阅读说明：本技术 基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物、其制备方法及应用 (Porphyrin derivative capable of detecting hyaluronidase based on self-assembly, preparation method and application thereof ) 是由 曾荣今 王胜兰 张崇华 张培盛 陈建 成奋民 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物、其制备方法及应用,该卟啉衍生物的制备方法通过以下步骤完成：卟啉母体先与二溴烷烃反应,所得产物再和三乙胺反应,得到一种卟啉衍生物。该卟啉衍生物与带负电荷的透明质酸链通过静电自组装的方法形成了一种新型的荧光纳米传感器。本发明的荧光纳米传感器能在水溶液中实现对透明质酸酶的高选择性检测,相比于现有的检测技术,本发明得到的荧光纳米传感器具有良好的生物相容性,制备方法简单,选择性高,发射波长位于近红外能有效扣除生物背景荧光,具有良好的工业发展前景,在分析化学、生命科学等技术领域有着巨大的应用前景。(The invention discloses a porphyrin derivative capable of detecting hyaluronidase based on self-assembly, a preparation method and application thereof, wherein the preparation method of the porphyrin derivative is completed by the following steps: the porphyrin parent is firstly reacted with dibromoalkane, and the obtained product is then reacted with triethylamine to obtain the porphyrin derivative. The porphyrin derivative and the hyaluronic acid chain with negative charges form a novel fluorescent nano sensor by a static self-assembly method. Compared with the existing detection technology, the fluorescence nano-sensor obtained by the invention has good biocompatibility, simple preparation method and high selectivity, can effectively subtract biological background fluorescence when the emission wavelength is in the near infrared region, has good industrial development prospect, and has huge application prospect in the technical fields of analytical chemistry, life science and the like.)

基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物、其制备方法 及应用

技术领域

本发明属于化学材料及分析检测领域，具体地说，本发明涉及可用于检测透明质酸酶的卟啉衍生物的制备方法及应用。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)含有多个重复的葡糖醛酸与N-乙酰葡糖胺二糖单元，呈负电荷分布，具有良好的水溶性,是构成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞间质(intercellularmatrix，ICM)的主要成分。透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)是HA的专一性水解酶，是一种内糖苷酶，可直接水解透明质酸的β-1,4糖苷键，最终生成的产物主要为四糖的代谢物，多年来其一直作为化疗的辅助药物来增强药物的渗透性。据报道，HAase与许多生理和病理过程有关，在膀胱癌、***癌、脑癌、直肠癌等恶性肿瘤中均有高表达。因此，HAase作为一种新型的肿瘤标志物，受到了广泛的关注，设计合成一种可检测HAase的传感器对早期癌症的临床诊断和治疗具有重要意义。

现有技术中HAase的检测方法主要包括:浊度法、粘度法、酶谱法、免疫分析法、比色法、化学发光辅助法和荧光传感法。其中，荧光传感法因其操作简单、损失小和灵敏度高等优点而得到广泛的应用。荧光传感法主要依赖于荧光传感器的标记来检测HAase，而传统的荧光传感器主要分为有机小分子荧光传感器和荧光纳米传感器，其中，有机小分子荧光传感器大多数水溶性差，在使用过程中需要利用大量有机溶剂作助溶剂，从而导致有机小分子荧光传感器毒性强、光稳定性差；而荧光纳米传感器虽然具有更好的水分散性、生物相容性以及更高的光稳定性，但却存在抗干扰能力差的缺点。现有技术中大多数的荧光传感器由于在紫外-可见光范围内具有吸收和发射，容易引起较高的生物背景荧光干扰，导致较低的信噪比。因此，研制能有效克服传统荧光传感法缺点的有机分子及相应的荧光传感器是具有相当重要的现实意义和应用前景。

发明内容

为解决现有技术中存在的以上不足，本发明旨在提供一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物及其制备方法，其中，卟啉衍生物作为荧光传感器的荧光发色团，用以解决生物背景荧光干扰问题；本发明还涉及一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物的应用，将该种卟啉衍生物与带负电荷的透明质酸链制备成荧光纳米传感器，以达到快速有效的识别透明质酸酶的目的。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物，所述卟啉衍生物的通式为：

其中，R1,R2,R3分别为H或O(CH₂)_n N(CH₂CH₃)₃ ⁺；所述O(CH₂)_n N(CH₂CH₃)₃ ⁺中的n=2~24。

一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物的制备方法，其制备方法为依次进行的以下步骤：

一、将SM1加入到干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，开始搅拌，再加入无水碳酸钾，室温搅拌，待搅拌混合均匀后，加入SM2，非活性气体保护下，回流搅拌24~48h，薄层层析法检测，反应完毕后，降温至室温，水洗除掉N,N-二甲基甲酰胺，所得固体物料通过柱层析提纯，得到SM3，其化学反应方程式为：

其中，其中，X₁，X₂，X₃分别为H或OH；在X₁=X₂=X₃=H时，A₁=A₂=A₃=H；在X₁=X₂=H，X₃=OH时，A₁=A₂=H，A₃=O（CH₂）_nBr；在X₁=H，X₂=X₃=OH时，A₁=H，A₂=A₃=O（CH₂）_nBr; 在X₁=X₂=X₃=OH时，A₁=A₂=A₃=O（CH₂）_nBr；所述O（CH₂）_nBr中的n=2~24；

二、将SM3加入到干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并加入过量的三乙胺，在非活性气体保护下，回流搅拌10~20h，薄层层析监测反应，反应完毕后冷却至室温，加入无水***搅拌至有固体析出，抽滤，得SM4，即为卟啉衍生物，其反应方程式为：

其中，A₁，A₂，A₃分别为H或O（CH₂）_nBr；在A₁=A₂=A₃=H时，R₁=R₂=R₃=H；在A₁=A₂=H，A₃= O（CH₂）_nBr时，R₁=R₂=H，R₃= O(CH₂)_n N(CH₂CH₃)₃ ⁺；在A₁=H，A₂=A₃=O（CH₂）_nBr时，R₁=H，R₂=R₃= O(CH₂)_n N(CH₂CH₃)₃ ⁺；在A₁=A₂=A₃= O（CH₂）_nBr时，R₁=R₂=R₃= O(CH₂)_n N(CH₂CH₃)₃ ⁺；所述O（CH₂）_nBr和 O(CH₂)_n N(CH₂CH₃)₃ ⁺中的n=2~24。

作为对本发明上述制备方法的限定，所述回流温度为110~140℃。

作为对本发明上述制备方法的进一步限定，所述SM1：SM2：无水碳酸钾的摩尔比为1:15~25:15~30。

作为本发明的再进一步限定，所述薄层层析液为石油醚和二氯甲烷的混合液，其中石油醚和二氯甲烷的体积比为1~10:1；所述柱层析洗脱剂为石油醚和二氯甲烷的混合液，其中石油醚和二氯甲烷的体积比为1~5:1。

作为对本发明上述制备方法的另一种限定，所述SM3与三乙胺的摩尔比为1:20~40。

本发明还提供了一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物的应用，将卟啉衍生物与透明质酸链混合制备可检测透明质酸酶的荧光纳米器。

作为本发明涉及卟啉衍生物的应用的一种限定，所述透明质酸链为

其中，m=100~1000。

作为本发明涉及卟啉衍生物的应用的另一种限定，所述卟啉衍生物与透明质酸链的质量比为2~6:1。

由于采用了上述的技术方案，本发明的卟啉衍生物以及相应的荧光传感器与现有技术相比，所取得的有益效果是：

（1）本发明以三乙基季铵盐将其功能化羟基卟啉母体，合成一种带正电荷的卟啉衍生物（Mito TPP）做为近红外荧光发色团，也使得传感器具有线粒体靶向；

（2）本发明是利用带正电荷的Mito TPP和带负电荷的透明质酸链进行自组装而成的一种荧光纳米传感器，透明质酸进一步增加了纳米传感器的生物相容性，减少荧光纳米传感器注入体内后所产生的不良反应；

（3）通过本发明提供的卟啉衍生物而制备的荧光纳米传感器相比于传统有机小分子荧光传感器，提高了传感器的水溶性，从而减少有机溶剂的使用，降低了传感器的毒性；

（4）本发明所涉及的卟啉衍生物的发射光谱在650nm附近，在对用于溶解在水中的透明质酸酶，相较于传统荧光纳米传感器有效地解决了生物背景荧光在检测过程中所产生的干扰问题。

综上所述，本发明提供了一种基于自组装的可检测透明质酸酶的卟啉衍生物、其制备方法及应用。其中，该卟啉衍生物的合成路线简单，全程易于操作，步骤简短，成本投入低；所制得的荧光纳米传感器具有优良的水溶性和生物相容性，并且生物背景荧光弱，细胞毒性低，可直接对透明质酸酶实现特异性识别。

本发明适用于检测透明质酸酶，用于特异性靶向癌细胞表面过表达的透明质酸受体。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。

图1为制备的荧光纳米传感器对透明质酸酶的识别示意图；

图2为5-(4-(三乙基胺)-丁基氧苯基)-10,15,20-三苯基卟啉的核磁数据图；

图3为荧光纳米传感器的粒径分布图；

图4为荧光纳米传感器随透明质酸加入时间的荧光发射光谱变化图（激发波长：425nm）；

图5为加入不同浓度的HAase时，荧光纳米传感器的荧光发射光谱变化图；

图6为荧光强度值变化随透明质酸酶浓度变化所对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图；

图7为各种离子对荧光纳米传感器的荧光恢复的干扰性对比数据图；

图8为各种离子对荧光纳米传感器的荧光强度的干扰性对比数据图；

图9为不同浓度荧光纳米探针的HeLa细胞存活率数据图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和理解本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 一种卟啉衍生物及其制备方法

一种卟啉衍生物的分子式为

其制备方法为

一、将0.317 mmol SM1-1加入到8ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，开始搅拌，再加入4.76 mmol无水碳酸钾，室温搅拌，待搅拌混合均匀后，加入4.76 mmol SM2-1，氮气保护下，140℃回流搅拌24h，薄层层析法（石油醚PE：二氯甲烷DCM=10:1）检测，反应完毕后，降温至室温，水洗除掉DMF，所得固体物料通过柱层析（石油醚PE：二氯甲烷DCM=5:1）提纯，得到SM3-1，其化学反应方程式为：

二、将0.131 mmol SM3-1加入到4ml干燥的DMF中，并加入5.24mmol三乙胺，在氩气保护下，110℃回流搅拌20h，薄层层析（PE：DCM=1:1）监测反应，反应完毕后冷却至室温，加入无水***搅拌至有固体析出，抽滤，得SM4-1，其反应方程式为：

实施例2~7 卟啉衍生物及其制备方法

实施例2~7的制备方法中的实验操作步骤及实验条件与实施例1中的实验操作步骤及实验条件均相同，区别仅在于所用原料的n不同，导致产物不同，其中，n=2,5,9,11,17,24，最终制得的卟啉衍生物的分子式为

实施例8 一种卟啉衍生物及其制备方法

一种卟啉衍生物的分子式为

其制备方法为

一、将0.317 mmol SM1-2加入到8ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，开始搅拌，再加入6.02 mmol无水碳酸钾，室温搅拌，待搅拌混合均匀后，加入5.39 mmol SM2-2，氮气保护下，130℃回流搅拌30h，薄层层析法（石油醚PE：二氯甲烷DCM=8:1）检测，反应完毕后，降温至室温，水洗除掉DMF，所得固体物料通过柱层析（石油醚PE：二氯甲烷DCM=4:1）提纯，得到SM3-2，其化学反应方程式为：

二、将0.131 mmol SM3-2加入到4ml干燥的DMF中，并加入4.72mmol三乙胺，在氩气保护下，125℃回流搅拌17h，薄层层析（PE：DCM=2:1）监测反应，反应完毕后冷却至室温，加入无水***搅拌至有固体析出，抽滤，得SM4-2，其反应方程式为：

实施例9~14 卟啉衍生物的制备方法

实施例9~14的制备方法中的实验操作步骤及实验条件与实施例1中的实验操作步骤及实验条件均相同，区别仅在于所用原料

的n不同，导致产物不同，其中，n=5, 9,11, 17, 22，24，最终制得的卟啉衍生物的分子式为

实施例15 一种卟啉衍生物及其制备方法

一种卟啉衍生物的分子式为

其制备方法为

一、将0.317 mmol SM1-3加入到8ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，开始搅拌，再加入7.29mmol无水碳酸钾，室温搅拌，待搅拌混合均匀后，加入6.34 mmol SM2-3，氮气保护下，120℃回流搅拌36h，薄层层析法（石油醚PE：二氯甲烷DCM=6:1）检测，反应完毕后，降温至室温，水洗除掉DMF，所得固体物料通过柱层析（石油醚PE：二氯甲烷DCM=3:1）提纯，得到SM3-3，其化学反应方程式为：

二、将0.131 mmol SM3-3加入到4ml干燥的DMF中，并加入4.32mmol三乙胺在氩气保护下，135℃回流搅拌14h，薄层层析（PE：DCM=3:1）监测反应，反应完毕后冷却至室温，加入无水***搅拌至有固体析出，抽滤，得SM4-3，其反应方程式为：

实施例16~21 卟啉衍生物及其制备方法

实施例16~21的制备方法中的实验操作步骤及实验条件与实施例1中的实验操作步骤及实验条件均相同，区别仅在于所用原料

的n不同，导致产物不同，其中，n=2，5,11, 17, 22，24，最终制得的卟啉衍生物的分子式为

实施例22 一种卟啉衍生物及其制备方法

一种卟啉衍生物的分子式为

其制备方法为

一、将0.317 mmol SM4-1加入到8ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，开始搅拌，再加入 8.24mmol无水碳酸钾，室温搅拌，待搅拌混合均匀后，加入6.97mmol SM4-2，氮气保护下，110℃回流搅拌40h，薄层层析法（石油醚PE：二氯甲烷DCM=4:1）检测，反应完毕后，降温至室温，水洗除掉DMF，所得固体物料通过柱层析（石油醚PE：二氯甲烷DCM=2:1）提纯，得到SM4-3，其化学反应方程式为：

二、将0.131 mmol SM4-3加入到4ml干燥的DMF中，并加入3.14mmol三乙胺，在氩气保护下，115℃回流搅拌12h，薄层层析（PE：DCM=7:1）监测反应，反应完毕后冷却至室温，加入无水***搅拌至有固体析出，抽滤，得SM4-4，其反应方程式为：

实施例23~28 卟啉衍生物及其制备方法

实施例23~28的制备方法中的实验操作步骤及实验条件与实施例1中的实验操作步骤及实验条件均相同，区别仅在于所用原料的n不同，导致产物不同，其中，n=2，5,13, 17, 22，24，最终制得的卟啉衍生物的分子式为

实施例29 一种卟啉衍生物及其制备方法

一种卟啉衍生物的分子式为

其制备方法为

一、将0.317 mmol SM1-5加入到8ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，开始搅拌，再加入9.51 mmol无水碳酸钾，室温搅拌，待搅拌混合均匀后，加入7.93 mmol SM2-5，氮气保护下，140℃回流搅拌48h，薄层层析法（石油醚PE：二氯甲烷DCM=10:1）检测，反应完毕后，降温至室温，水洗除掉DMF，所得固体物料通过柱层析（石油醚PE：二氯甲烷DCM=5:1）提纯，得到SM3-5，其化学反应方程式为：

二、将0.131 mmol SM3-5加入到4ml干燥的DMF中，并加入2.62mmol三乙胺，在氩气保护下，110℃回流搅拌10h，薄层层析（PE：DCM=1:1）监测反应，反应完毕后冷却至室温，加入无水***搅拌至有固体析出，抽滤，得SM4-5，其反应方程式为：

实施例30 一种可检测透明质酸的荧光纳米传感器

取合成的SM4-1配制为0.5 mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液，取透明质酸

（m=100）配制为0.05 mg/mL的水溶液，然后取40 μL的透明质酸于1.5 mL离心管中，再用移液枪取16 μL SM4-1溶液与透明质酸混合均匀，加100 μL 1mol/L pH为7.0的HEPES缓冲溶液中，再加844 μL水超声1 min，继续反应5 h即可得到荧光纳米传感器。

实施例31 一种可检测透明质酸的荧光纳米传感器

取合成的SM4-2配制为0.5 mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液，取透明质酸（m=300）配制为0.05 mg/mL的水溶液，然后取40 μL的透明质酸于1.5 mL离心管中，再用移液枪取12 μL SM4-2溶液与透明质酸混合均匀，加100 μL 1mol/L pH为7.2的HEPES缓冲溶液中，再加844 μL水超声1.2 min，继续反应6 h即可得到荧光纳米传感器。

实施例32 一种可检测透明质酸的荧光纳米传感器

取合成的SM4-3配制为0.5 mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液，取透明质酸

（m=500）配制为0.05 mg/mL的水溶液，然后取40 μL的透明质酸于1.5 mL离心管中，再用移液枪取8 μL SM4-3溶液与透明质酸混合均匀，加100 μL 1 mol/L pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，再加844 μL水超声1.5 min，继续反应7 h即可得到荧光纳米传感器。

实施例33 一种可检测透明质酸的荧光纳米传感器

取合成的SM4-4配制为0.5 mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液，取透明质酸

（m=700）配制为0.05 mg/mL的水溶液，然后取40 μL的透明质酸于1.5 mL离心管中，再用移液枪取20 μL SM4-4溶液与透明质酸混合均匀，加100 μL 1mol/L pH为7.6的HEPES缓冲溶液中，再加844 μL水超声1.8 min，继续反应8 h即可得到荧光纳米传感器。

实施例34 一种可检测透明质酸的荧光纳米传感器

取合成的SM4-5配制为0.5 mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液，取透明质酸

（m=1000）配制为0.05 mg/mL的水溶液，然后取40 μL的透明质酸于1.5 mL离心管中，再用移液枪取24 μL SM4-5溶液与透明质酸混合均匀，加100 μL 1 mol/LpH为8.0的HEPES缓冲溶液中，再加844 μL水超声2 min，继续反应5 h即可得到荧光纳米传感器。

实施例35 荧光纳米传感器的鉴定

选取实施例30中得到的荧光纳米传感器，该纳米传感器的粒径分布在148 nm，如图3所示，自组装之后的荧光强度随着响应时间增大迅速降低，当响应时间达到6 h时荧光强度几乎只有加入透明质酸之前的1/6，此时的荧光强度趋于一个稳定值，如图4所示，基于以上步骤得到的荧光纳米传感器，即一种可检测透明质酸酶的荧光纳米传感器。

实施例36 荧光纳米传感器检测透明质酸酶的荧光滴定实验

取10个1.5 mL样品瓶，分别加入实施例6中所得的荧光传感器溶液，依次加入浓度为[HAase] = 0 (a)，10 U/mL (b）, 20 U/mL (c), 30 U/mL (d)，50 U/mL (e), 60 U/mL(f), 70 U/mL (g), 80 U/mL (h), 90 U/mL (i), 100 U/mL (j), 150 U/mL (k), 200U/mL (l)的于12个样品瓶中，37 ℃恒温孵育1 h后，以425 nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光发射光谱，得12个样品的荧光发射光谱变化图，见图5。测定结果表明：该聚合物荧光传感器在656 nm处的荧光强度随着透明质酸酶浓度的逐渐增加而逐步上升。根据图4中656 nm处荧光强度变化值与HA ase浓度的变化关系可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图（y=a + b*x，a=0.9427，b=0.01701，R2=0.9967），见图6。

实施例37 其它分子、离子对检测透明质酸酶影响的对比检测试验

取15个1.5 mL离心管，分别装入实施例30中所得的荧光纳米传感器溶液，然后分别将浓度为100 U/mL HAase、 0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L KCl、0.1 mol/L CaCl₂、0.1 mol/LMgCl₂、10 mmol/L丙氨酸、10 mmol/L苏氨酸、10 mmol/L甘氨酸、10 mmol/L组氨酸、10mmol/L苯丙氨酸、10 mmol/L葡萄糖、5 mmol/L GSH（谷胱甘肽）、1 mmol/L Cys（半胱氨酸）和5 mmol/L Hcy（同型半胱氨酸）溶液分别加入到2~15号样品瓶中，1号样品为空白样。然后分别测定15个样品在425 nm波长激发下的荧光光谱数据，得到在656 nm波长发射处的荧光变化值，结果见图7。测定结果表明：除了透明质酸酶外，其它上述各种物质对所制备的荧光纳米传感器的荧光强度没有明显影响。

实施例38 其它小分子、离子和透明质酸酶共存时的影响的对比检测试验

取15个1.5 mL离心管，分别装入实施例30中所得的荧光纳米传感器溶液，1号样品为空白样，然后分别将浓度为100 U/mL HAase、 0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L KCl、0.1 mol/LCaCl₂、0.1 mol/L MgCl₂、10 mmol/L丙氨酸、10 mmol/L苏氨酸、10 mmol/L甘氨酸、10 mmol/L组氨酸、10 mmol/L苯丙氨酸、10 mmol/L葡萄糖、5 mmol/L GSH（谷胱甘肽）、1 mmol/L Cys（半胱氨酸）和5 mmol/L Hcy（同型半胱氨酸）溶液加入到2~14样品瓶中。然后分别测定15个样品在425 nm波长激发下的荧光发射光谱数据，得到在656 nm波长发射处的荧光变化值，结果见图8。测定结果表明：除了透明质酸酶外，其它上述各种共存的离子和分子不会干扰荧光纳米传感器对透明质酸酶的响应。

实施例39 不同浓度荧光纳米探针的Hela细胞存活率试验

首先，HeLa细胞置于含有10 %胎牛血清的DMEM培养基中，然后在含有5 % CO2的恒温（37 ℃）恒湿培养箱中培养24 h,去除培养基后用PBS缓冲溶液清洗3次，加入含不同浓度（0μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL）荧光纳米探针的DMEM培养基培养,继续培养24 h.细胞毒性按照ISO10993-5标准采用MTT试验进行测试,测试结果如图9所示。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。