一是提供粗壮女贞醇提物在制备解酒药物或者解酒食品中的应用。
本发明的目的之二是提供粗壮女贞总黄酮在制备解酒药物或者解酒食品中的应用。
本发明的目的之三是提供粗壮女贞醇提物在制备治疗或预防酒精性肝损伤的药物中的应用。
本发明的目的之四是提供粗壮女贞总黄酮在制备治疗或预防酒精性肝损伤的药物中的应用。
本发明的目的之五是提供一种食品或者药物，包含粗壮女贞醇提物和/或者粗壮女贞总黄酮。
本发明的目的之六是提供粗壮女贞醇提物的制备方法，取粗壮女贞原药材，以体积分数为80％的乙醇作为溶剂，浸泡7小时后，采用热回流法提取，在70～80℃下热回流提取两次，每次3h，第一次料液比为1∶20，第二次为1∶12，合并提取液并过滤，滤液经浓缩、干燥，即得粗壮女贞醇提物。
本发明的目的之七是提供粗壮女贞总黄酮的制备方法，取粗壮女贞原药材，用体积分数浓度为80％的乙醇浸泡7h后，在70～80℃下热回流提取两次，每次3h，合并提取液并过滤，滤液经浓缩、干燥，即得粗壮女贞醇提物；粗壮女贞醇提物用大孔树脂洗脱后，再用水、体积分数为10％的乙醇、体积分数为50％的乙醇依序洗脱，收集洗脱浓度为50％乙醇部位进行浓缩干燥，得粗壮女贞总黄酮。
进一步，所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
大孔树脂也叫高分子多孔微球，是一类具有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，具有较好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以选择性的吸附水溶液中的有机物，对天然化合物如黄酮类化合物、总皂苷等有着选择性的吸附功能。由于大孔树脂具有高稳定性、安全低毒、分离效果好、溶剂易回收且可再生重复利用等特点，已被广泛用于混合物特别是中药提取物的分离纯化，因此我们采用大孔树脂对粗壮女贞总黄酮进行分离纯化。
AB-8型大孔树脂的表面为疏水性基团，但在其骨架中附加了一定的亲水基，适用于具有弱极性成分如黄酮类化合物、生物碱等的分离纯化。为研究AB-8型大孔树脂对粗壮女贞总黄酮分离纯化的特征，本研究采用静态吸附、动态吸附等实验对AB-8型大孔树脂的吸附性能进行综合分析。结果表明，AB-8型大孔树脂的对粗壮女贞总黄酮的吸附效果及解析附效果均较好。
为获得最优化的分离纯化参数，本研究采用单因素法对大孔树脂的上样液浓度、洗脱液乙醇浓度、洗脱剂体积进行考察，得到的最佳分离纯化条件为：以AB-8型大孔树脂为分离材料，醇提物上样浓度为168mg/ml，上样量为1/3BV，用8BV的水、体积分数为10％乙醇、体积分数为50％乙醇依次进行洗脱，收集体积分数为50％乙醇洗脱液减压浓缩至干。
由于粗壮女贞醇提物在水中不易溶解，在配置粗壮女贞醇提物时有部分醇提物未完全溶解在水中，因此导致粗壮女贞醇提物中的总黄酮含量的测定值低于实际含量，然而在上样洗脱时，未完全溶解的物质一起被上样、洗脱，使得总黄酮的最终得率大于100％。
本发明的目的之七是提供一种用上述方法制备的粗壮女贞总黄酮。
本发明的工作原理：酒精在肝脏被代谢后，产生的过量自由基能过度氧化生物膜表面的脂质成分，进而使线粒体膜和肝细胞膜被破坏，导致AST、ALT大量入血。肝细胞中ALT含量最高，而AST则分布在心肌、肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中。正常情况下，只要少量ALT释放入血中，血清中ALT的活性可有显著升高。而血清中AST含量较低，当肝细胞坏死时，ALT大量释放入血中，细胞膜的通透性就会增加，从而导致胞浆内的AST释放入血中，引起血清中AST含量升高。AST和ALT是最常用的肝损伤检测指标。因此，通过对血清中AST、ALT水平的测定，观察实验小鼠肝脏病理切片结果，以提示肝脏疾病信号。
将雄性小鼠按体重随机分为正常组、模型组、阴性对照组、水飞蓟宾阳性对照组(30mg/kg)和粗壮女贞总黄酮(LTF)高、中、低剂量组，给药剂量分别为800、400、200mg/kg。除正常组外，其余各组小鼠采用53％乙醇(10mL/kg)连续灌胃2周。高、中、低给药组小鼠给予对应剂量的LTF溶液(0.5％CMC-Na)，以水飞蓟宾为阳性对照。每日观察小鼠的皮毛、食欲和行为状态等。连续给药2周后，肉眼观察肝、肠和胃的变化；检测各组小鼠血清ALT、AST水平。结果：与正常组比较，模型组小鼠肝脏指数具有显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，正常组小鼠肝脏指数具有极显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，LTF高、中、低剂量组的血清ALT水平显著下降(P<0.05)ALT出现显著性差异，是由于ALT较为敏感，只要肝细胞出现损伤，血清中的ALT就会大幅度升高。LTF的LD50>500mg/kg，表明LTF毒性较低。结论：LTF可有效改善酒精对小鼠的胃肠道、神经方面的毒性，对预防急性酒精性肝损伤小鼠具有一定的药效作用和安全性。
LD50是指造成实验动物半数死亡所需的最小药物剂量，可以用于判定药物的安全性，亦是衡量人类接触药物的安全标尺。
本试验采用53％乙醇模拟小鼠急性酒精肝损伤模型。由于小鼠摄食量的减少，无法满足自身所需的摄食量，以至于体重出现明显的下降。小鼠的死亡可能是由于酒精刺激导致肠胃胀气、酒精对神经的抑制作用、以及小鼠个体差异对酒精不耐受等多种因素导致的。后期死亡可能是由于急性酒精性肝损伤的初步形成，进而导致酒精性肝损伤相关并发症的出现。
肝脏是酒精的主要代谢点，然而酒精会导致肝脏发生酒精性肝功能损伤及器质性病变，从而使肝脏质量增加，肝脏指数则能在一定程度上显示出肝损伤的形成，而出现肝脏增重的情况。在本实验中，可能是由于脂肪肝的形成，导致肝脏质量增加，从而测出模型组小鼠的肝脏指数略高于其他组小鼠的肝脏指数。
急性毒性是指人或动物在一次(是指瞬间给实验动物染毒，如经口、经静脉注射染毒。)或24h之内多次(是指外源化学物毒性过低，需给予动物较大剂量)接触外源化学物后，在短期内所发生的毒性反应，包括致死效应。对药物进行急性毒性实验，目的是为了该药物在短期内的毒性作用，并为该药物在临床上进行诊断、预防和急救治疗提供可靠的科学依据。在预试验中，以剂量为5、50、500、5000mg/kg的LTF在24h之内多次对小鼠灌胃，小鼠未出现死亡。因此，结合预试验的试验结果以及《中华本草·苗药卷》中有关粗壮女贞记载的相关资料，以200mg/kg、400mg/kg和800mg/kg为给药剂量进行正式实验。实验结果表明，LTF具有一定的安全性，未有致小鼠死亡及其他异常变化情况发生。
LD50是指造成实验动物半数死亡所需的最小药物剂量，可以用于判定药物的安全性，亦是衡量人类接触药物的安全标尺。LD50越大，表明药物毒性越低，越安全；反之，LD50越小，则表明药物毒性越强，越危险。而绝大多数中药材作用温和，毒性较小，均无法测出LD50。在本实验过程中，小鼠灌胃LTF后，各个剂量组均未出现任何异常反应和死亡现象，且LD50>500mg/kg，初步表明LTF属于低毒级，有着较高的安全性。
本发明的粗壮女贞醇提物和/或粗壮女贞总黄酮可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的粗壮女贞醇提物和/或粗壮女贞总黄酮及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1％～99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的粗壮女贞醇提物和/或粗壮女贞总黄酮。
“可药用载体”不会破坏本发明的粗壮女贞醇提物和/或粗壮女贞总黄酮的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的粗壮女贞醇提物和/或粗壮女贞总黄酮以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。
本发明的粗壮女贞醇提物和/或粗壮女贞总黄酮以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、***等。
附图说明
图1为本发明技术路线图；
图2为总黄酮部位浸膏的洗脱得率示意图；
图3为等体积洗脱液中总黄酮的浓度示意图；
图4为急性毒性预试验小鼠体重的变化趋势示意图；
图5为酒精对小鼠脏器的影响示意图；
图6为酒精对小鼠体重的变化趋势示意图；
图7为酒精对小鼠脏器的影响示意图；
图8为急性酒精性肝损伤小鼠肝脏病理切片示意图；
图9为急性酒精性肝损伤小鼠体重的变化趋势示意图；
图10为血清中ALT的测定结果示意图；
图11为血清中AST的测定结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1材料
(1)药材与试剂：粗壮女贞叶(采自贵州遵义凤岗县，经鉴定，原植物为木犀科女贞属粗壮女贞(Ligustrum robustum(Roxb.)Blume)，Co60辐照实验鼠维持饲料(江苏协同医药生物工程有限责任公司)，水飞蓟宾(批号：850610070，天津天士力制药股份有限公司)，谷丙转氨酶和谷草转氨酶试剂盒(批号：20191227，南京建成生物工程研究所)，羧甲基纤维素钠(批号：20130821，规格：500g)，95％乙醇(分析纯)。
(2)动物：SPF级8周龄C57/BL6J雄性小鼠88只，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[许可证号：SCXK(京)2019～0010]，动物放置在室温20±2℃，相对湿度50％～70％，12h光照、黑暗交替的环境中饲养，期间自由饮水、饮食。
(3)仪器：千分之一电子分析天平(美国赛多利斯)，万分之一电子分析天平(美国赛多利斯)，H-1600RW微型高速台式冷冻离心机(上海珂淮仪器有限公司)，ThermoMultiskan GO全波长酶标仪(美国赛默飞)。
2 方法与步骤
2.1 粗壮女贞总黄酮的提取
称取粗壮女贞原药材1.5kg，采用热回流法提取法，以80％乙醇作为溶剂，浸泡7小时后，热回流提取2次，每次3h，第1次加入20倍80％乙醇，第2次加入12倍80％乙醇，合并提取液并过滤、浓缩、烘干，即得粗壮女贞醇提物，-20℃冷冻保存，备用。计算粗壮女贞醇提物得率，得率计算公式如下：
2.1.1溶液的配制
(1)样品溶液的配制：取粗壮女贞醇提物约25mg，精密称定，甲醇溶解并定容至50ml，即得醇提物样品溶液。取大孔树脂洗脱的总黄酮部位约0.02g，精密称定，用甲醇溶解并定容至10ml，精密吸取1.0ml至10ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，即得总黄酮样品溶液。
(2)对照品溶液的配制：称取芦丁标准品约0.025g，精密称定，甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，即得0.504mg/ml的芦丁对照品溶液。
2.1.2总黄酮部位的质量
浸膏得率和总黄酮得率是大孔树脂分离效能的两个重要指标。合并大孔树脂柱洗脱液减压回收乙醇并浓缩至干，称重后计算浸膏得率。浸膏得率的计算公式为：
总黄酮得率的计算公式为：
2.1.3黄酮的纸色谱鉴别
纸色谱显色法检测大孔树脂柱层析洗脱液中的总黄酮。具体操作为：用玻璃棒蘸取洗脱液点样于干燥滤纸上，喷5％硝酸铝-乙醇显色剂，加热30s。在可见光下应显灰黄色，在紫外光下应显黄色荧光斑点。
2.1.4含量测定
精密量取适量溶液置于10ml容量瓶中，加蒸馏水至2.0ml，加5％亚硝酸钠溶液0.4ml，放置10min；然后加入10％硝酸铝溶液0.4ml，放置6min；加入5％氢氧化钠溶液4.0ml，蒸馏水定容，摇匀，放置15min，在最大吸收波长处测定吸光度值。以蒸馏水为空白，用外标曲线法计算含量。
2.1.5标准曲线的绘制
分别精密量取芦丁标准品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，加水至2.0ml，按“1.2.5”下方法显色，检测波长为517nm，测定吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.2粗壮女贞总黄酮的分离纯化
2.2.1AB-8型大孔树脂吸附性能的考察
通过静态吸附试验和动态吸附实验分析AB-8型大孔树脂对粗壮女贞总黄酮的吸附性能。静态吸附试验是考察大孔树脂吸附样品前后，溶液中总黄酮含量的差异；动态吸附实验是将树脂进行湿法装柱，然后上样，待树脂充分吸附后，用蒸馏水洗脱至无色，考察吸附前后上样液中总黄酮含量的差异。
(1)树脂预处理：AB-8型大孔树脂用95％乙醇浸泡24h后湿法装柱，95％乙醇洗脱至流出液与蒸馏水以1∶5的比例混合不浑浊，用蒸馏水洗至无醇味。湿态下密封贮存，备用。
(2)柱体积测量：湿法装柱。待充分静置后，放干柱中液体，取已知体积的蒸馏水缓慢注入层析柱中，并轻轻敲击层析柱排除气泡，直至液面与树脂界面相平。柱体积(BV)计算公式如下：
柱体积BV(ml)＝已知蒸馏水体积(V1)-剩余蒸馏水体积(V2)
(3)静态吸附试验：量取已预处理的AB-8型大孔树脂各5ml置于具塞锥形瓶中，精密加入浓度为168mg/ml的粗壮女贞醇提物溶液50.0ml，密封后置于摇床中，在室温下以60r/min振摇24h后，取上清液适量，按“2.1.4”项下方法测定上清液中总黄酮的含量，从而计算树脂的静态饱和吸附量。静态饱和吸附量的计算公式为：
采用过滤法分离树脂和吸附后的溶液，大孔树脂用滤纸吸干后，置于具塞锥形瓶，加100ml 70％乙醇溶液，以60r/min振摇解吸24h，取上清液适量，按“2.1.4”项下方法测定上清液中总黄酮的含量，从而计算解吸液中总黄酮的浓度及静态解吸率。静态解吸率的计算公式为：
(4)动态吸附试验：准确量取AB-8型大孔树脂250ml进行湿法装柱，用168mg/ml的粗壮女贞醇提取溶液按照2BV/h(BV为柱体积)的流速上样，并对流出液进行收集，共收集10份，每份体积为1BV。以流出液体积(横坐标)和总黄酮浓度(纵坐标)作大孔树脂吸附总黄酮的动态吸附曲线。
2.2.2分离参数的优化
分离参数优化考察了分离过程中影响最大的两个因素，包括动态吸附条件的优化和解吸条件的优化。
(1)样品溶液浓度的影响：分别称取粗壮女贞醇提物适量，分别加蒸馏水配制成浓度为56、112、168、224、280mg/ml共5个不同浓度的溶液。粗壮女贞醇提物溶液各10ml。精密吸取1.0ml溶液于已知重量的干燥离心管中，精密称重，计算溶液密度。
(2)洗脱液乙醇浓度梯度选择：取预处理过的大孔树脂955ml进行湿法装柱，样品溶液为168mg/ml。上样后静置1h使树脂充分吸附，用8BV(柱体积)的蒸馏水以2.5BV/h的流速冲洗大孔树脂，再分别以浓度为10％、30％、40％、50％、60％、70％、90％的乙醇溶液各8BV依序洗脱，分别收集不同浓度下的洗脱液，按“2.1.4”项下方法测定洗脱液中总黄酮的浓度以及浸膏得率，从而对洗脱液最佳的乙醇浓度梯度进行选择。
(3)洗脱液用量的选择：依据以上实验结果，对洗脱液用量进行考察。取预处理过的大孔树脂250ml进行湿法装柱，平衡层析柱后上样56.5ml，醇提取上样浓度为168mg/ml。待样液被树脂吸附后静置1h使吸收充分。用8BV蒸馏水以2.5BV/h的流速冲洗大孔树脂，按照洗脱液最佳的乙醇浓度梯度进行洗脱。按1BV分步收集洗脱液，直至洗脱液按没有检出总黄酮。
2.2.3分离条件验证
取经预处理的大孔树脂2800ml，按照静态吸附实验测得的最大吸附量的一半进行上样，根据优化的条件对粗壮女贞总黄酮进行分离纯化，计算总黄酮部位的浸膏得率、总黄酮得率。
2.3动物实验
2.3.1技术路线图如图1所示。
2.3.2药液的制备
精密称定LTF 1.257g，加适量0.5％CMC-Na水溶液分散后，定容至10.0mL，即得125.7mg/mL的LTF溶液a。LTF溶液a进行梯度稀释，配制成浓度分别为12.57mg/mL、1.257、0.1257mg/mL的高、中、低药液，配制好的药液于4℃保存。
精密称定LTF 10.02g置于100mL容量瓶中，加入0.5％CMC-Na水溶液定容至刻度，混匀，即得浓度为100.2mg/mL的LTF溶液b；分别精密量取LTF药液b 50.0mL、25.0mL、12.5mL，0.5％CMC-Na水溶液定容至100mL，混匀，即得LTF高、中、低浓度分别为50.10mg/mL、25.05mg/mL、12.5mg/mL的药液，并置于4℃冰箱中保存。
取水飞蓟宾胶囊内容物研细，精密称取细粉适量，加0.5％CMC-Na水溶液分散为0.2mg/mL水飞蓟宾阳性对照药液。
2.3.3给药剂量的预试验
10只C57/BL6J雄性小鼠按体重随机分为正常组和4个不同剂量给药组(5、50、500、5000mg/kg)，每组2只。适应性喂养7d后，每次给药前禁食1h，各给药组按相应药液剂量进行灌胃，正常组给予等量的蒸馏水，均分两次进行，间隔4h。每次给药30min后，对小鼠的皮毛、食欲和行为状态进行观察1次，之后每小时观察1次，观察24h，连续1周。
2.3.4急性酒精性肝损伤模型的建立
将C57/BL6J雄性小鼠按体重随机分为正常组和模型组，每组10～15只。适应性喂养7d后，每日上午，除正常组外，其余各组均给予53％乙醇(10mL/kg)，正常组给予等量蒸馏水，连续1周。
2.3.5粗壮女贞总黄酮的药效学实验
将53只C57/BL6J雄性小鼠按体重随机分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性对照组(30mg/kg)、LTF高、中、低剂量组(800、400、200mg/kg)，共7组，每组6～8只。适应性喂养7d后，每日上午，正常组和模型组均按0.2mL/10g给予蒸馏水，阴性对照组按同等剂量给予0.5％CMC-Na水溶液，各给药组按同等药液剂量进行灌胃，同日下午，除正常组外，其余各组均给予53％乙醇(10mL/kg)进行灌胃，正常组给予等量蒸馏水，每次给药30min后，对小鼠的皮毛、食欲和行为状态进行观察1次，之后每小时观察1次，观察24h，连续灌胃2周。
末次给药后，小鼠禁食不禁水16h，称重(Wt)，小鼠经眼眶取血，血液在4℃静置30min，4500转于4℃离心15min，分离血清，按照试剂盒说明书测血清中AST、ALT的含量。
随后采用颈椎脱臼法处死小鼠，待小鼠死亡后，观察小鼠胃、肠和肝脏的变化。分离小鼠肝脏并称重，计算肝脏指数。肝脏指数公式为：
根据改良Karber法计算半数致死量(LD50)，公式如下：
式中，Xm为最高剂量对数；i为相邻2组对数剂量之差值(即组距)；pm为最高死亡率；pn为最低死亡率；p为各剂量组的死亡率(死亡率均用小数表示)。
2.4统计学分析
采用IBM SPSS 25.0统计软件分析，数据结果均以平均值±标准差(SD)表示，不同组小鼠的组间差异用单因素方差检验(ANOVA)、t检验(t-test)等统计学方法进行比较分析，以验证粗壮女贞总黄酮的药理作用。
3 结果
3.1 粗壮女贞总黄酮的提取
称取粗壮女贞原药材1.5kg，用80％乙醇浸泡7h后，在70-80℃下热回流提取两次，每次3h，第一次料液比为1∶20，第二次为1∶12。合并提取液并滤过，滤液经浓缩、干燥，即得粗壮女贞醇提物。粗壮女贞醇提物842.5g，得率为56.17％。按“2.1.5”项下标准曲线方法测定总黄酮含量。线性回归方程为y＝0.0148x-0.008，r＝0.9992，表明芦丁在20.46～100.80μg/ml范围内呈现良好的线性关系。测得粗壮女贞醇提物中总黄酮百分含量为19.9％。
3.2粗壮女贞总黄酮的分离
粗壮女贞总黄酮的分离纯化条件为：取AB-8型大孔树脂2800ml，粗壮女贞乙醇提取物上样浓度为168mg/ml，水、10％乙醇、50％乙醇依序洗脱，每个梯度8倍柱体积，收集50％乙醇部位进行浓缩干燥，得粗壮女贞总黄酮部位(LTF)。浸膏得率为53.4％，黄酮含量为44.5％。
3.2.1吸附实验的结果
大孔树脂对粗壮女贞总黄酮的静态吸附量与解吸率试验的结果分别见表1、表2。测得AB-8型大孔树脂静态饱和吸附量为162.89mg/g、静态解析率为36.08％。静态吸附量和解析率实验的结果表明，AB-8型大孔树脂对粗壮女贞总黄酮的吸附及解析效果较好。
表1：AB-8型大孔树脂静态饱和吸附量测定结果
表2：AB-8型大孔树脂静态解吸率测定结果
3.2.2分离条件优化的结果
在上样浓度的选择中，设置了5个不同的上样浓度，测定上样溶液的密度(表3)。随着溶液浓度的增加，溶液的密度也增加，280mg/ml醇提取溶液的密度最大，168mg/ml和224mg/ml醇提物溶液的密度近似，但280mg/ml醇提物溶液的不溶物最多，故不选；168mg/ml和224mg/ml醇提物溶液的密度和不溶物情况近似，因此选择168mg/ml醇提物溶液作为上样浓度。
表3：样品溶液的浓度选择
注：“+”，少；“++”，较少；“+++”，一般；“+++++”，多。
动态解析附条件的优化中，亦采用单因素的方法，收集不同乙醇浓度下的洗脱液，测定吸光度，以洗脱液中总黄酮浓度为纵坐标，乙醇浓度为横坐标作图，如图3所示。由此可以看出，当洗脱剂乙醇的浓度为30％时，洗脱液中的黄酮浓度最高94.51mg/ml，当洗脱剂乙醇的浓度超过50％时，洗脱液中粗壮女贞总黄酮浓度开始下降，乙醇浓度为70％时的总黄酮浓度较低；对不同乙醇浓度下的洗脱液分别进行浓缩、干燥、称重，得到不同乙醇浓度下的总黄酮部位浸膏，以总黄酮部位浸膏质量为纵坐标，乙醇浓度为横坐标作图，如图2所示，当洗脱剂乙醇的浓度为50％时，总黄酮部位浸膏最多，乙醇浓度为70％时则较低，乙醇浓度为60％时浸膏累计百分比超过91.2％。所以综合考虑选择60％乙醇为最佳洗脱剂浓度最为合适。
3.2.3验证实验
综合上述实验结果，优化的AB-8型大孔树脂分离粗壮女贞总黄酮的条件为：取AB-8型大孔树脂2800ml，粗壮女贞乙醇提取物上样浓度为168mg/ml，静置吸附后，用水、10％、50％的乙醇依序洗脱，每个梯度8BV，收集50％乙醇部位进行浓缩干燥，得粗壮女贞总黄酮部位。浸膏得率为53.4％，黄酮含量为44.5％(见表4)。鉴别得在可见光下显灰黄色，在紫外光下显黄色荧光斑点。
表4：验证实验结果
3.2粗壮女贞总黄酮对急性酒精性肝损伤的药效活性
3.2.1给药剂量范围考察结果
研究表明，粗壮女贞的每日剂量为10～15g，按照LTF分离纯化的得率，换算成LTF的使用量为1.3～2.0g，按成年人体重60kg计，小鼠的给药剂量为303.7mg/kg。为探讨LTF的安全性和最大给药剂量，对LTF的剂量范围进行考察。
根据2.3.3项下方法，小鼠在给予不同剂量的粗壮女贞总黄酮后，身体状况良好、饮食正常、活动自如，毛发有光泽，未出现小鼠死亡现象(存活率＝小鼠存活数/小鼠总数×100％)。表明粗壮女贞总黄酮在5～5000mg/kg的剂量范围内，具有一定的安全性(见表5)。
表5：急性毒性预试验小鼠存活率
在给药剂量考察中，各组小鼠体重变化趋势不显著(见图4)。表明不同剂量的LTF对小鼠体重变化的影响属于正常范围。
对LTF各剂量组小鼠的肝脏形态进行观察，小鼠肝脏均呈红褐色，表面光滑润泽，没有炎症发生(见图5)。表明LTF不会对小鼠的肝脏产生不良影响。
3.3急性酒精性肝损伤模型观察
相较于正常组，模型组小鼠用52％酒精(10mL/kg)灌胃后均出现醉酒状态，轻者动作迟缓、步履蹒跚，严重者醉倒嗜睡、呼吸缓慢、摄食量减少、毛发无光泽，甚至还发出“叽叽”的叫声。一周后，模型组小鼠的存活率为20.0％，正常组存活率为100.0％(见表6)。
表6：急性酒精肝损伤小鼠存活率
在建立急性酒精性肝损伤模型的实验过程中，与初始体重相比，模型组小鼠体重较正常组小鼠体重变化更为明显，呈大幅下降趋势(见图6)。
在酒精造模过程中，对已死亡的小鼠剖检，肉眼可观察到大多数小鼠的肠、胃出现极为严重胀气、肠内有少量黄色粘液、胃内无内容物的现象(见图7)。表明，小鼠出现急性酒精中毒现象，并且脏器受到损害。
3.4总黄酮的药效学实验
在药效学实验中，正常组所有小鼠状况、饮食、活动、摄食量均正常，毛发有光泽。其余各组小鼠酒精灌胃后，均出现醉酒状态，轻者动作迟缓、行走不稳，严重者醉倒嗜睡、呼吸缓慢、摄食量减少、毛发无光泽。
除正常组全部存活外，其余各组由于酒精刺激导致肠、胃胀气，对酒精不耐受及酒精性肝损伤中毒相关并发症等的原因，共死亡12只，正常组存活率为100％，其余各组存活率(见表7)。结果表明，LTF能显著降低小鼠的死亡率。根据改良Karber氏法计算，LD50为817.5mg/kg，大于500mg/kg，所以LTF属于低毒级。
表7：药效学实验小鼠存活率
小鼠肝脏病理切片的结果显示(见图8)，正常小鼠肝细胞结构完整、大小相近，以小叶中央静脉为中心，胞核大而呈圆形或椭圆形，胞浆染色均匀，未见肝脏病变。模型组小鼠和阴性对照组小鼠肝小叶界限不清，肝细胞索紊乱，肝窦变窄，肝细胞明显肿胀，部分区域出现气球样变和炎细胞浸润，由此可见酒精对肝脏有明显损伤。阳性对照组、LTF不同剂量组与模型组相比，特别是高剂量组(800mg/mL)，肝细胞肿胀明显减轻，细胞核进一步正常化，小鼠肝组织得到了一定的修复。同时比较各组小鼠实验前后的体重变化，发现各组小鼠的体重均较正常组小鼠呈下降趋势(见图9)。正常组小鼠体重变化较为平稳，模型组小鼠体重持续下降(4±1g)，其余各组小鼠体重变化趋势相同，并且符合小鼠生长发育规律。
与正常组相比，模型组小鼠的肝脏指数显著增加(P<0.01)，而LTF各剂量组均无显著性变化(见表8)。结果表明，LTF对给予酒精的小鼠肝脏的病变具有一定的缓解作用。
表8：粗壮女贞总黄酮对小鼠肝脏指数的影响
注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。
小鼠血清中ALT、AST水平测定结果显示，模型组、阴性对照组和阳性对照组的ALT水平均高于正常组，而LTF各剂量组的ALT水平则显著低于正常组(p<0.05)(见图10)。阳性对照组、LTF中剂量组的AST水平与正常组相当，其余各组略高于正常组(见图11)。结果表明，小鼠肝损伤模型初步形成。
模型组及阴性对照组小鼠的ALT、AST水平均高于正常组。与正常组相比，阴性对照组的ALT显著增加(P<0.01)；与模型组相比，LTF高、中及低剂量组的ALT水平均有统计学差异(P<0.05)，AST水平差异不显著(见表9)。结果表明，LTF能有效预防急性酒精性肝损伤的形成，并防止肝损伤的进一步发展。
表9：小鼠血清中AST、ALT的测定
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
实验结果表明，LTF对急性酒精性肝损伤小鼠有着较高的安全性和一定的药效作用，对小鼠的外观、行为状态以及脏器等未见不良影响。LTF可有效改善酒精对小鼠胃肠道、神经方面的刺激，对预防急性酒精性肝损伤小鼠具有一定的药效作用。