阅读说明：本技术 一种抗糖尿病肾病的女贞子提取物及制备方法和应用 (Glossy privet fruit extract for resisting diabetic nephropathy and preparation method and application thereof ) 是由 张学兰 栾茹乔 李慧芬 吴鹏 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗糖尿病肾病的女贞子提取物,通过向女贞子中加入黄酒和/或水,隔水蒸制10～30h,取出女贞子,50～80℃干燥3～8h,粉碎成粗粉,加入粗粉30～80wt%的乙醇超声提取2～3次,每次0.5～2h,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得浸膏,浸膏加水分散,上AB-8型大孔树脂,依次用5BV水洗脱和5BV体积浓度50%的乙醇溶液以2BV/h流速洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,冷冻干燥得女贞子提取物。本发明女贞子活性成分转化后,提升了女贞子的利用价值,活性强,可开发成为治疗DN药物或保健食品,制成各种剂型,方便临床应用。且提取的复合成分效果要好于红景天苷,避免了传统提取红景天苷提取程序复杂,解决了红景天苷治疗效果有限的问题。(The invention discloses a glossy privet fruit extract for resisting diabetes and nephropathy, which is prepared by adding yellow wine and/or water into glossy privet fruit, steaming for 10-30 hours in a water-proof manner, taking out the glossy privet fruit, drying for 3-8 hours at 50-80 ℃, crushing into coarse powder, adding 30-80 wt% of ethanol into the coarse powder, performing ultrasonic extraction for 2-3 times, each time for 0.5-2 hours, combining filtrates, recovering ethanol under reduced pressure until no alcohol smell exists, obtaining extract, adding water into the extract for dispersing, adding AB-8 type macroporous resin, sequentially eluting with 5BV water and 5BV ethanol solution with volume concentration of 50% at the flow rate of 2BV/h, collecting ethanol eluent, recovering ethanol, and performing freeze drying to obtain the glossy privet fruit extract. After the active ingredients of the glossy privet fruit are converted, the utilization value of the glossy privet fruit is improved, the glossy privet fruit has strong activity, and the glossy privet fruit can be developed into medicaments for treating DN or health-care food to be prepared into various formulations, thereby being convenient for clinical application. The effect of the extracted composite components is better than that of salidroside, so that the complex extraction procedure of the traditional extraction of salidroside is avoided, and the problem of limited curative effect of salidroside is solved.)

一种抗糖尿病肾病的女贞子提取物及制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药有效成分提取领域，具体涉及一种抗糖尿病肾病的女贞子提取物及制备方法和应用。

背景技术

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是常见的糖尿病微血管并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。近年来，DN发病率呈不断上升趋势，但目前仍无治疗DN的有效药物。中药含有多种有效成分，可通过多途径、多靶点产生综合治疗效果，对防治慢性代谢性疾病具有明显的优势和特色。对治疗DN药效确切的中药进行深入研究，有助于更好地开发治疗DN新药。

女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait. 的干燥成熟果实，其味甘、苦，性凉，具有滋补肝肾、明目乌发的功能，是临床常用的滋补肝肾中药。在中医传统用药中，该药用于治疗内热消渴，现常用于糖尿病及其并发症，是治疗DN的核心药物。历代对女子的炮制方法主要有蒸、酒蒸、酒拌九蒸九晒等，现在主要采用酒蒸和酒炖法炮制。《中国药典》2015版收载有女贞子和酒女贞子两种炮制规格。长期的临床实践证明，女贞子经酒制后可缓和其凉滑之性，增强滋补肝肾作用，故女贞子历代临床主以酒制品入药。女贞子主要含有的有效成分为环烯醚萜苷类、三萜类、苯乙醇。从女贞子中分离到的环烯醚萜苷类化合物主要有特女贞苷（specneuzhenide）、女贞苷G13（G13）、oleonuezhenide、女贞酸（nuezhenidic acid），新女贞苷（neonuezhenide）等，三萜类成分主要包括齐墩果酸（oleanolic acid）、熊果酸（ursolic acid）等，苯乙醇类成分主要有红景天苷（salidroside）、羟基酪醇（hydroxytyrosol）、酪醇（tyrosol）、毛蕊花糖苷（acteoside）、松果菊苷（echinacoside）等。女贞还是常见的绿化树、行道树，每年秋天大量成熟的女贞子落在地上，把地面染黑，造成环境污染和资源浪费。

红景天苷是景天科植物红景天的主要活性成分之一。根据文献报道，红景天苷具有抗氧化功能，可以减少细胞产生ROS，清除自由基，提高抗氧化酶如CAT、SOD活性。研究证实，红景天苷能够抑制高糖诱导的系膜细胞增殖，对于肾脏的缺血再灌注损伤和慢性肾脏病也可起到保护作用。已经有研究表明，红景天具有治疗或抑制DN的作用。红景天植物生长于高原地区，资源贫乏，且价格昂贵，作为其替代品，中药女贞子含有多种活性成分，其中就包含红景天苷，但也存在以下问题：天然女贞子中红景天苷含量有限，且女贞子中活性成分种类多，分离得到红景天苷步骤复杂。

目前，尚未见以女贞子为原料提取分离得到具有抗DN的提取物的报道。为了充分利用女贞药材的资源，减少资源的浪费和环境污染，很有必要对女贞子的活性成分及药理作用进行深入的研究，进而扩大女贞子的药用途径，为女贞子的临床应用提供指导。

发明内容

针对现有技术中存在的女贞子资源浪费、红景天价格昂贵的问题，本发明提供了一种抗DN的女贞子提取物及制备方法和应用，女贞子通过炮制，其中的有效成分发生转化，红景天苷含量显著增多，且通过和其它转化成分共同作用，增强其抗DN效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种抗糖尿病肾病的女贞子提取物，通过以下方法制备得到：

（1）向女贞子中加入黄酒和/或水，隔水蒸制10～30h，取出女贞子，50～80℃干燥3～8h，粉碎成粗粉；

（2）步骤（1）中的粗粉加粗粉量30～80wt%的乙醇超声提取2～3次，每次0.5～2h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得浸膏；

（3）浸膏加水分散，上AB-8型大孔树脂，依次用5BV水洗脱和5BV体积浓度50%的乙醇溶液以2BV/h流速洗脱，收集醇洗脱液，减压回收乙醇，冷冻干燥得女贞子提取物。

进一步地，步骤（1）中所述的女贞子为干燥的女贞子饮片，每100g女贞子饮片加入10～30g黄酒、50～100g水。

进一步地，步骤（1）中所述的女贞子放入不锈钢材质的容器中隔水蒸制，蒸制温度为80～100℃。

进一步地，步骤（1）所述的干燥采用热风循环干燥箱干燥。

进一步地，步骤（2）中所述的乙醇提取液为50%乙醇溶液。

本发明中，所述的抗糖尿病肾病的女贞子提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）向女贞子中加入黄酒和/或水，隔水蒸制10～30h，取出女贞子，50～80℃干燥3～8h，粉碎成粗粉；

（2）步骤（1）中的粗粉加粗粉量30～80%的乙醇超声提取2～3次，每次0.5～2h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得浸膏；

（3）浸膏加水分散，上AB-8型大孔树脂，依次用5BV水洗脱和5BV体积浓度50%的乙醇溶液以2BV/h流速洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，冷冻干燥得女贞子提取物。

本发明中，所述的抗糖尿病肾病的女贞子提取物的应用，用于制备抗糖尿病肾病药物或保健品；本发明充分利用女贞子药材资源，通过对女贞子活性成分进行研究，制备得到活性成分含量高的具有较强抗DN活性的女贞子提取物，对DN大鼠具有保护作用，不良反应少，有望开发成新的抗DN药物和保健品。

进一步地，所述的抗糖尿病肾病药物或保健品为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂剂型。

有益效果

（1）本发明主要以女贞子为原料，活性成分转化后，提取其活性部位，提升了女贞子的可利用价值，实现了女贞子资源的综合利用，开发出女贞子抗DN的精制活性部位，活性强，可开发成为新的治疗DN药物或保健食品，且方便的和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，方便临床应用。

（2）本发明通过对女贞子化学成分和药理活性研究筛选，表明本发明得到的女贞子提取物活性成分含量高达50%以上；可显著降低DN大鼠的血糖、尿蛋白、血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN），并可调整DN大鼠血脂紊乱，改善肾小球萎缩、硬化，减轻肾小管上皮细胞脂肪变和炎细胞浸润；且提取的复合成分的效果要好于单独的红景天苷，进一步证明了复合成分的协同作用。

（3）本发明在充分利用女贞子中药资源基础上，不仅避免了传统提取红景天苷提取程序复杂的问题，而且解决了红景天苷治疗效果有限的问题，提取的复合活性成分对DN的治疗效果更好。

附图说明

图1为实施例1女贞子提取物的高效液相色谱图；

图2为对比例1女贞子提取物高效液相色谱图，1.羟基酪醇 2.红景天苷 3.酪醇 4.松果菊苷 5.新女贞苷 6.毛蕊花糖苷 7.特女贞苷 8.女贞酸 9.女贞苷G13 10.oleonuezhenide；

图3为各组大鼠肾组织形态图（×200）。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是进一步说明本发明的特征及优点，而不是对本发明进行限制。

实施例1

具有抗DN作用的女贞子提取物，通过以下方法制备得到：

（1） 取干燥女贞子饮片100g，加入20g黄酒、80g水，于不锈钢容器内搅拌均匀，密闭，置于蒸锅内，隔水蒸制，蒸制温度为100℃，蒸制24h，取出女贞子，于热风循环干燥箱内，80℃干燥5h，干燥后粉碎成粗粉；

（2） 步骤（1）中的粗粉加粗粉量50%的乙醇（50vt %）超声提取3次，每次 1h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得浸膏；

（3） 步骤（2）中的浸膏以水分散，上AB-8型大孔树脂，依次用5BV水洗脱和5BV体积浓度50%的乙醇溶液以2BV/h流速洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，冷冻干燥，即得女贞子提取物，得到的女贞子提取物在280nm和240nm下的高效液相色谱图如图1所示。

通过高效液相色谱法对女贞子提取物中红景天苷、羟基酪醇、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、特女贞苷、女贞苷G13、女贞酸的重量百分含量进行测定，测得女贞子提取物中含有30.0%红景天苷、1.0%羟基酪醇、2.6%酪醇、1.5%松果菊苷、1.0%毛蕊花糖苷、11.2%特女贞苷、4.0%女贞酸、1.7%女贞苷G13，其它成分oleonuezhenide、新女贞苷含量均低于1.0%，可控成分含量已达到53.0%。研究显示，女贞子提取物中主要含有红景天苷和特女贞苷，且红景天苷含量显著高于特女贞苷含量。

对比例1

（1）取干燥女贞子饮片100g，粉碎成粗粉，加50%乙醇超声提取3次，每次 1h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得浸膏；

（2）浸膏以水分散，上AB-8型大孔树脂，依次用5BV水洗脱和5BV体积浓度50%的乙醇溶液以2BV/h流速洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，冷冻干燥，即得生女贞子提取物得到的生女贞子提取物在280nm和240nm下的高效液相色谱图如图2所示。

采用高效液相色谱法对比例1制得的生女贞子提取物中红景天苷、松果菊苷、特女贞苷、新女贞苷的重量百分含量进行测定，测得生女贞子提取物中含有1.0%红景天苷、1.1%松果菊苷、28.6%特女贞苷、29.8%女贞苷G13、10.3% oleonuezhenide和8.3%的新女贞苷，其它成分羟基酪醇、酪醇、毛蕊花糖苷、女贞酸的各自含量均低于1.0%。研究显示，生女贞子提取物中主要含有环烯醚萜苷类成分，其中，特女贞苷、女贞苷G13、oleonuezhenide、新女贞苷总量达到77.0%。

女贞子提取物对DN大鼠保护作用研究

1.实验方法

取SD大鼠70只，适应性喂养1周，将SD大鼠按体重随机选取10只为正常组，剩余60大鼠为造模组。正常组喂以普通饲料4周，造模组动物分喂以高糖高脂饲料（配方：脂肪18%、蔗糖20%、胆固醇3%和基本饮食59%）4周，于第4周末禁食12h（不禁水），造模组大鼠给予链脲佐菌素 35mg/kg（临用前用0.1mol/L、PH4.5枸橼酸钠缓冲液溶解配制成1%链脲佐菌素溶液）连续2天腹腔注射，正常组大鼠腹腔注射同体积枸橼酸钠缓冲液，72h后尾静脉取血测定大鼠空腹血糖（测前禁食10h）。以血糖值大于11.1mmol/L的大鼠看作高血糖模型成功建立。取造模成功的大鼠40只，随机分成4组，即模型组、实施例1女贞子提取物组、对比例1女贞子提取物组、红景天苷组，每组10只。实施例1女贞子提取物组给予实施例1制备得到的女贞子提取物 300mg/kg（灌胃给药）与正常饲料，对比例1女贞子提取物组给予对比例1制备得到的女贞子提取物330 mg/kg（得膏率不同，相当于实施例1制备得到的女贞子提取物 300mg/kg，灌胃给药）与正常饲料，红景天苷组给予红景天苷90mg/kg（灌胃给药）与正常饲料，模型组给予正常饲料。连续给药8周。实验期间观察大鼠的一般状况、体重、饮水量、摄食量、尿量变化。8周末，检测各组大鼠空腹血糖；将各组大鼠放在大鼠代谢笼中，收集24h的尿液，测定24h尿蛋白含量。末次给药当天晚上禁食，第2天腹主动脉取血，检测血清SCr、BUN、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。大鼠取血后，分离肾脏，称重，计算肾脏指数，肾脏指数=双肾重量（g）/大鼠体重（g）×1000。取部分肾脏用10%中性福尔马林固定，进行HE染色，观察肾组织形态和病理变化。

2.实验结果

（1）大鼠一般情况观察

（2）实验期间，正常组大鼠生长良好，活泼好动，毛色白而有光泽，饮食量、饮水量及尿液量正常；模型组大鼠精神萎靡，活动迟缓，毛色发黄，粗糙无光泽，摄食量、饮水量和尿量明显增加，体重明显下降，“三多一少”症状明显，且大鼠尿液酸臭气味明显，实验后期逐渐出现多种糖尿病并发症，如颈部包块、嘴角出现反复发作性溃疡，牙周脓肿出血、牙齿松动脱落及糖尿病眼底病变等。随着后期灌胃给药，给药组（实施例1女贞子提取物组、对比例1女贞子提取物组和红景天苷组）大鼠体征变化均有不同程度的好转，体重有所增加，其精神状态、毛色也有改善，随着后期灌胃给药，以实施例1女贞子提取物组效果最为显著。对DN大鼠血糖、24h尿蛋白和肾脏指数的影响结果见表1。血糖、血脂是判断肾实质损害的重要指标，当肾脏受到损伤时，肾脏结构与功能发生变化，其中血糖、血脂的变化会直观的体现出肾脏的损伤。研究表明，与正常组大鼠相比，模型组大鼠血糖水平显著升高（P<0.01），说明造模成功。与模型组相比，实施例1女贞子提取物组大鼠血糖水平显著下降（P<0.01），红景天苷组大鼠血糖也显著降低（P<0.05），实施例1女贞子提取物组大鼠血糖下降幅度大于红景天苷组，而对比例1女贞子提取物组大鼠血糖水平无显著性变化（P>0.05）。

与正常组相比，模型组大鼠24h尿蛋白定量升高，具有显著性差异（P<0.01）。与模型组相比，实施例1女贞子提取物组、对比例1女贞子提取物组和红景天苷组大鼠24h尿蛋白定量均有降低，且具有显著性差异（P<0.01或P<0.05），在各治疗组中以实施例1女贞子提取物组24h尿蛋白定量减轻最为明显。

与正常组比较，模型组大鼠肾脏指数明显升高，出现肾脏肥大现象（P<0.01）。与模型组相比，实施例1女贞子提取物组和红景天苷组大鼠肾脏指数显著降低（P<0.01或P<0.05），以实施例1女贞子提取物组效果更为明显，而对比例1组大鼠肾脏指数无明显降低，说明实施例1女贞子提取物对DN大鼠的脏器损伤具有一定的保护作用。

表1 对DN大鼠血糖、24h尿蛋白及肾脏指数的影响（ ±SD，n=10）

（3）对DN大鼠血清血肌酐SCr、尿素氮BUN的影响

结果见表2。结果显示，与正常组比较，模型组大鼠SCr和BUN值明显升高（P<0.01）。与模型组相比，实施例1女贞子提取物组、对比例1女贞子提取物组和红景天苷组均有降低SCr、BUN的趋势，以实施例1女贞子提取物组降低趋势更为明显，对DN大鼠肾功能保护作用最强。

表2 对DN大鼠血清SCr、BUN的影响（ ±SD，n=10）

（4）对大鼠血脂的影响

结果见表3。肾脏损害常伴随着高脂血症，DN早期首先以TG升高为主，后期TG、TC及LDL-C水平均显著升高，HDL-C水平显著下降。如表3所示，与正常组比，模型组大鼠血清中LDL-C、TC和TG水平明显升高，并具有显著性差异（P＜0.01），HDL-C水平明显降低，并具有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较，实施例1女贞子提取物组和红景天苷组大鼠LDL-C、TC、TG水平均明显降低（P＜0.01或P<0.05），HDL-C水平升高（P＜0.01）；对比例1女贞子提取物组大鼠TC、TG水平均明显降低（P<0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），LDL-C水平无明显差异，结果显示以实施例1女贞子提取物组调节血脂效果更为显著。

表3 女贞子提取物对糖尿病肾病大鼠血脂的影响（ ±SD）

（5）对大鼠肾组织形态和病理的影响

各组大鼠肾组织形态见图3。在光镜下观察，正常组大鼠肾小球结构正常并没有充血萎缩现象，肾小管上皮没有发生变性坏死，肾小管及间质结构清晰，肾间质没有出血与炎症。模型组大鼠肾小球出现钙化、萎缩，局部纤维化，炎细胞浸润，肾小管上皮部分变性，间质充血，表明模型组大鼠肾脏发生损伤，造模成功。实施例1女贞子提取物组大鼠基本恢复正常，肾脏无实质性损害。对比例1女贞子提取物组大鼠肾小球少部分萎缩，肾小管上皮基本正常，出现间质小灶性炎症。红景天苷组大鼠肾小球轻度充血，肾小管少部分出现空泡变性，肾小管上皮基本正常，与模型组相比，出现了一定程度的好转。结果显示与模型组相比，实施例1女贞子提取物组、对比例1女贞子提取物组和红景天苷组大鼠肾脏损害均出现了不同程度的好转，尤以实施例1女贞子提取物组最为明显。

通过对实验效果的分析我们可以得到以下结论：天然女贞子和炮制女贞子对DN大鼠均具有保护作用，炮制女贞子相比于天然女贞子效果更显著。对比炮制后的女贞子提取物组和红景天苷组，发现炮制后女贞子提取物组对DN大鼠的保护作用要明显好于红景天苷组，证明女贞子提取物中的其它成分对DN也起到一定的保护作用，进一步说明本专利女贞子提取物抗DN的有效成分为女贞子提取物中多种活性成分共同作用的效果；在女贞子应用于DN的治疗上，本专利有效成分转化及提取方法也被证明为最有效的方法。

本发明充分利用女贞子药材资源，通过对女贞子活性成分进行研究，制备得到活性成分含量高的具有较强抗DN活性的女贞子提取物，对DN大鼠具有保护作用，不良反应少，有望开发成新的抗DN药物和保健品。