阅读说明：本技术 抗cd40抗体及其用途 (anti-CD 40 antibodies and uses thereof ) 是由 B·C·巴恩哈特 B·德沃瓦 A·P·杨纽克 S·L·奥卡达 B·L·斯蒂芬斯 J·W·韦 于 2018-12-27 设计创作，主要内容包括：本文提供了激动性抗体或其抗原结合部分,其结合人CD40并包含赋予提高的产率和减少的聚集的改进的重链和轻链可变区。本发明还提供了通过向有此需要的受试者施用本发明的抗体来治疗癌症或慢性感染的方法。(Provided herein are agonistic antibodies, or antigen-binding portions thereof, that bind human CD40 and comprise improved heavy and light chain variable regions conferring increased yield and reduced aggregation. The invention also provides methods of treating cancer or chronic infection by administering the antibodies of the invention to a subject in need thereof.)

抗CD40抗体及其用途

相关申请的交叉引用

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背景技术

最近的研究表明，可以用调节患者对恶性细胞或感染细胞的免疫应答的药物治疗人类癌症和慢性感染。参见例如Reck&Paz-Ares(2015)Semin.Oncol.42：402。已经尝试了诸如CP 870893和dacetuzumab(SGN-40)等激动性抗CD40抗体来治疗癌症，其依据是它们可以增强这种免疫应答。参见，例如，Kirkwood等人(2012)CA CancerJ.Clin.62：309；Vanderheide&Glennie(2013)Clin.Cancer Res.19：1035。最近在小鼠中进行的实验表明，对抑制性Fc受体FcγRIIb具有增强的特异性的抗CD40抗体具有增强的抗肿瘤功效。参见，例如，WO 2012/087928；Li&Ravetch(2011)Science 333：1030；Li&Ravetch(2012)Proc.Nat′lAcad.Sci USA 109：10966；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19：101；White等人(2011)J.Immunol.187：1754。

需要用于治疗人类受试者的癌症和慢性感染的改良的激动性抗人CD40抗体。这样的抗体将优选以高产率和低聚集产生。

本发明提供抗体12D6的改进的人源化重链可变域和轻链可变域，该抗体在保留了对人CD40的实质亲和力的同时显示出提高的产率。具体而言，本发明提供激动性抗huCD40抗体，其包含改进的轻链可变区L2至L6(SEQ ID NO：47-51)，例如L4(SEQ ID NO：49)和/或改进的重链可变区H2至H4(SEQ ID NO：52-54)，例如重链H4(分别为SEQ ID NO：54)。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区对，其分别选自(i)SEQ ID NO：5、7、9、11、52、53和54的残基1-119和SEQ ID NO：49；(ii)SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：6、8或10的残基1-112。在一些实施方案中，抗体包含分别重链可变区和轻链可变区对，其分别选自(i)SEQID NO：11的残基1-119和SEQ ID NO：49；和(ii)SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：49。在一些实施方案中，本发明包括包含重链可变区H2(SEQ ID NO：52)和轻链可变区L4(SEQ ID NO：49)的抗体。这些抗体中的任何一个可以任选地进一步包含包含IgG1f(SEQ ID NO：44)的重链恒定区和/或SEQ ID NO：45的轻链κ恒定区。或者，这些抗体中的任何一个可以任选地进一步包含重链恒定区，该重链恒定区包含一个或多个氨基酸取代以增强激动剂活性。

在另外的实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含与上一段落中列出的抗体中的任何一个的重链和轻链可变区具有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的重链和轻链可变区。在另外的实施方案中，抗huCD40抗体包含基本上由本文公开的抗体中的任何一个的重链可变区和轻链可变区的序列组成的重链可变区和轻链可变区。

本发明进一步提供了编码前两段的重链可变区和/或轻链可变区或其抗原结合片段的核酸、包含所述核酸分子的表达载体、用所述表达载体转化的细胞，以及通过从用所述表达载体转化的细胞表达抗体并回收所述抗体来产生抗体的方法，以及包含本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段和载体的药物组合物。

本发明提供了一种在受试者中增强免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，以使得所述受试者中的免疫应答被增强。在某些实施方案中，所述受试者患有肿瘤并且针对所述肿瘤的免疫应答增强。在另一个实施方案中，所述受试者患有病毒感染，例如慢性病毒感染，并且抗病毒免疫应答增强。

本发明还提供了一种抑制受试者中肿瘤生长的方法，该方法包括向所述受试者施用本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而抑制肿瘤的生长。

本发明进一步提供了治疗癌症的方法，例如通过免疫疗法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，例如作为药物组合物，从而治疗癌症。在某些实施方案中，该癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫/***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食道癌、胃肠道癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关的癌症。在某些实施方案中，所述癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。

本发明还提供了一种治疗慢性病毒感染的方法，例如通过免疫疗法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，例如作为药物组合物，从而治疗慢性病毒感染。

在某些实施方案中，本文所述的调节免疫功能的方法和治疗方法包括与一种或多种另外的治疗剂组合或作为双特异性试剂与一种或多种另外的治疗剂一起施用本发明的抗huCD40抗体，所述一种或多种另外的治疗剂为例如，抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗CD137抗体、抗CD27抗体、抗CSF-1R抗体、抗CTLA-4抗体、TLR激动剂或IDO或TGFβ的小分子拮抗剂。在特定的实施方案中，将抗huCD40疗法与抗PD1和/或抗PD-L1疗法组合，例如用与人PD1结合的抗体或其抗原结合片段或与人PD-L1结合的抗体或其抗原结合片段一起进行治疗。

在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含一条或多条重链和一条或多条轻链，例如两条重链和两条轻链。

附图简述

图1显示用多种激动剂抗huCD40抗体滴定的未成熟人树突状细胞的TNF-α表达。抗体12D6-24(x标记)是未修饰的抗CD40抗体(重链和轻链序列分别为：SEQ ID NO：11和8)。抗体12D6-24-L4H1-6P1(空心正方形)和12D6-24-L4H1-6P2(实心正方形)具有由L4序列(SEQID NO：49)组成的修饰的轻链可变域和未修饰的重链可变域(即，SEQ ID NO：11)。6P1和6P2是指来自两个单独的人类供体的树突状细胞。抗体12D6-24-L4H4(实心圆)具有由L4序列(SEQ ID NO：49)组成的修饰的轻链可变域和由H4序列(SEQ ID NO：54)组成的修饰的重链可变域。参见实施例3。

图2A和2B分别显示当用本发明的各种抗体处理时，通过CD83和CD86表达测量的人树突状细胞的活化。如实施例3所述，将树突状细胞暴露于所示的抗体，用荧光抗CD83和抗CD86抗体染色，并通过荧光激活细胞分选(FACS)进行分析。信号以平均荧光强度(MFI)表示。抗体12D6是图1中所述的抗体12D6-24，抗体L4H1和L4H4分别是图1中所述的12D6-24-L4H1和12D6-24-L4H4。抗体5F11是本文公开的另一种激动剂抗CD40抗体，而对照是不相关的IgG1。每种抗体最左边的黑条是未染色的样品。中间的浅灰色条是用抗CD83抗体染色的细胞，而最右边的深灰色条是用抗CD86抗体染色的细胞。图2A提供了在抗CD83抗体的激发波长处获得的数据(即，主要显示了CD83的染色)，而图2B提供了在抗CD86抗体的激发波长处获得的数据(即，主要显示了CD86的染色)。

发明详述

本发明提供了分离的抗体，特别是人源化的单克隆抗体，其特异性结合人CD40(“huCD40”)并具有激动剂活性，并且具体地提供了改进的重链和轻链可变区序列，其提高了产率并且仍然保留了对于huCD40的实质亲和力。

本文进一步提供了制备此类抗体、包含此类抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物和双特异性分子以及配制为含有所述抗体或片段的药物组合物的方法。本文还提供使用所述抗体单独或与其他免疫刺激剂(例如抗体)和/或癌症或抗感染疗法组合用于增强免疫应答的方法。因此，本文所述的抗huCD40抗体可以用于多种治疗应用中的治疗中，包括例如抑制肿瘤生长和治疗慢性病毒感染。

定义

为了使本说明书更容易理解，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了附加定义。

术语“CD40”是指“TNF受体超家族成员5”(TNFRSF5)。除非另有说明或从上下文中清楚得知，否则本文中对CD40的提及是指人CD40(“huCD40”)，并且“抗CD40抗体”是指抗人CD40抗体。人CD40进一步描述为GENE ID NO：958和MIM(人类孟德尔遗传)：109535。包括20个氨基酸信号序列的人CD40的序列(GenBank登录号NP_001241.1)在SEQ ID NO：1中提供。

CD40与CD40配体(CD40L)相互作用，其也被称为TNFSF5、gp39和CD154。除非另有说明或从上下文中清楚得知，否则本文中对“CD40L”的提及是指人CD40L(“huCD40L”)。人CD40L进一步描述为GENE ID NO：959和MIM：300386。人CD40L的序列(GenBank登录号NP_000065.1)在SEQ ID NO：2中提供。

除非另有说明或从上下文中清楚得知，否则本文所用的术语“抗体”可包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区组成。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V_H和V_L区可以进一步细分为高可变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着称为框架区(FR)的更为保守的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个构架区(FR)组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

抗体通常以高亲和力特异性结合其同源抗原，该高亲和力反映为10^-7至10^-11M或更小的解离常数(K_D)。通常认为任何大于约10^-6M的K_D表示非特异性结合。如本文所用，与抗原“特异性结合”的抗体是指以高亲和力结合抗原和基本上相同的抗原的抗体，这意味着具有10^-7M或更小，优选10^-8M或更小，甚至更优选5×10^-9M或更小，最优选10^-8M至10^-10M或更小的K_D，但是不以高亲和力结合不相关的抗原。如果抗原与给定抗原表现出高度的序列同一性，例如，如果它表现出与给定抗原的序列至少80％、至少90％，优选至少95％，更优选地至少97％，或甚至更优选至少99％序列同一性，则该抗原与给定抗原“基本上相同”。举例来说，特异性结合人CD40的抗体也可能与来自某些非人灵长类物种(例如食蟹猴)的CD40发生交叉反应，但可能不会与来自其他物种的CD40或除了CD40之外的抗原发生交叉反应。

除非另有说明，否则免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为亚类：人的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白，例如人IgG1，以若干种同种异型存在，它们在最多几个氨基酸上彼此不同。除非另有说明，否则本发明的抗体包含IgG1f恒定域(SEQ ID NO：44)。除非另有说明，否则“抗体”可以包括例如单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人类和非人类抗体；全合成抗体；和单链抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原(例如，人CD40)的能力的抗体的一个或多个片段。术语抗体的“抗原结合部分/片段”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段-由V_L、V_H、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段-包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H域组成的Fv片段，和(v)由V_H域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)。如果能够结合抗原，则分离的互补决定区(CDR)或通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合可包含抗体的抗原结合域。

单链抗体构建体也包括在本发明中。尽管Fv片段的两个域V_L和V_H由不同的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，从而使它们成为单一蛋白链，其中V_L和V_H区对形成称为单链Fv(scFv)的单价分子；参见，例如，Bird等，(1988)Science242：423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。这样的单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”内。这些和其他潜在的构造在Chan&Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10：301中描述。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗原结合部分/片段可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。

除非另有说明，否则当提及抗体时所使用的，如在权利要求书中，词语“片段”是指抗体的抗原结合片段，使得“抗体或片段”具有与“抗体或其抗原结合片段”相同的含义。

“双特异性”或“双功能抗体”是具有两条不同的重链/轻链对的人工杂种抗体，其产生对不同抗原具有特异性的两个抗原结合位点。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148，1547-1553。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体，或其中所有抗体对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体组合物。通常，此类单克隆抗体将源自单一细胞或编码该抗体的核酸，并且将在不故意引入任何序列改变的情况下进行繁殖。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，例如，通过将获自转基因或转染色体的非人类动物(例如，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)的B细胞融合至永生化的细胞而获得的杂交瘤。

如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)或从该动物制备的杂交瘤中分离的抗体，该动物对于人免疫球蛋白基因是转基因或转染色体的，(b)从转化为表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区，但包括随后发生的重排和突变，例如在抗体成熟期间发生的重排和突变。如本领域中已知的(参见，例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9)：1117-1125)，可变区包含抗原结合域，其由重排以形成对外来抗原具有特异性的抗体的多种基因编码。除重排外，还可通过多个单个氨基酸变化(称为体细胞突变或超突变)进一步修饰可变区，以增加抗体对外源抗原的亲和力。恒定区将在对抗原的另一应答中改变(即，同种型转换)。因此，编码响应抗原的轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排和体细胞突变的核酸序列可能与原始种系序列不同，但可以是基本相同或相似(即，具有至少80％同一性)。

“人”抗体(HuMAb)是指具有其中框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或定点诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不意图包括其中衍生自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“全人”抗体是同义词。

“人源化”抗体是指这样的抗体，其中非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR域之外的一些、大部分或全部氨基酸被由人类免疫球蛋白衍生的相应氨基酸取代。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR域之外的一些、大多数或全部氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸取代，而一个或多个CDR区内的一些、大多数或全部氨基酸未改变。氨基酸的小的添加、缺失、***、取代或修饰是可以被允许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。

“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自一个物种而恒定区衍生自另一物种的抗体，例如其中可变区衍生自小鼠抗体而恒定区衍生自人抗体的抗体。“杂种”抗体是指具有不同类型的重链和轻链的抗体，例如小鼠(亲本)重链和人源化轻链，反之亦然。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。

“同种异型”是指特定同种型组内的天然存在的变体，这些变体的一个或几个氨基酸有所不同。参见，例如，Jefferis等(2009)mAbs1：1。

短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。

如本文所用，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD40的分离的抗体基本上不含特异性结合除CD40以外的抗原的抗体)。但是，特异性结合CD40的表位的分离的抗体可以具有与来自其他物种的其它CD40蛋白的交叉反应性。

衍生自抗体Fc区与某些Fc受体相互作用的“效应子功能”包括但不必须限于Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能，例如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。此类效应子功能通常需要将Fc区与抗原结合域(例如，抗体可变域)结合。

“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。结合IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替代的剪接形式。FcγR家族由三种激活性受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIb或等效FcγRIIB)组成。表1总结了人类FcγR的多种特性。大多数先天性效应细胞类型共表达一种或多种激活性FcγR和抑制性FcγRIIb，而在小鼠和人类中天然杀伤(NK)细胞选择性表达一种激活性Fc受体(在小鼠中为FcγRIII，在人中为FcγRIIIA)，但不表达抑制性FcγRIIb。人IgG1与大多数人Fc受体结合，就其结合的激活Fc受体的类型而言，人IgG1被认为等同于鼠类IgG2a。

表1

人FcγR的特性

“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc域”或“Fc”是指抗体重链的C端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，Fc区包含将第一恒定区免疫球蛋白域排除在外的抗体的恒定区(例如，CH1或CL)。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区在抗体的两条重链中的每条重链中均包含CH₂和CH₃恒定域；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定域(C_H域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会发生变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从重链的C226或P230位置的氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)延伸到羧基末端，其中编号是按照Kabat中的EU索引进行的。Kabat等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda，MD；还参见美国专利申请公开号2008/0248028的图3c-3f。人IgG Fc区的C_H2域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而C_H3域位于Fc区中C_H2域的C末端侧，即，其从IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447(包括C末端赖氨酸)。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体，或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。Fc也可以指在包含Fc的蛋白多肽(诸如“包含Fc区的结合蛋白”，也被称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫黏附素))的分离物中的或其背景下的该区域。

“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型。参见，例如，Jefferis等(2009)mAbs 1：1。

如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体结合预定抗原上的表位而不结合其他抗原。通常，抗体(i)结合的平衡解离常数(K_D)大约为小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10 M或甚至更低，当通过以下方法确定的，例如使用预定抗原(例如重组人CD40)作为分析物和抗体作为配体的

2000表面等离子体共振仪中的表面等离子体共振(SPR)技术，或抗体与抗原阳性细胞结合的Scatchard分析；和(ii)与预定抗原结合的亲和力比其与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力大至少两倍。因此，“特异性结合人CD40”的抗体是指以10^-7M或更小，例如约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或甚至更低的K_D结合可溶性或细胞结合的人CD40的抗体。“与食蟹猴CD40交叉反应”的抗体是指以10^-7M或更小，例如约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或甚至更低的K_D结合食蟹猴CD40的抗体。

如本文所用的术语“k_assoc”或“k_a”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，而本文所用的术语“k_dis”或“k_d”是指特定抗体与抗原相互作用的解离速率常数。如本文所用，术语“K_D”是指平衡解离常数，其由k_d与k_a的比率(即k_d/k_a)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可以使用本领域众所周知的方法确定。确定抗体的K_D的优选方法是生物层干涉法(BLI)分析，优选使用ForteBio Octet RED设备，表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统(例如

表面等离子体共振系统)，或流式细胞术和Scatchard分析。

在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内测定的上下文中，术语“EC50”是指诱导最大应答的50％的应答(即最大应答和基线之间的一半)的抗体或其抗原结合片段的浓度。

术语“与固定的CD40结合”是指本文所述的抗体与CD40结合(例如与在细胞表面上表达的或与附接至固相支持物的CD40结合)的能力。

如本文所用，术语“交叉反应”是指本文所述的抗体结合来自不同物种的CD40的能力。例如，本文描述的结合人CD40的抗体也可以结合来自另一物种的CD40(例如，食蟹猴CD40)。如本文所用，交叉反应性可以通过以下方式测量：在结合测定法(例如，SPR、ELISA)中检测与纯化的抗原的特异性反应性或与生理表达CD40的细胞结合或以其他方式与之在功能上相互作用。用于确定交叉反应性的方法包括本文所述的标准结合测定法，例如，使用2000SPR仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离子体共振(SPR)分析或流式细胞术。

如本文所用，术语“天然存在”应用于以下对象，其是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，所述生物体是从天然来源分离的并且尚未被人在实验室中故意修饰。

“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，该链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可包含修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键。“蛋白质”可以包含一个或多个多肽。

如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。

还提供了本文提供的抗体序列的“保守序列修饰”，即这样的核苷酸和氨基酸序列修饰，其不消除由该核苷酸序列编码的或含有该氨基酸序列的抗体与抗原的结合。例如，可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选将抗CD40抗体中的预测的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基。鉴定不消除抗原结合性的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997)。

可替代地，在另一个实施方案中，可以沿着抗CD40抗体编码序列的全部或一部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得的修饰的抗CD40抗体以提高结合活性。

对于核酸，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定序列在至少约80％的核苷酸(通常至少约90％至95％，且更优选至少约98％至99.5％的核苷酸)中是同一的并且具有适当的核苷酸***或缺失。可替代地，当这些区段将在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在基本同源性。

对于多肽，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，两个多肽或其指定序列在至少约80％的氨基酸(通常至少约90％至95％，且更优选至少约98％至99.5％的氨基酸)中是同一的并且具有适当的氨基酸***或缺失。

两个序列之间的同一性百分比是考虑为了进行两条序列的最佳比对而需要引入的空位的数目、每个空位的长度，由当序列以最佳比对时这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同位置数/总位置数x 100)。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性实例中所述。

两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序来确定，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。两条核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers and W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法来确定，其已经被并入ALIGN程序(2.0版本)，其使用PAM120权重残基表、空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两条氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法来确定(该算法已经并入GCG软件包中的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以使用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白搜索，以获得与本文所述蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)：3389-3402中所述的利用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

核酸可以在完整细胞中、在细胞裂解物中存在或以部分纯化或基本上纯的形式存在。通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术)，从其他细胞组成或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分))或蛋白质中纯化出来的核酸是“分离的”或“呈现基本纯的”。参见Ausubel等人，编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。

如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指可以向其中连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，可以将其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，还包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有等同的功能。

如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指包含非天然存在于该细胞中的核酸的细胞，并且可以是其中已经引入了重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语不仅旨在指特定的主题细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

“免疫应答”是指脊椎动物中针对外来因子的生物应答，该应答保护生物体免受这些外来因子和由它们引起的疾病。免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，其导致选择性地靶向、结合、损坏、破坏和/或从脊椎动物身体中消除入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常的人类细胞或组织。免疫反应包括例如激活或抑制T细胞，例如效应T细胞或Th细胞，例如CD4⁺或CD8⁺T细胞，或抑制或耗竭T_reg细胞。“T效应”(“T_eff”)细胞是指具有细胞溶解活性的T细胞(例如CD4⁺和CD8⁺T细胞)以及T辅助(Th)细胞，其分泌细胞因子并激活和引导其他免疫细胞，但不包括调节性T细胞(T_reg细胞)。

如本文所用，术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞介导的应答，所述T细胞包括效应T细胞(例如，CD8⁺细胞)和辅助T细胞(例如，CD4⁺细胞)。T细胞介导的应答包括例如T细胞的细胞毒性和增殖。

如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8⁺T细胞介导。

“免疫调节剂”或“免疫调控剂”是指这样的药剂，例如可参与调节、调控或修改免疫应答的信号传导途径的组分。“调节”、“调控”或“修改”免疫应答是指免疫系统的细胞的任何改变或此类细胞(例如效应T细胞)活性的任何改变。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，其表现为多种细胞类型的数目的增加或减少，这些细胞活性的增加或减少，或免疫系统内可发生的任何其他变化。已经鉴定了抑制性免疫调节剂和刺激性免疫调节剂二者，其中一些在肿瘤微环境中可能具有增强的功能。在优选的实施方案中，免疫调节剂位于T细胞的表面上。“免疫调节靶标”或“免疫调控靶标”是被靶向用于结合的免疫调节剂，其活性通过物质、药剂、部分、化合物或分子的结合而被改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节性受体”)和受体配体(“免疫调节性配体”)。

“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修改免疫应答的方法来治疗患有疾病、或有患上疾病或承受疾病复发的风险的受试者。

“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指导致在受试者中增加(诱导、增强或刺激，所有这些都可以互换使用)免疫应答例如用于治疗癌症的疗法。

“增强内源性免疫应答”是指增加受试者中现有免疫应答的有效性或效力。例如，可以通过克服抑制内源宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源宿主免疫应答的机制来实现有效性和效力的增加。

如本文所用，术语“连接的”是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。所述连接也可以是遗传的(即，重组融合)。可以使用多种本领域公认的技术，例如化学缀合和重组蛋白生产，来实现这种连接。

如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂的组合物引入身体内。用于本文所述的抗体的优选的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。或者，本文所述的抗体可通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部施用。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行施用。

如本文所用，术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并且涵盖部分和完全抑制/阻断至少约50％，例如至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。

如本文所用，“癌症”是指特征在于体内异常细胞的不受控制的生长的一大类疾病。不受调控的细胞***可能导致恶性肿瘤或侵袭邻近组织的细胞的形成，并可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。

如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)是指对受试者进行的任何类型的干预或过程或将活性药剂施用于受试者，以逆转、减轻、改善、抑制或减慢或预防与疾病相关的症状、并发症、病状或生化标记的进展、发展、严重程度或复发为目标。预防是指向不患有疾病的受试者施用，以预防疾病的发生或最小化疾病的影响(如果发生的话)。

术语“有效剂量(effective dose)”或“有效剂量(effective dosage)”定义为足以达到或至少部分达到期望效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退的任何量的药物，该疾病消退是通过以下证明的：疾病症状的严重程度有所降低，无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或由于疾病折磨导致的损伤或残疾的预防。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是当单独或与另一种治疗剂组合施用于处于发展疾病或承受疾病复发的风险中的受试者时抑制疾病的发展或复发的药物的量。治疗性或预防性药剂促进疾病的消退或抑制疾病的发展或复发的能力可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评估，例如在临床试验期间的人类受试者中，在可预测在人类中功效的动物模型体系中，或通过在体外测定中测定药剂的活性。

举例来说，抗癌剂是在受试者中减慢癌症进展或促进癌症消退的药物。在优选的实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”是指单独或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或大小的减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加、由于疾病折磨而导致的损伤或残疾的预防，或以其他方式改善患者的疾病症状。药理效力是指药物促进患者癌症消退的能力。生理安全性是指由于施用药物而在细胞、器官和/或生物体水平上的可接受的低水平的毒性或其他不利的生理作用(副作用)。

举例来说，用于***，药物的治疗有效量或剂量相对于未治疗的受试者优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，仍更优选至少约80％。在最优选的实施方案中，药物的治疗有效量或剂量完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即，优选抑制细胞生长或肿瘤生长100％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以使用下文所述的测定法进行评估。肿瘤生长的抑制可能不会在治疗后立即发生，并且可能仅在一段时间后发生或在重复施用后发生。可替代地，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评估组合物的这种性质，可以通过熟练技术人员已知的测定法在体外测量这种抑制作用。在本文所述的其他优选的实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且可以持续至少约20天，更优选至少约40天，或者甚至更优选至少约60天的时间。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则“组合”疗法意在涵盖以协调的方式施用两种或更多种治疗剂，并且包括但不限于同时给药。具体而言，组合疗法涵盖共同施用(例如共同配制剂的施用或分开的治疗组合物的同时施用)和连续或顺序施用，只要一种治疗剂的施用以某种方式以另一种治疗剂的施用为条件。例如，仅在已经施用了一种不同的治疗剂并且允许其发挥作用达规定的时间段之后才可以施用一种治疗剂。参见，例如，Kohrt等(2011)Blood 117：2423。

术语“患者”和“受试者”是指接受预防性或治疗性治疗的任何人。例如，本文所述的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。

在以下小节中进一步详细描述了本文描述的各个方面。

I.抗CD40抗体

本申请公开了具有所需性质的激动性抗huCD40抗体，其用作治疗诸如癌症和慢性病毒感染的疾病的治疗剂。这些特性包括下列中的一种或多种：以高亲和力结合人CD40的能力，在人类受试者中可接受的低免疫原性，以及在哺乳动物细胞(例如CHO)中表达时可接受的高水平的抗体产生和低聚集。本发明的抗CD40抗体可以被称为改进的抗体，在这种情况下，改进可以相对于原始的未修饰形式的抗体，例如mAb 12D6-24(包含SEQ ID NO：11和8或其可变结构域)来测量。改进可以通过包括产率和单体抗体的百分比在内的任何性质，或通过缺乏多聚体和其他高分子量种类来测量。

抗CD40抗体序列变体

本文所公开的抗体序列中的某些变异性是可以容忍的，并且仍然保留抗体的所需特性。使用Kabat系统(Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)来描绘CDR区。因此，本发明提供了包含重链和/或轻链可变结构域序列的抗huCD40抗体，该重链和/或轻链可变结构域序列与本文公开的抗体的重链和/或轻链可变结构域序列(例如包含SEQ ID NO：54和49、SEQ ID NO：11和49、或SEQ ID NO：52和49的重链和轻链可变结构域的12D6抗体)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

II.工程化和修饰的抗体

靶向抗原结合

在各种实施方案中，本发明的抗体经修饰以选择性地阻断在其中抗原结合是有害的组织和环境中的抗原结合，但在有益的情况下允许抗原结合。在一个实施方案中，产生了阻断肽“掩蔽物”，其与抗体的抗原结合表面特异性结合并干扰抗原结合，该掩蔽物通过肽酶可切割的接头与抗体的每个结合臂相连。参见，例如CytomX的美国专利号8,518,404。此类构建体可用于治疗癌症，在该癌症中，与非肿瘤组织相比，在肿瘤微环境中蛋白酶水平大大提高。肿瘤微环境中可切割接头的选择性切割使得掩蔽/阻断肽解离，从而使得在肿瘤中选择性地抗原结合，而不是在抗原结合可能引起不想要的副作用的外周组织中选择性地抗原结合。

可替代地，在相关的实施方案中，开发了包含两个抗原结合域的二价结合化合物(“掩蔽配体”)，其与(二价)抗体的两个抗原结合表面结合并干扰抗原结合，其中两个结合域掩蔽物通过可切割接头(例如可被肽酶切割)彼此连接(但不与抗体相连)。参见例如Tegopharm公司的国际专利申请公开号WO2010/077643。掩蔽配体可以包含或衍生自旨在与抗体结合或者可以独立生成的抗原。这种掩蔽配体可用于治疗癌症，其中与非肿瘤组织相比，在肿瘤微环境中蛋白酶水平大大增加。肿瘤微环境中可切割接头的选择性切割使得两个结合域彼此解离，从而降低了抗体的抗原结合表面的亲合力。所产生的掩蔽配体与抗体的解离使在肿瘤中抗原选择性地结合，而不是在抗原结合可能引起不想要的副作用的外周组织中抗原选择性地结合。

Fc和经修饰的Fc

本发明的抗体可包含本发明的可变域，该可变域与包含不同Fc区的恒定结构域组合，所述恒定域基于用于预期用途的抗体的生物学活性(如果有的话)进行选择。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25：1369。例如，人IgG可以分为四个亚类，分别为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其中这些亚类中每一种都包含具有与一个或多个Fcγ受体(激活性受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA、FcγRIIC(CD32a，c)；FcγRIIIA和FcγRIIIB(CD16a，b)和抑制性受体FcγRIIB(CD32b)结合以及与补体的第一组成(C1q)结合的独特轮廓的Fc区。人IgG1和IgG3与所有Fcγ受体结合；IgG2与FcγRIIAH₁₃₁结合，并且对FcγRIIA_R131FcγRIIIA_V158具有较低的亲和力；IgG4与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIA_V158结合；且抑制性受体FcγRIIB与所有其它Fcγ受体相比对IgG1、IgG2和IgG3具有更低的亲和力。Bruhns等人(2009)Blood 113：3716。研究表明，FcγRI不结合IgG2，且FcγRIIIB不结合IgG2或IgG4。同上。通常，关于ADCC活性，人IgG1≥IgG3＞＞IgG4≥IgG2。结果，例如，IgG1恒定域，而不是IgG2或IgG4，可以被选择用于需要ADCC的药物中；如果表达FcγRIIIA的NK细胞、巨噬细胞的单核细胞被激活，则可以选择IgG3；如果要使用抗体对过敏症患者脱敏，则可以选择IgG4。如果期望抗体缺乏所有效应子功能，也可以选择IgG4。

本文所述的抗huCD40可变区可以连接(例如共价连接或融合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可以是任何同种异型或isoallotype，例如，对于IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；对于IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。参见，例如Jefferis等人(2009)mAbs1：1)。同种异型的选择可能受到潜在的免疫原性问题的影响，例如最小化抗药物抗体的形成。

在一些实施方案中，本发明的抗CD40抗体具有与FcγRIIb结合或具有增强的与FcγRIIb结合的Fc，其可以提供增强的激动作用。参见，例如，WO 2012/087928；和Li&Ravetch(2011)Science 333：1030；Wilson等人(2011)CancerCell 19：101；White等人(2011)J.Immunol.187：1754。本文所述的可变区可以与增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体连接，例如以增强凋亡诱导或佐剂活性。Li&Ravetch(2012)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA109：10966；美国专利申请公开2014/0010812。此类变体可提供具有与FcγRIIb⁺细胞(包括例如B细胞和单核细胞)有关的免疫调节活性的抗体。在一个实施方案中，相对于一种或多种活化受体，Fc变体提供对FcγRIIb的选择性增强的亲和力。这样的变体也可以表现出增强的FcR介导的交联，导致增强的治疗功效。用于改变与FcγRIIb结合的修饰包括在选自根据EU索引的234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332的位置处的一个或多个修饰。用于增强FcγRIIb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcγRIIb结合的其他Fc变体包括235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和267E-328F。具体而言，人IgG1的S267E、G236D、S239D、L328F和I332E变体，包括S267E-L328F双变体，在特异性增强对抑制性FcγRIIb受体的亲和力方面具有特定值。Chu等人(2008)Mol.Immunol.45：3926；美国专利申请公开2006/024298；WO2012/087928。可以通过添加P238D取代和其他突变(Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.&Selection 26：589；WO2012/1152410)以及V262E和V264E(Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135：9723和WO2014/184545)获得对FcγRIIb(区别于FcγRIIa_R131)增强的特异性。参见WO2017/004006。

半衰期延长

在某些实施方案中，所述抗体经修饰以增加其生物学半衰期。多种方法都是可能的。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来完成。在一个实施方案中，如Presta等人在美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的，在CH1或CL区内改变抗体以包含从IgG的Fc区域的CH2域的两个环中获取的救助受体结合表位。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的其他示例性Fc变体包括在位置259、308和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人(2004)J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等人(2006)Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人(2001)Journal of BiologicalChemistry276(9)：6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall′Acqua等人(2002)Journal of Immunology 169：5171-5180，Dall′Acqua等人(2006)Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。参见美国专利号8,367,805。

已经提出了对IgG Fc中某些保守残基(I253、H310、Q311、H433、N434)进行修饰，例如N434A变体(Yeung等人，(2009)J.Immunol.182：7663)作为增加FcRn亲和力的方式，从而增加抗体在循环中的半衰期。参见WO 98/023289。已经显示包含M428L和N434S的组合Fc变体增加FcRn结合并且将血清半衰期增加多达五倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28：157。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体也延长了IgG1抗体的半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18：1759。另外，还显示了包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M和M428L-N434S变体的组合Fc变体延长了半衰期。参见WO 2009/086320。

此外，包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体增加半衰期近4倍。Dall′Acqua等J.Biol.Chem.281：23514。提供了增强的FcRn亲和力但降低的pH依赖性的相关IgG1修饰(M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F)已用于创建IgG1构建体(“MST-HNAbdeg”)，用作竞争剂以防止其他抗体对FcRn的结合，这导致另一种抗体(内源性IgG(例如在自身免疫环境中)或另一种外源性(治疗性)mAb)的清除增加。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23：1283；WO2006/130834。

用于增加FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人(2010)J.Immunol.182：7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；和WO 2002/060919。

在某些实施方案中，杂合IgG同种型可用于增加FcRn结合，并潜在地增加半衰期。例如，可以通过在两个同种型有差异的位置上用来自IgG3的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG1位置来构建IgG1/IgG3杂合变体。因此，可以构建包含一个或多个取代例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F的杂合变体IgG抗体。在本文所述的其他实施方案中，可以通过在两个同种型有差异的位置上用来自IgG1的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可以构建包含一个或多个取代例如以下氨基酸取代中的一个或多个的杂合变体IgG抗体：233E、234L、235L、-236G(其是指在位置236***甘氨酸)和327A。参见美国专利号8,629,113。已经产生了IgG1/IgG2/IgG4序列的杂合体，据称可以增加血清半衰期并改善表达。美国专利号7,867,491(其中序列号18)。

本发明的抗体的血清半衰期也可以通过聚乙二醇化来增加。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了聚乙二醇化抗体，通常在一个或多个PEG基团连接到抗体或抗体片段的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)试剂(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本文所述的抗体。参见例如Nishimura等人的EP 0154316和Ishikawa等人的EP 0401384。

可替代地，在某些情况下，可能期望减少而不是增加本发明的抗体的半衰期。人IgG1的Fc中的修饰如I253A(Homick等(2000)J.Nucl.Med.41：355)和H435A/R、I253A或H310A(Kim等(2000)Eur.J.Immunol.29：2819)能够降低FcRn结合，从而降低半衰期(增加清除率)，以用于优选快速清除的情况，例如医学成像。另参见Kenanova等(2005)CancerRes.65：622。其他增强清除的方式包括将本发明的抗原结合域格式化为缺乏结合FcRn的能力的抗体片段，例如Fab片段。这种修饰可以将抗体的循环半衰期从几周减少到几小时。然后，如有必要，可以使用抗体片段的选择性PEG化来微调(增加)抗体片段的半衰期。Chapman等(1999)Nat.Biotechnol.17：780。抗体片段也可以与人血清白蛋白融合(例如在融合蛋白构建体中)以增加半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 89：1904。可替代地，可以用本发明的第一抗原结合域和与人血清白蛋白(HSA)结合的第二抗原结合结构域构建双特异性抗体。参见国际专利申请公开WO 2009/127691和其中引用的专利参考文献。可替代地，可以将专门的多肽序列添加至抗体片段以增加半衰期，例如，“XTEN”多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27：1186；国际专利申请公开WO 2010/091122。

另外的Fc变体

当使用IgG4恒定域时，通常优选包括取代S228P，其模拟IgG1中的铰链序列并由此稳定IgG4分子，例如减少在治疗的患者中治疗性抗体和内源性IgG4之间的Fab臂交换。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27：767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164：1925。

IgG1构建体的铰链中潜在的蛋白酶切割位点可以通过D221G和K222S修饰来消除，从而增加抗体的稳定性。WO 2014/043344。

Fc变体对其配体(Fc受体)的亲和力和结合特性可以通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，该方法包括但不限于平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如SPR分析)，以及其他方法，例如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱分析(例如凝胶过滤)。这些和其他方法可以在一个或多个被检查的组分上使用标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul，W.E，编辑，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)中找到，其着重于抗体-免疫原相互作用。

在其他实施方案中，修饰抗体的糖基化以增加或减少效应子功能。例如，可以通过突变位置297处的保守的天冬酰胺残基(例如N297A)，从而消除补体和FcγRI结合，来制备缺乏所有效应子功能的无糖基化抗体。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23：403。还参见Tao&Morrison(1989)J.Immunol.143：2595(使用IgG1中的N297Q以消除位置297处的糖基化)。

尽管无糖基化抗体通常缺乏效应子功能，但是可以引入突变以恢复该功能。无糖基化抗体，例如由N297A/C/D/或H突变产生的无糖基化抗体或在不糖基化蛋白质的系统(例如大肠杆菌)中产生的无糖基化抗体，可以进一步突变以恢复FcγR结合，例如S298G和/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)，或E382V和M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 107：604)。

也可以使用糖工程化通过改变在Fc区的Asn297上附接的糖类链的α2，6唾液酸含量来修饰IgG构建体的抗炎特性，其中α2，6唾液酸化形式的比例增加导致增强的抗炎作用。参见Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26：513。相反，在不需要抗炎特性的情况下，降低具有α2，6唾液酸化糖类的抗体的比例可能是有用的。在美国专利申请公开号2008/0206246中提供了修饰抗体的α2，6唾液酸化含量的方法，例如通过选择性纯化α2，6唾液酸化形式或通过酶促修饰。在其他实施方案中，可以例如通过包含F241A修饰来修饰Fc区的氨基酸序列以模拟α2，6唾液酸化的作用。WO 2013/095966。

III.抗体物理性质

本文所述的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。由于改变的抗原结合，这种糖基化位点可导致抗体的免疫原性增加或抗体的pK改变(Marshall等人(1972)Ann.Rev.Biochem.41：673-702；Gala和Morrison(2004)J.Immunol.172：5489-94；Wallick等人(1988)J.Exp.Med.168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol37：697-706)。已经已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。在某些情况下，优选具有不包含可变区糖基化的抗huCD40抗体。这可以通过选择在可变区中不包含糖基化基序的抗体或通过使糖基化区中的残基突变来实现。

在某些实施方案中，本文所述的抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺作用可发生在N-G或D-G序列上，并导致产生异天冬氨酸残基，该残基将纽结引入多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。

每种抗体将具有独特的等电点(pI)，其通常落在6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，且IgG4抗体的pI通常落在6-8的pH范围内。推测pI值超出正常范围的抗体在体内条件下可能具有一些解折叠和不稳定性。因此，优选具有pI值落在正常范围内的抗CD40抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或突变带电荷的表面残基来实现。

每种抗体将具有特征性的解链温度，其中更高的解链温度表明其在体内的整体稳定性更高(Krishnamurthy&Manning(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：361-71)。通常，优选T_M1(初始解折叠的温度)大于60℃，优选大于65℃，甚至更优选大于70℃。抗体的解链点可以使用差示扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett.68：47-52)或圆二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr.Sci.40：343-9)来测量。在优选的实施方案中，选择不会迅速降解的抗体。抗体的降解可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander&Hughes(1995)Ahal Chem.67：3626-32)来测量。

在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体，聚集效应可以导致触发不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。通常，可接受聚集度为25％或更少，优选20％或更少，甚至更优选15％或更少，甚至更优选10％或更少，甚至更优选5％或更少的抗体。可以通过几种技术来测量聚集度，包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射。

IV.核酸分子

本文描述的另一方面涉及编码本文描述的抗体的核酸分子。核酸可以在完整细胞中、在细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl带、柱色谱、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域众所周知的技术从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如，其他染色体DNA，例如与分离的DNA天然连接的染色体DNA)或蛋白质)纯化后，核酸是“分离的”或“呈现为基本纯的”。参见F.Ausubel等，编辑(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，纽约。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在某些实施方案中，核酸是cDNA分子。

本文所述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于通过杂交瘤(例如，从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可从文库中回收编码抗体的核酸。

一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”是指将两个DNA片段连接在一起，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框内。

通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见，例如Kabat，EA等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如，IgG1区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。

通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃)的另一片段可操作地连接，使得VH和VL序列表达为连续单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接在一起(参见例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348：552-554)。

V.抗体生产

产生针对CD40的单克隆抗体的转染瘤的生成

本发明的抗体，包括提供序列的特异性抗体和其他相关的抗CD40抗体，可以使用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。

例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤进行的cDNA克隆)来获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA***表达载体，从而使基因可操作地连接到转录和翻译控制序列上。在上下文中，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以使其与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因***分开的载体中，或者将两个基因***同一表达载体中。通过标准方法(例如，将互补限制位点连接在抗体基因片段和载体上，或者如果不存在限制位点的话则进行平末端连接)将抗体基因***一个或多个表达载体中。通过将本文所述的抗体的轻链和重链可变区***已编码所期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，可以将其用于构建任何抗体同种型的全长抗体基因，从而使V_H区段与载体内的一个或多个C_H区段可操作地连接，并且V_L区段与载体内的C_L区段可操作地连接。另外地或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽在读框内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因外，重组表达载体还可携带调控序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调控序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源的序列组成，例如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子和人1型T细胞白血病病毒的长末端重复序列的序列(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除了抗体链基因和调控序列之外，重组表达载体还可携带另外的序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见，例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因在已引入载体的宿主细胞上赋予对药物如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖很多种通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管从理论上讲有可能在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但在真核细胞中表达抗体是最优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为与原核细胞相比，这种真核细胞，尤其是哺乳动物细胞更可能组装并分泌正确折叠的并且具有免疫活性的抗体。已经报道抗体基因的原核表达对于产生高产率的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。本发明的抗体也可以在酵母毕赤酵母的糖工程化菌株中产生。Li等(2006)Nat.Biotechnol.24：210。

用于表达本文描述的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，如Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中所述，其与DHFR选择标记一起使用，例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养持续足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间段来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

由于通常观察到的翻译后修饰，本发明的抗体多肽链的N末端和C末端可能不同于预期的序列。例如，抗体重链通常缺少C末端赖氨酸残基。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100：1132。N末端谷氨酰胺残基和少量谷氨酸残基经常在治疗性抗体的轻链和重链二者上转化为焦谷氨酸残基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97：544；Liu等人(2011)J.Biol.Chem.286：11211。

在序列表中提供了本发明的各种激动剂抗huCD40抗体的氨基酸序列，其总结于表7中。由于上述原因，C末端赖氨酸不包括在序列表中的重链或重链恒定域的任何序列中。然而，在替代实施方案中，本发明的抗huCD40抗体的每条重链和/或编码此类抗体或其重链或轻链的遗传构建体在一个或两个重链的C末端处包含该额外的赖氨酸残基。

VI.测定

可以通过例如标准ELISA测试本文描述的抗体与CD40的结合。简要地说，微量滴定板用PBS中1-2μg/ml的纯化CD40包被，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白的封闭。将抗体稀释液(例如来自CD40免疫的小鼠的血浆的稀释液)添加到每个孔中，并在37℃下孵育1-2小时。将板用PBS/吐温洗涤，然后与缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的第二试剂(例如，用于人抗体或以其他方式具有人重链恒定区的抗体、山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下孵育1小时。洗涤后，将板用ABTS底物(Moss Inc.，产品：ABTS-1000)显影，并通过分光光度计在OD 415-495进行分析。然后通过流式细胞术进一步筛选结合表达人CD40的细胞系，但不结合不表达CD40的对照细胞系的来自免疫的小鼠的血清。简而言之，通过将表达CD40的CHO细胞与抗CD40抗体以1：20稀释度一起孵育来评估抗CD40抗体的结合。洗涤细胞，并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞术分析。优选地，将产生最高滴度的小鼠用于融合。如果要检测小鼠抗huCD40抗体，则可以使用抗小鼠检测抗体进行类似实验。

如上所述的ELISA可用于筛选抗体，并因此筛选产生与CD40免疫原显示阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可以将产生结合CD40(优选地以高亲和力结合)的抗体的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。然后可以从每种杂交瘤中选择一个保留亲本细胞反应性的克隆(通过ELISA)，以制成细胞库并用于纯化抗体。

为了纯化抗CD40抗体，可以在两升旋转瓶中培养所选的杂交瘤，用于进行单克隆抗体纯化。可以过滤上清液并浓缩，然后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲溶液更换至PBS中，可以通过OD₂₈₀使用1.43消光系数确定浓度。单克隆抗体可以等分并保存在-80℃。

为了确定所选择的抗CD40单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)对每种抗体进行生物素化。可以用链霉亲和素标记的探针检测生物素化的MAb结合。如上所述，可以使用CD40包被的ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。

为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白将微量滴定板的孔包被过夜。用1％BSA封闭后，使板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化同种型对照在环境温度下反应一至两个小时。然后可以将孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。如上所述对板进行显影和分析。

为了测试单克隆抗体与表达CD40的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简而言之，将表达膜结合的CD40的细胞系(在标准生长条件下生长)与在含有0.1％BSA的PBS中的各种浓度的单克隆抗体在4℃下混合1小时。洗涤后，将细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体在与一抗染色相同的条件下反应。样品可以通过FACScan仪器使用光和侧向散射特性进行分析，以门控单个细胞，并确定标记的抗体的结合。除了或代替流式细胞术测定法，可以使用利用荧光显微镜的替代测定法。可以如上所述恰当地将细胞染色，并通过荧光显微镜检查。这种方法允许可视化单个细胞，但是根据抗原的密度，其灵敏度可能会降低。

可以通过蛋白质印迹进一步测试抗huCD40抗体与CD40抗原的反应性。简而言之，可以制备来自表达CD40的细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)显影。

用于分析各种抗CD40抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定法，例如，生物层干涉法(BLI)分析和使用

2000SPR仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)的表面等离振子共振(SPR)。

在一个实施方案中，抗体特异性结合人CD40的细胞外区域。抗体可以与CD40的细胞外域内的特定域(例如，功能性域)特异性结合。在某些实施方案中，抗体特异性结合人CD40的细胞外区域和食蟹猴CD40的细胞外区域。优选地，抗体以高亲和力结合人CD40。

VII.双特异性分子

本文所述的抗体可用于形成双特异性分子。抗CD40抗体或其抗原结合片段可以被衍生为或连接至另一功能性分子，例如另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体)，以产生与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。实际上，本文描述的抗体可以被衍生为或连接至多于一个其他功能性分子，以产生与多于两个不同的结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也意图被本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本文所述的双特异性分子，本文所述的抗体可以功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其它结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。

因此，本文提供了双特异性分子，其包含针对CD40的至少一个第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。在本文所述的双特异性分子是多特异性的实施方案中，该分子可以进一步包括第三结合特异性。

在一个实施方案中，本文所述的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，所述抗体片段包括例如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或如Ladner等人的美国专利号4,946,778所述的单链构建体，其内容通过引用明确并入。

尽管优选人单克隆抗体，但是可以在本文所述的双特异性分子中使用的其他抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。

本文所述的双特异性分子可以通过使用本领域已知的方法缀合多个组分结合特异性来制备。例如，双特异性分子的每个结合特异性可以分别产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二顺丁烯二酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)和Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中所述的方法。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。

当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合进行缀合。在特别优选的实施方案中，在缀合之前，修饰铰链区以包含奇数个巯基残基，优选一个。

可替代地，两个结合特异性都可以在相同的载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)₂或配体x Fab融合蛋白时，此方法特别有用。本文所述的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者可以是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498和5,482,858。

双特异性分子与其特定靶标的结合可以使用本领域公认的方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或蛋白质印迹分析。这些测定法中的每一种通常通过采用对感兴趣的复合物特异的标记的试剂(例如抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。

VIII.组合物

还提供了组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。此类组合物可包含本文所述的(例如，两种或更多种不同的)抗体或免疫缀合物或双特异性分子中的一种或组合。例如，本文所述的药物组合物可包含结合至靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性抗体)的组合。

在某些实施方案中，组合物包含浓度为至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml或1-300mg/ml或100-300mg/ml的抗CD40抗体。

本文所述的药物组合物也可以在组合疗法中施用，即与其他药剂组合施用。例如，组合疗法可包括与至少一种其他抗癌和/或T细胞刺激(例如，活化)剂组合的本文所述的抗CD40抗体。可以在组合疗法中使用的治疗剂的实例在下文关于本文所述抗体的用途的部分中更详细地描述。

在一些实施方案中，本文公开的治疗性组合物可包括用于治疗癌症的其他化合物、药物和/或药剂。这样的化合物、药物和/或药剂可以包括例如刺激针对给定癌症的免疫应答的化学疗法药物、小分子药物或抗体。在一些情况下，治疗性组合物可以包括例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体、抗LAG-3抗体、抗CD73抗体、抗CD 137抗体、抗CD27抗体、抗CSF-1R抗体、TLR激动剂或IDO或TGFβ的小分子拮抗剂中的一种或多种。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物，即抗体、免疫缀合物或双特异性分子，包被在一种材料中，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的作用。

本文所述的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所期望的生物学活性并且不赋予任何非期望的毒理作用的盐(参见例如，Berge，SM等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些盐，以及衍生自无毒有机酸(例如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的盐，以及衍生自无毒有机胺(例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)。

本文所述的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本文所述的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油、以及可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料例如卵磷脂在分散液的情况下通过保持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

这些组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本文所述的药物组合物中。补充活性化合物也可以掺入组合物中。

治疗性组合物通常必须在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序(ordered)结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与上述列举的成分中的一种或多种组合掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上文列举的那些的所需的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何额外期望的成分的粉末。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗作用的组合物的量。通常，在百分之一百中，该量的范围为约0.01％至约99％活性成分，优选地为约0.1％至约70％，最优选地为约1％至约30％活性成分，其与药学上可接受的载体的组合。

调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗性应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物特别有利于易于施用和剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算可与所需的药物载体一起产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本文所述的剂量单位形式的规格由以下因素决定并且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗作用，以及(b)配混这种活性化合物的技术领域中对于治疗个体敏感性的固有的局限性。

对于抗体的施用，剂量的范围为宿主体重的约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg。例如剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三到六个月一次施用。

在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量落在所示范围内。通常在多个场合下施用治疗性抗体。单一剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。在某些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在某些方法中，约为25-300μg/ml。

抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于患者中抗体的半衰期。通常，人抗体显示最长的半衰期，其后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者终生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔使用相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，尽管在许多免疫肿瘤学指征中并不需要持续治疗，但是可以任选地对患者施用预防性方案。

本文所述的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于特定患者、组合物和施用方式而言有效达到所期望的治疗性应答同时对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括采用的本文所述的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、采用的特定化合物的***速率、治疗持续时间，与所使用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、总体健康状况和既往病史以及在医学领域众所周知的类似因素。

本文描述的抗CD40抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重性降低、无疾病症状时期的频率和持续时间增加，预防由于疾病折磨引起的损害或残疾。在癌症的情况下，治疗有效剂量优选防止与癌症有关的身体症状的进一步恶化。癌症的症状在本领域中是众所周知的，且包括例如异常的痣特征、痣外观的变化(包括不对称性、边界、颜色和/或直径、新近着色的皮肤区域、异常痣)、指甲下变暗的区域、***肿块、***变化、***囊肿、***疼痛、死亡、体重减轻、无力、过度疲劳、进食困难、食欲不振、慢性咳嗽、呼吸困难、咳血、尿血、便血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹部饱胀感、腹胀、腹腔积液、***出血、便秘、腹部饱胀感、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发烧、疼痛)、疼痛、呕血、大量出汗、发烧、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、发冷、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾脏转移和胰腺转移、吞咽困难等。在第一次施用本发明的激动性抗huCD40 mAb后，可以立即观察到治疗效果，或者只能在一段时间和/或一系列剂量后才能观察到治疗效果。只有在治疗数月，长达6、9或12个月后，才能观察到这种延迟的效果。考虑到某些免疫肿瘤剂显示的延迟的效果，至关重要的是不能过早地确定本发明的激动性抗huCD40 mAb缺乏治疗功效。

治疗有效剂量可以预防或延迟癌症的发作，例如当存在疾病的早期或初步体征时治疗有效剂量可能是期望的。用于诊断癌症的实验室测试包括化学方法(包括可溶性CD40或CD40L水平的测量)(Hock等人(2006)Cancer 106：2148；Chung&Lim(2014)J.Trans.Med.12：102)、血液学、血清学和放射学。因此，监测前述任何一种的任何临床或生化测定可用于确定特定治疗是否是用于治疗癌症的治疗有效剂量。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的身材、受试者的症状的严重程度以及所选择的特定组合物或施用途径这样的因素来确定所述量。

本文所述的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据所期望的结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可替代地，本文所述的抗体可以通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部施用。

活性化合物可以与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控释配制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或是本领域技术人员通常已知的。参见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

可使用本领域已知的医疗装置施用治疗性组合物。例如，在优选的实施方案中，可以使用无针皮下注射装置施用本文所述的治疗性组合物，例如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。与本文所述的抗huCD40抗体一起使用的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控的速率分配药物的可植入的微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种通过皮肤施用药物的治疗性装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多腔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，可以配制本文所述的抗huCD40抗体以确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水的化合物。为了确保本文所述的治疗性化合物穿过BBB(如果需要的话)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一个或多个部分，所述一个或多个部分被选择性地运输到特定细胞或器官中，从而增强靶向药物的递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；和p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

IX.用途和方法

本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有很多体外和体内效用，涉及例如通过激动CD40信号传导来增强免疫应答。在一个优选的实施方案中，本文描述的抗体是人或人源化抗体。例如，本文所述的抗huCD40抗体可以在体外或离体施用至培养中的细胞，或例如在体内施用给人类受试者，以增强在多种疾病中的免疫力。因此，本文提供了改变受试者中免疫应答的方法，其包括向受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段，从而增强、刺激或上调受试者中的免疫应答。

优选的受试者包括期望增强免疫应答的人类患者。该方法特别适用于治疗患有可以通过增强免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答)来治疗的疾病的人类患者。在一个特定的实施方案中，该方法特别适合于在体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将本文所述的抗huCD40抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者该抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如，携带肿瘤或携带病毒的受试者)。当针对CD40的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以分开或同时施用。

还包括用于检测样品中人CD40抗原的存在或测量人CD40抗原的量的方法，其包括在允许抗体或其片段与人CD40之间形成复合物的条件下，使样品和对照样品与特异性结合人CD40的人单克隆抗体或其抗原结合片段接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比样品之间的复合物形成差异表明样品中存在人CD40抗原。此外，本文所述的抗CD40抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人CD40。

鉴于本文所述的抗huCD40抗体具有增强T细胞应答(例如抗原特异性T细胞应答)共刺激的能力，本文提供了使用本文所述的抗体刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答，例如抗肿瘤T细胞应答的体外和体内方法。可以使用抗CD40抗体增强CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。T细胞可以是T_eff细胞，例如CD4+T_eff细胞、CD8+T_eff细胞、T辅助细胞(T_h)和T细胞毒性(T_c)细胞。

进一步包括增强受试者中免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)的方法，其包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而使受试者中的免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)增强。在一个优选的实施方案中，所述受试者是携带肿瘤的试者，并且增强了针对所述肿瘤的免疫应答。肿瘤可以是实体瘤或液体瘤，例如血液系统恶性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阴性的。受试者也可以是携带病毒的受试者，并且增强了对该病毒的免疫应答。

进一步提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而抑制受试者中肿瘤的生长。还提供了治疗受试者中慢性病毒感染的方法，其包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而治疗受试者中的慢性病毒感染。

在某些实施方案中，将抗huCD40抗体作为辅助疗法给予受试者。相对于目前的护理标准，用抗huCD40抗体治疗患有癌症的受试者可导致长期的持久应答；至少1、2、3、4、5、10年或更多年的长期生存期，至少1、2、3、4、5或10年或更多年的无复发生存期。在某些实施方案中，用抗huCD40抗体治疗患有癌症的受试者预防癌症的复发或将癌症的复发延迟例如1、2、3、4、5或10年或更长时间。抗CD40治疗可以用作治疗的一线或二线。

下面进一步详细讨论本文所述的这些和其他方法。

癌症

本文提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而使所述受试者得到治疗，例如，使得癌性肿瘤的生长被抑制或减少和/或肿瘤消退。可以单独使用抗huCD40抗体来抑制癌性肿瘤的生长。可替换地，抗huCD40抗体可以与另一药剂，例如其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体结合使用，如下所述。还提供了与PD-1的抑制剂，例如抗PD-1或抗PD-L1抗体的组合。参见，例如，Ellmark等人(2015)OncoImmunology 4：7e1011484。

因此，本文提供了治疗受试者中的癌症的方法，例如通过抑制肿瘤细胞生长，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗huCD40抗体，例如人源化形式的12D6、5F11、8E8、5G7或19G3，或其抗原结合片段。该抗体可以是人源化抗huCD40抗体(例如本文所述的任何人源化抗huCD40抗体)、人嵌合抗huCD40抗体、或人源化非人抗huCD40抗体，例如人、嵌合或人源化抗huCD40抗体，其与至少一种本文具体描述的抗huCD40抗体竞争结合，或与至少一种本文具体描述的抗huCD40抗体结合相同表位。

使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。治疗的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌(例如明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、***癌(例如激素难治性***腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、子***、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或癌)、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞(sinonasal natural killer)、黑色素瘤(例如转移性恶性肿瘤，如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、***区域癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、儿童期实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括石棉诱导的癌症，病毒有关的癌症(例如人***瘤病毒(HPV)有关的肿瘤)、和源自两种主要血细胞谱系中的任一个(即，髓样细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))的血液系统恶性肿瘤，例如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤(例如，急性、慢性、淋巴细胞和/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(M0)、成髓细胞性白血病(M1)、成髓细胞性白血病(M2；细胞成熟)、前髓细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞性白血病(M4或伴嗜酸性粒细胞增多症的M4变体[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、成巨核细胞性白血病(M7)、孤立性粒细胞肉瘤和绿色瘤)；淋巴瘤、例如霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管成免疫细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠道T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤、T成淋巴细胞；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、真正的组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤(LBL)、造血淋巴谱系肿瘤、急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞淋巴瘤(DHL)、成免疫细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样真菌病或Sezary综合征)、以及伴有Waldenstrom巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、郁积型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤、间质起源的肿瘤(包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)；***瘤、畸胎瘤、中枢神经和外周神经肿瘤(包括星形细胞瘤、神经鞘瘤)；间充质起源的肿瘤(包括纤维肉瘤、横纹肌瘤和骨肉瘤)；以及其他肿瘤(包括黑色素瘤、色素性干皮病、角质层棘皮瘤、***瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤)、淋巴谱系的造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞疾病(例如T前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，其包括小细胞和脑型细胞类型)；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选是T细胞型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形和成免疫细胞亚型)；血管中心性(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性髓样淋巴瘤，以及上述癌症的任何组合。本文所述的方法还可用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如，对先前的免疫疗法难治的癌症，例如用阻断性CTLA-4或PD-1抗体)和复发性癌症。

尽管如此，本发明的激动剂抗huCD40抗体不会用于治疗具有CD40表达的血液系统癌症，其可通过用CD40激动剂的治疗而恶化。已知某些癌症表达CD40，因此经历此类恶化，因此可以被绝对排除。在其他实施方案中，基于测试结果，测试特定的肿瘤样品的CD40表达并将其排除在本发明的激动剂抗huCD40抗体的疗法之外。

抗huCD40抗体可以作为单一疗法或作为唯一的免疫刺激疗法来施用，或者可以在癌症疫苗策略中与免疫原性药剂联合施用，免疫原性药剂例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖类分子)、细胞和用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。已经设计了许多用于针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg，S.，2000，Development of Cancer Vaccines，ASCO Educational BookSpring：60-62；Logothetis，C.，2000，ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCO Educational BookSpring：730-738；还参见DeVita等人(编辑)，1997，Cancer：Principles and Practice ofOncology,第5版中的Restifo，N.和Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp.3023-3043)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已经显示出当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗是最有效的。已显示GM-CSF是一种有效的用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递激活剂。Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3539-43。

对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究导致了所谓的肿瘤特异性抗原的定义。Rosenberg，SA(1999)Immunity10：281-7。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和由其产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。CD40激动剂可以与在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合结合使用，以产生针对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，因此对于免疫系统来说是耐受的。肿瘤抗原可以包括蛋白质端粒酶，其是染色体端粒合成所必需的，并且在超过85％的人类癌症中以及仅在有限数量的体细胞组织中表达(Kim等人(1994)Science 266：2011-2013)。肿瘤抗原也可以是癌细胞中的由于体细胞突变而表达的“新抗原”，或来自B细胞肿瘤的独特型，该体细胞突变改变蛋白质序列或在两个不相关序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白。

其他肿瘤疫苗可包括来自与人类癌症有关的病毒的蛋白质，例如人类***瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与CD40抑制结合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白的片段，并且这些HSP在递送至抗原呈递细胞以引起肿瘤免疫的方面的效率很高(Suot&Srivastava(1995)Science 269：1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278：117-120)。

树突状细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，可用于引发抗原特异性应答。DC可以离体产生并装载有多种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人(1998)NatureMedicine 4：328-332)。也可以通过遗传手段转导DC以表达这些肿瘤抗原。为了免疫的目的，DC也已经与肿瘤细胞直接融合(Kugler等人(2000)NatureMedicine 6：332-336)。作为一种疫苗接种方法，DC免疫可以与CD40激动剂有效组合以激活(释放)更有效的抗肿瘤应答。

CD40的激动作用也可以与标准的癌症治疗(例如手术、放射和化学疗法)组合。CD40的激动作用可以有效地与化学疗法方案相结合。在这些情况下，有可能减少所施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research58：5301-5304)。这种组合的实例是抗huCD40抗体与氮烯咪胺组合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一实例是抗huCD40抗体与白介素-2(IL-2)的组合用于治疗黑素瘤。CD40激动剂与化学疗法组合使用背后的科学依据是，细胞死亡是大多数化学治疗性化合物的细胞毒作用的结果，其应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的提高。可通过细胞死亡与CD40激动剂协同作用的其他组合疗法是放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可与CD40激动剂组合使用。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，肿瘤细胞死亡可将肿瘤抗原提供至宿主抗原呈递途径中。

本文所述的抗huCD40抗体还可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见，例如，美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可用于靶向两个单独的抗原。例如抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性抗体已用于将巨噬细胞靶向至肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。通过CD40的激动作用会增强这些应答的T细胞臂。或者，可通过使用与肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标志物结合的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。

肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中的许多机制都可以通过使肿瘤表达的免疫抑制蛋白失活来克服。这些包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard&O′Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)和Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。这些实体中的每一种的抗体都可以与抗huCD40抗体组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并促进宿主的肿瘤免疫应答。

抗CD40抗体能够有效替代T细胞辅助活性。Ridge等人(1998)Nature 393：474-478。针对T细胞共刺激分子的活化抗体也可以提供增加水平的T细胞活化，该T细胞共刺激分子例如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol.164：2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero等人Nature Medicine 3：682-685(1997))和ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397：262-266)。

还存在以下几种实验性治疗方案，其涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增，以及将这些细胞过继性转移至受体中，以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell(1999)Science 285：546-51)。这些方法也可以用于激活对致病因子诸如CMV的T细胞应答。在抗CD40抗体存在下的离体激活可以增加过继性转移的T细胞的频率和活性。

慢性病毒感染

在另一方面，本文描述的发明提供了一种治疗受试者中的感染性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而治疗该受试者的该感染性疾病。

类似于上文所讨论的其在肿瘤中的应用，抗体介导的CD40激动作用可以单独使用，也可以作为佐剂与疫苗结合使用，以增强对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可能特别有用的病原体的实例包括目前尚无有效疫苗的病原体，或常规疫苗不能完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(A、B和C)、流感、疱疹、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。CD40激动作用特别适用于对抗诸如HIV之类在感染过程中呈递改变的抗原的病原体的感染。在施用抗人CD40抗体时，这些新的表位被认为是外来的，因此引发了强烈的T细胞应答。

导致可通过本文描述的方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒，风疹病毒，细小病毒，牛痘病毒，HTLV病毒，登革热病毒、***瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎(arboviralencephalitis)病毒。

可通过本文描述的方法治疗的引起感染的病原细菌的一些实例包括衣原体、立克次氏体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和***、克雷伯菌、变形杆菌、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆斯病细菌。

可通过本文描述的方法治疗的引起感染的病原性真菌的一些实例包括假丝酵母(白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母(glabrata)、热带假丝酵母(tropicalis)等)、新隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉属(Aspergillus)(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)等)、毛霉属(Mucorales)(毛霉(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉(rhizopus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生霉菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。

可通过本文所述的方法治疗的引起感染的病原性寄生虫的一些实例包括痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘变形虫属种(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。

在所有上述方法中，CD40激动作用可以与其他形式的免疫疗法结合，例如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体治疗，其提供了增强了肿瘤抗原的呈递。参见例如Holliger(1993)Holliger Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123。

疫苗佐剂

本文所述的抗huCD40抗体可通过将抗huCD40抗体与感兴趣的抗原例如疫苗共同施用而用于增强抗原特异性免疫应答。因此，本文提供了增强受试者中对抗原的免疫应答的方法，其包括对受试者施用：(i)抗原；和(ii)抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而增强受试者中对该抗原的免疫应答。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括以上部分中讨论的抗原，例如以上讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)，或来自以上所述的病毒、细菌或其他病原体的抗原。

在体内和体外施用本文描述的抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的合适途径是本领域众所周知的，并且可以由普通技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或配制剂。

如前所述，本文所述的抗huCD40抗体可以与一种或多种其他治疗剂例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂共同施用。抗体可以与该药剂连接(作为免疫复合物)或可以与该药剂分开施用。在后一种情况下(分开施用)，抗体可以在该药剂之前、之后或同时施用，或者可以与其他已知疗法例如抗癌疗法例如放射共同施用。这类治疗剂包括，尤其，抗肿瘤剂，例如阿霉素(亚德里亚霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氮烯唑胺和环磷酰胺羟基脲，这些治疗剂本身只有在对患者有毒性或亚毒性的水平才有效。每四周一次以100mg/ml的剂量静脉内施用顺铂，每21天一次以60-75mg/ml的剂量静脉内施用亚德里亚霉素。本文描述的抗CD40抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共同施用提供两种抗癌剂，其通过不同的机理起作用，所述不同机理产生对人肿瘤细胞的细胞毒性作用。这种共同给药能够解决由于发展出对药物的抗性或肿瘤细胞的抗原性改变(这将使它们与该抗体不反应)而导致的问题。

还包含在本文所述的范围内的是包含本文所述的抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。试剂盒可进一步包含至少一种另外的试剂，或本文所述的一种或多种另外的人抗体(例如，具有互补活性的人抗体，其与不同于第一人抗体的CD40抗原中的表位结合)。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或试剂盒附带提供或以其他方式随试剂盒附带的任何文字或记录材料。

组合疗法

除了以上提供的组合疗法外，本文所述的抗CD40抗体还可用于组合疗法，例如，用于治疗癌症，如下所述。

本发明提供组合治疗的方法，其中将抗huCD40抗体与一种或多种有效刺激免疫应答从而进一步增强、刺激或上调受试者的免疫应答的另外药剂例如抗体共同施用。

通常，本文所述的抗huCD40抗体可以与(i)另一种共刺激受体的激动剂和/或(ii)T细胞上抑制信号的拮抗剂组合，这两者中的任一个均导致放大抗原特异性T细胞应答(免疫检查点调节剂)。大多数共刺激和共抑制分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员，并且本文所述的抗CD40抗体可以与靶向IgSF家族的成员的药剂一起施用以增加免疫应答。与共刺激或共抑制受体结合的膜结合配体的一个重要家族是B7家族，包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6。与共刺激或共抑制受体结合的膜结合配体的另一家族是与同源TNF受体家族成员结合的TNF分子家族，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(参见，例如，Tansey(2009)Drug Discovery Today 00：1)。

另一方面，抗huCD40抗体可以与抑制T细胞活化的细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF)或其他“免疫抑制性细胞因子”的拮抗剂，或刺激T细胞活化的细胞因子组合使用，以刺激免疫应答，例如用于治疗增生性疾病，例如癌症。

在一方面，可以通过将本发明的抗huCD40 mAb与以下一种或多种组合来刺激T细胞应答：(i)抑制T细胞活化的蛋白质(例如免疫检查点抑制剂)(例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4)的拮抗剂以及(ii)刺激T细胞活化的蛋白质(例如，B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H)的激动剂。

调节上述蛋白质之一并且可以与激动剂抗huCD40抗体(例如本文所述的那些)组合以治疗癌症的示例性药剂包括：/伊匹单抗或tremelimumab(抗CTLA-4)、galiximab(抗B7.1)、BMS-936558(抗PD-1)、pidilizumab/CT-011(抗PD-1)、/派姆单抗/MK-3475(抗PD-1)、AMP224(抗B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(抗B7-H1)、MPDL3280A(抗B7-H1)、MEDI-570(抗ICOS)、AMG557(抗B7H2)、MGA271(抗B7H3-WO11/109400)、IMP321(抗LAG-3)、urelumab/BMS-663513和PF-05082566(抗CD137/4-1BB)、varlilumab/CDX-1127(抗CD27)、MEDI-6383和MEDI-6469(抗OX40)、RG-7888(抗OX40L-WO06/029879)、阿塞西普(Atacicept)(抗TACI)、莫罗单抗-CD3(抗CD3)、ipilumumab(抗CTLA-4)。

可以与激动剂抗huCD40抗体组合用于治疗癌症的其他分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的活化性受体的激动剂。例如，激动剂抗huCD40抗体可以与KIR的拮抗剂(例如lirilumab)组合。

用于联合疗法的其他药物包括抑制或消耗巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO 11/70024、WO 11/107553、WO11/131407、WO 13/87699、WO 13/119716、WO 13/132044)或FPA-008(WO 11/140249；WO 13/169264；WO 14/036357)。

通常，本文所述的激动剂抗huCD40抗体可以与一种或多种连接阳性共刺激受体的激动剂中的一种或多种、减弱经由抑制性受体的信号传导的阻断剂、以及全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的一种或多种药剂、克服肿瘤微环境内不同免疫抑制途径(例如，阻断抑制性受体啮合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗尽或抑制Treg(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如，达利珠单抗))或通过离体抗CD25珠粒耗尽)、抑制代谢酶(如IDO)或逆转/预防T细胞无能或耗竭)的药剂、以及引起先天性免疫激活和/或肿瘤部位炎症的药剂一起使用。

本文提供了刺激受试者中免疫应答的方法，其包括向受试者施用CD40激动剂，例如抗体，和一种或多种另外的免疫刺激性抗体，例如PD-1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、PD-L1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、CTLA-4拮抗剂(例如拮抗剂抗体)和/或LAG3拮抗剂(例如拮抗剂抗体)，从而刺激受试者的免疫应答，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一个实施方案中，向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗PD-1抗体。在一个实施方案中，向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，至少一种另外的免疫刺激抗体(例如拮抗剂抗PD-1、拮抗剂抗PD-L1、拮抗剂抗CTLA-4和/或拮抗剂抗LAG3抗体)是人抗体。可替代地，至少一种另外的免疫刺激性抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(例如，自小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4和/或抗LAG3抗体所制备的)。

本文提供了用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂PD-1抗体。在某些实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗PD-1抗体以亚治疗剂量施用，或两者均以亚治疗剂量施用，其中亚治疗设计参考使用要考虑的药剂的单一疗法。本文还提供了用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在某些实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体，且激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，例如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。

适用于本文所述方法的PD-1拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如，单克隆抗体和双特异性抗体)和多价药剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。

示例性抗PD-1抗体是

/纳武单抗(BMS-936558)或包含WO 2006/121168中所述的抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4和4A11之一的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是WO 2012/145493中所述的MK-3475(/派姆单抗/以前为lambrolizumab)；在WO 2012/145493中描述的AMP-514/MEDI-0680；和CT-011(pidilizumab；以前为CT-AcTibody或BAT；参见，例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunotherapy 34：409)。其他已知的PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括在WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149、和美国专利公开号2009/0317368中公开的那些。也可使用WO2013/173223中公开的任何抗PD-1抗体。与这些抗体之一竞争性结合、和/或结合与这些抗体之一相同的PD-1上的表位的抗PD-1抗体也可以在联合治疗中使用。

在某些实施方案中，抗PD-1抗体以5×10^-8M或更小的K_D结合人PD-1，以1×10^-8M或更小的K_D结合人PD-1，以5×10^-9M或更小的K_D结合人PD-1，或以1×10^-8M至1×10^-10M或更小之间的K_D结合人PD-1。

本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂PD-L1抗体。在某些实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗PD-L1抗体以亚治疗剂量施用，或两者均以亚治疗剂量施用。本文提供用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病相关的不良事件的方法，该方法包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体，且激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，例如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。

在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(在WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中称为12A4)、MSB0010718C(WO 2013/79174)或包含在PCT公开WO 07/005874和美国专利号7,943,743中所述的3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(也称为抗B7-H1)或MPDL3280A(也称为RG7446)。也可以使用在WO 2013/173223、WO 2011/066389、WO 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国公开号2009/145493中公开的任何抗PD-L1抗体。与这些抗体任一竞争和/或结合与这些抗体任一的表位相同的表位的抗PD-L1抗体也可以在联合治疗中使用。

在又一个实施方案中，本发明的激动剂抗huCD40抗体与PD-1/PD-L1信号传导的拮抗剂(例如PD-1拮抗剂或PD-L1拮抗剂)组合，与第三免疫治疗剂组合。在一个实施方案中，第三免疫治疗剂是GITR拮抗剂或OX-40拮抗剂，例如本文公开的抗GITR或抗OX40抗体。

在另一方面，所述免疫肿瘤剂是GITR激动剂，例如激动性GITR抗体。合适的GITR抗体包括例如BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO 06/105021、WO 09/009116)和MK-4166(WO 11/028683)。

在另一方面，所述免疫肿瘤剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括，例如INCB-024360(WO 2006/122150、WO 07/75598、WO 08/36653、WO 08/36642)、indoximod或NLG-919(WO 09/73620、WO 09/1156652、WO 11/56652、WO 12/142237)。

本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用本文所述的激动剂抗huCD40抗体和CTLA-4拮抗剂抗体。在某些实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗CTLA-4抗体以亚治疗剂量施用，或两者均以亚治疗剂量施用，其中亚治疗设计参考使用要考虑的药剂的单一疗法。本文提供了用于改变使用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病相关的不良事件的方法，该方法包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体是选自以下的抗体：(伊匹单抗或抗体10D1，在PCT公开WO 01/14424中描述)、tremelimumab(以前为ticilimumab、CP-675,206)和在以下出版物中描述的抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：Abstract No.2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等人(1998)CancerRes.58：5301-5304。也可以使用WO 2013/173223中公开的任何抗CTLA-4抗体。

本文提供用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和抗LAG-3抗体。在进一步的实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗LAG-3抗体以亚治疗剂量施用，或两者均以亚治疗剂量施用。本文提供用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗LAG-3抗体。在某些实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，抗LAG-3抗体是人序列单克隆抗体，且激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，例如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。抗LAG3抗体的实例包括包含在美国专利公开号US 2011/0150892和WO 2014/008218中描述的抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可以使用的其他本领域公认的抗LAG-3抗体包括US 2011/007023中描述的IMP731。也可以使用IMP-321。与这些抗体任一竞争和/或结合与这些抗体任一的表位相同的表位的抗LAG-3抗体也可以在联合治疗中使用。

在某些实施方案中，抗LAG-3抗体以5×10^-8M或更小的K_D结合人LAG-3，以1×10^-8M或更小的K_D结合人LAG-3，以5×10^-9M或更小的K_D结合人LAG-3，或以1×10^-8M至1×10^-10M或更小之间的K_D结合人LAG-3。

施用本文所述的激动剂抗huCD40抗体和针对一种或多种第二靶抗原如LAG-3和/或CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的拮抗剂(例如拮抗剂抗体)可以增强患者中对癌细胞的免疫应答。使用本公开的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。用本公开的联合疗法治疗的癌症的代表性实例包括以上在用激动剂抗huCD40抗体的单一疗法的讨论中具体列出的那些癌症。

在某些实施方案中，本文讨论的治疗性抗体的组合可以作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用，或者作为在药学上可接受的载体中的具有每种抗体的单独的组合物同时施用。在另一个实施方案中，可以顺序施用治疗性抗体的组合。例如，可以顺序施用抗CTLA-4抗体和激动剂抗huCD40抗体，例如首先施用抗CTLA-4抗体，然后施用激动剂抗huCD40抗体，或者首先施用激动剂抗huCD40抗体，然后是抗CTLA-4抗体。另外地或可替代地，抗PD-1抗体和激动剂抗huCD40抗体可以顺序施用，例如首先施用抗PD-1抗体，然后施用激动剂抗huCD40抗体；或首先施用激动剂抗huCD40抗体，然后是抗PD-1抗体。另外地或可替代地，抗PD-L1抗体和激动剂抗-huCD40抗体可以顺序施用，例如首先施用抗PD-L1抗体，然后施用激动剂抗-huCD40抗体，或首先施用激动剂抗-huCD40抗体，然后施用抗PD-L1抗体。另外地或可替代地，可以顺序施用抗LAG-3抗体和激动剂抗huCD40抗体，例如首先施用抗LAG-3抗体，然后施用激动剂抗huCD40抗体，或首先施用激动剂抗huCD40抗体，然后施用抗LAG-3抗体。

此外，如果顺序施用多于一个剂量的联合疗法，则在每个施用时间点，顺序施用的顺序可以颠倒或保持相同的顺序，可以将顺序施用与同时施用组合，或它们的任何组合。例如，抗CTLA-4抗体和激动剂抗huCD40抗体的组合的第一次施用可以同时进行，第二次施用可以是首先抗CTLA-4抗体然后激动剂抗huCD40抗体顺序进行，第三次施用可以是首先激动剂抗huCD40抗体然后抗CTLA-4抗体顺序进行，等等。另外地或可替代地，抗PD-1抗体和激动剂抗-uCD40抗体的组合的第一次施用可以同时进行，第二次施用可以是首先抗PD-1抗体然后激动剂抗huCD40抗体顺序进行，并且第三次施用可以是首先激动剂抗huCD40抗体然后抗PD-1抗体顺序进行，等等。另外地或可替代地，抗PD-L1抗体和激动剂抗huCD40抗体的组合的第一次施用可以同时进行，第二次施用可以是首先抗PD-L1抗体然后激动剂抗huCD40抗体顺序进行，并且第三次施用可以是首先激动剂抗huCD40抗体然后抗PD-L1抗体顺序进行，等等。另外地或可替代地，抗LAG-3抗体和激动剂抗huCD40抗体的组合的第一次施用可以同时进行，第二次施用可以是首先抗LAG-3抗体然后激动剂抗huCD40抗体顺序进行，并且第三次施用可以是首先激动剂抗huCD40抗体然后抗LAG-3抗体顺序进行，等等。另一代表性给药方案可以可以涉及按首先激动剂抗huCD40然后抗CTLA-4抗体(和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)顺序的第一次施用，并且随后的施用可以是同时的。任选地，作为唯一的免疫治疗剂的激动剂抗huCD40，或激动剂抗huCD40抗体与一种或多种另外的免疫治疗性抗体(例如，抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3)的组合可以进一步与免疫原性药剂结合，例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步讨论)。CD40激动剂和一种或多种另外的抗体(例如，CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂)也可以与标准的癌症治疗进一步组合。例如，CD40激动剂和一种或多种另外的抗体(例如，CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂)可以有效地与化疗方案组合。在这些情况下，有可能减少与本公开内容的组合一起施用的其他化学治疗剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research58：5301-5304)。这种组合的实例是具有或不具有另外的抗体(例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)的CD40激动剂抗体的组合，进一步与达卡巴嗪组合用于治疗黑素瘤。另一个实例是具有或不具有抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体的激动剂抗huCD40抗体的组合，进一步与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂与化学疗法联合使用背后的科学原理是细胞死亡(这是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果)应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平升高。可以导致与具有或不具有CDLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂的组合的CD40激动剂通过细胞死亡形成协同作用的其它组合疗法包括放射、手术或激素剥夺。这些方案中的每一个在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与组合的CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可能是进入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。

作为唯一的免疫治疗剂的激动剂抗huCD40抗体，或CD40激动剂与CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断抗体的组合也可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用。参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243。双特异性抗体可用于靶向两个单独的抗原。通过使用组合的CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂，可以增强这些应答的T细胞臂。

在另一个实例中，作为唯一的免疫治疗剂的激动性抗CD40抗体或抗CD40抗体与另外的免疫刺激剂(例如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或LAG-3药剂(例如抗体))的组合，可以与抗肿瘤抗体(如(利妥昔单抗)、(曲妥珠单抗)、(托莫西单抗(tositumomab))、(替伊莫单抗)、(阿仑单抗)、(eprtuzumab)、

(贝伐单抗)和

(厄洛替尼)等)结合使用。举例而言，并且不希望受到理论的束缚，用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体进行治疗可导致癌细胞(例如，肿瘤细胞)死亡，这将增强由免疫刺激剂(例如CD40、TIGIT、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3药剂，例如抗体)介导的免疫应答。在一个示例性的实施方案中，过度增殖性疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可以包括与激动剂抗huCD40抗体以及任选的另外的能够增强宿主的抗肿瘤免疫反应的免疫刺激剂(例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3剂，例如抗体)组合的抗癌剂(例如抗体)，，其同时或顺序或其任意组合施用。

本文提供用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的治疗相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用激动剂抗-huCD40抗体，其与或不与亚治疗剂量的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3药剂(例如抗体)组合。例如，本文描述的方法提供了通过向患者施用不可吸收的类固醇来减少免疫刺激性治疗性抗体诱导的结肠炎或腹泻的发生率的方法。如本文所用，“不可吸收的类固醇”是糖皮质激素，其表现出广泛的首过代谢，使得在肝脏中代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本文所述的一个实施方案中，不可吸收的类固醇是布***。布***是一种局部作用的糖皮质类固醇，在口服施用后主要通过肝脏广泛代谢。(Astra-Zeneca)是布***的pH和时间依赖性口服制剂，经开发优化向回肠和整个结肠的药物递送。已在美国获准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病。用于治疗克罗恩氏病的常规口服剂量为6至9mg/天。在被吸收并保留在肠粘膜之前先在肠中释放。一旦其通过肠粘膜靶组织，

就会被肝脏中的细胞色素P450系统广泛代谢为可忽略的糖皮质类固醇活性的代谢产物。因此，生物利用度低(约10％)。与首过代谢范围较小的其他糖皮质类固醇相比，布***的低生物利用度导致改善的治疗率。与全身作用的皮质类固醇相比，布***产生的副作用更少，包括下丘脑-垂体抑制作用更少。但是，长期服用导致全身性糖皮质类固醇作用，例如皮质激素过多和肾上腺抑制。参见PDR第58版2004；608-610。

在另外的实施方案中，具有或不具有CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断剂的CD40激动剂(即，针对CD40的免疫刺激性治疗性抗体和任选的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)与不可吸收的类固醇结合可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA剂，例如：柳氮磺胺吡啶(

Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉秦(

Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(SalixPharmaceuticals，Inc.)；和美沙拉明(Procter&Gamble Pharmaceuticals；

Shire US；Axcan Scandipharm，Inc.；

Solvay)。

根据本文所述的方法，水杨酸盐与具有或不具有抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或LAG-3抗体和不可吸收的类固醇的激动剂抗huCD40抗体组合施用，可包括水杨酸盐和不可吸收的类固醇的任何重叠或顺序施用，目的是用于降低由免疫刺激抗体诱导的结肠炎的发病率。因此，例如，用于减少由本文所述的免疫刺激抗体诱导的结肠炎的发病率的方法包括同时或顺序(例如，不可吸收的类固醇后6小时施用水杨酸盐)或其组合施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇。此外，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同的途径(例如，两者口服施用)或与用于施用抗huCD40和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的途径不同的不同途径(例如，水杨酸盐通过口服施用而不可吸收的类固醇经直肠施用)施用。

本文所述的激动剂抗huCD40抗体和组合抗体疗法也可以与其他众所周知的疗法结合使用，所述其他众所周知的疗法因其对于所治疗的适应症(例如，癌症)的特定用途而被选择。本文所述的激动剂抗huCD40抗体的组合可以与一种或多种已知的药学上可接受的药剂顺序地使用。

例如，本文所述的激动剂抗huCD40抗体和组合抗体疗法可以与另外的治疗(例如，同时或分别地)组合使用，所述另外的疗法例如辐射、化学疗法(例如，使用喜树碱(CPT-11))、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、阿霉素、伊立替康、紫杉醇、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(Taxol)、阿霉素、5-fu或喜树碱+apo21/TRAIL(6X combo))、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2′(bcl-x1抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(obatoclax)或MCL-1(髓样白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如，smac7、smac、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见Fulda等人，NatMed2002；8：808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如，)、合成性三萜类化合物(参见Hyer等人，Cancer Research 2005；65：4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的天然和合成配体)、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如索拉非尼)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、替莫罗莫司、mTOR抑制剂(如雷帕霉素和替西罗莫司)、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂和/或遗传毒性药物。

本文所述的激动剂抗huCD40抗体和组合抗体疗法可进一步与一种或多种抗增殖细胞毒性剂组合使用。可用作抗增殖细胞毒性剂的化合物类别包括但不限于以下：

烷基化剂(包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶芥、Chlormethine、环磷酰胺(CYTOXAN^TM)fosfamide、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙撑蜜胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、罗氮芥、链脲菌素、达卡巴嗪和替莫唑胺。

抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他汀和吉西他滨。

用于与激动剂抗huCD40抗体组合的合适的抗增殖剂，但不限于，紫杉烷类、紫杉醇(紫杉醇可作为TAXOL^TM商购)、多西他赛、discodermolide(DDM)、dictyostatin(DCT)、Peloruside A、埃博霉素、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、呋喃埃博霉素D、脱氧埃博霉素B1、[17]-脱氢脱氧埃博霉素B、[18]脱氢脱氧埃博霉素B、C12，13-环丙基-埃博霉素A、C6-C8桥联的埃博霉素A、反式9，10-脱氢埃博霉素D、顺式-9，10-脱氢埃博霉素D、16-去甲基埃博霉素B、埃博霉素B10、圆皮海绵内酯(discoderomolide)、帕土匹龙(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(圆皮海绵内酯)、TZT-1027(soblidotin)、ILX-651(tasidotin盐酸盐)、软海绵素B、甲磺酸艾日布林(E-7389)、Hemiasterlin(HTI-286)、E-7974、Cyrptophycins、LY-355703、美登素免疫缀合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(ispinesib)、SB-743921、MK-0731、ST A-5312、五加素(eleutherobin)、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-同型-雌1，3，5(10)-三烯-3-醇(17beta-acetoxy-2-ethoxy-6-oxo-B-homo-estra-1，3，5(10)-trien-3-ol)、环链菌素(cyclostreptin)、isoolaulimalide、laulimalide、4-epi-7-脱羟基-14，16-二去甲基-(+)-圆皮海绵内酯、cryptothilone 1，除本领域已知的其他微管稳定剂外。

在期望结合本文所述的激动剂抗huCD40抗体或在用本文所述的激动剂抗-huCD40抗体治疗之前使异常增生的细胞静止的情况下，激素和类固醇(包括合成类似物)，例如17a-乙炔***、己烯雌酚、***、***、氟***、丙酸屈他雄酮、睾内酯、乙酸甲地孕酮、甲基***龙、甲基***、***龙、曲安西龙、氯烯雌酚醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、甲氧***甲酸酯、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、ZOLADEX^TM也可用于施用至患者。当采用本文所述的方法或组合物时，还可以根据需要施用在临床环境中用于调节肿瘤生长或转移的其他药剂，例如抗模拟物药。

安全有效地施用化学治疗剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，它们的施用在标准文献中描述。例如，许多化学治疗剂的给药描述在Physicians′Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics Company，Montvale，N.J.07645-1742，USA)，通过引用将其公开内容并入本文。

可以根据本领域公知的治疗方案来施用一种或多种化学治疗剂和/或放射疗法。对于本领域技术人员而言显而易见的是，一种或多种化学治疗剂和/或放射疗法的施用可以根据所治疗的疾病和一种或多种化学治疗剂和/或放射疗法的已知作用而变化。并且，根据熟练的临床医生的知识，鉴于观察到的所施用的治疗剂对患者的效果以及鉴于所观察到的疾病对所施用的治疗剂的应答，可以改变治疗方案(例如，施用的剂量和时间)。

X.特异性激动剂抗CD40抗体

本发明的具有改进的人源化重链和轻链可变区序列的激动剂抗CD40抗体衍生自WO 2017/004006中所述的抗CD40抗体。序列表中提供了WO 2017/004006中描述的示例性抗体的可变域和CDR序列区，并在表2中进行了总结。对于衍生自同一原始克隆的所有抗体，本发明的改进的抗CD40抗体的可变域和CDR区编号是相同的，即本文提供的人源化变体不包括任何***或缺失，但SEQ ID NO：47-51中提供的改进的修饰的mAb12D6轻链可变区序列和SEQ ID NO：52-54中提供的重链可变区序列除外。

表2

抗体可变结构域和CDR

通过以下实施例进一步说明本公开，其不应解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。

实施例

实施例1

针对人CD40的人源化单克隆抗体的表征

通过在HEK293细胞中的瞬时转染来产生本发明的激动剂抗CD40抗体，例如抗体12D6-24。确定单体的产率和百分比以评估其开发成治疗性蛋白质的可行性。在Expi293Expression System^TM蛋白质表达系统(Thermo Fisher Scientific，Waltham Mass.，USA)中5天后的抗体12D6-24(包含重链和轻链可变区，该重链和轻链可变区分别由SEQ ID NO：11的残基1-119和SEQ ID NO：8的残基1-112组成)滴度为18mg/L，只有67％的物质为单体形式。其他类似的抗体通常以50-100mg/L和＞95％的单体表达。低产量和聚集倾向是治疗性抗体的不良性质。

假设导致链不平衡的轻链较差表达，引起重链二聚体和高分子量种类的形成。进一步的实验表明，增加编码轻链的DNA与编码重链的DNA的比率提高产率和单体级分。参见表3。

表3

未修饰的12D6-24的特性

这些结果证实了以下假设：恰当的链平衡对于获得mAb 12D6-24的合理产率和高百分比单体(减少的聚集)至关重要。

实施例2

用于人源化抗huCD40抗体12D6-24的改边的重链和轻链可变区

鉴于实施例1中鉴定的较差的临床制造特性，包括低表达水平和聚集趋势，激动剂抗huCD40mAb 12D6-24的重链和轻链可变域均被重新工程化，从而产生新的轻链可变区序列L2(SEQ ID NO：47)、L3(SEQ ID NO：48)、L4(SEQ ID NO：49)和L5(SEQ ID NO：50)和新的重链可变区序列H2(SEQ ID NO：52)和H3(SEQ ID NO：53)。

为了制备用于人IgG轻链的表达载体，在CMV启动子和人IgG分泌前导序列的控制下，将编码轻可变域的DNA与表达载体中的编码人κ恒定区的DNA遗传融合。类似地，为了制备用于人IgG重链的表达载体，在CMV启动子和人IgG分泌前导序列的控制下，将编码重可变域的DNA与表达载体中的编码人CH1、铰链和人IgG1Fc的DNA遗传融合。

为了制备独特的抗体，将独特轻链中的每个的表达载体与独特重链中的每个共转染到HEK293细胞中。孵育5天后，测量培养基中每种抗体的浓度，并通过MAB Select色谱法纯化独特的抗体。纯化后，通过尺寸排阻色谱法评估抗体的聚集，并通过ELISA评估抗体的结合亲和力。参见表4。

表4

改进的12D6-24抗体的特性

通过将框架序列中的一些回复至种系来设计另外的重链(H4)和轻链(L6)可变区，如分别在SEQ ID NO：54和51中所示。制备表达载体，并评估表达、聚集潜力和抗原结合。参见表5。

表5

另外的改进的12D6-24抗体的特性

将L2或L3与H1、H2或H3组合导致增加的表达和纯化产率，但是所得抗体失去了与人CD40的可检测结合。与H1、H2或H3配对的L5减少了所得抗体的表达和结合。将L6与H1、H2或H4结合导致显著更低的表达，并且纯化产率也很低，因此未对这些抗体进行进一步的分析。相反，在蛋白A纯化后，将H4与L1或L4配对导致更高的表达和更高的单体百分比。

考虑到所有数据，当与H1、H2或H4配对时，L4改善了抗体的可制造性。另外，当比较重链的贡献时，发现重链4导致显著高于亲本抗体的稳健的表达，并且显著降低了聚集的倾向。

对包含本发明的改进的重链和轻链可变区序列的最有希望的抗体进行了进一步的实验。参见表6。L4H1分别包含轻链可变区和重链可变区SEQ ID NO：49以及SEQ ID NO：11的残基1-119。L4H2包含分别为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：52的轻链和重链可变区。L4H4包含分别为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：54的轻链和重链可变区。抗体(包括未修饰的mAb12D6-24)在其它方面是相同的。

表6

具有改进的重链和轻链可变区的抗CD40抗体的特性

很明显，抗体12D6的改进形式，特别是L4H1和L4H4，表现出提高的产率和大大提高的单体百分数(减少的聚集)。

进行ELISA以确认改进的抗体保留了对CD40的亲和力。参见表6。所有这些改进的抗CD40抗体均保留了与原始mAb 12D6-24(K_d＝0.24μM)相似的结合。

实施例3

具有改进的重链和轻链可变区的抗CD40抗体的生物活性

进行了另外的实验以评估本发明的改进的抗CD40(mAb 12D6)抗体的生物学活性。在第一个实验中，使用塑料粘附或人CD14-微珠(Miltenyi Biotec)从健康的正常供体中分离出人单核细胞(CD14⁺)。用100ng/mL GM-CSF(Miltenyi Biotec)和100ng/mL IL-4(Miltenyi Biotec)培养单核细胞。在第2天和第5天除去一半培养基并补充。在第6-7天收获未成熟的树突状细胞。将DC与指定浓度的抗体在37℃孵育过夜。收集细胞培养上清液，并测定人TNF-α的产生。参见图1。

单独的生长培养基(AIMV)和对照人IgG1抗体不诱导TNF-α的产生。中间曲线表示未经修饰的mAb 12D6-24和改进版的L4H4，而上部曲线代表改进版的L4H1(使用来自两个供体6P1和6P2的DC进行)。显然，本发明的具有改进的重链和/或轻链可变区的抗CD40抗体在该测定法中保留了与未修饰的mAb 12D6-24相似的生物活性。

进行第二次实验以测量本发明的改进的激动剂抗CD40抗体活化树突状状细胞的能力，如通过诱导细胞表面标志物CD83和CD86所测量的。通过将细胞铺板在96孔板中、添加指定的抗体，然后在37℃下孵育过夜，在体外对未成熟的树突状细胞(如前段所述进行分离)进行测量。然后收获细胞并用荧光抗CD83抗体和荧光抗CD83抗体染色，其中每种情况均通过荧光激活细胞分选(FACS)检测。结果表示为平均荧光强度(MFI)。用于FACS的荧光抗CD83抗体是激发波长为647nm的647抗人CD83抗体，荧光抗CD86抗体是激发波长为488nm的

488抗人CD86抗体(二者均来自BioLegend，San Diego Calif.，USA)。图2A提供了在647nM下激发获得的数据，因此主要显示了CD83的染色(浅灰色条)，而图2B提供了在647nM下激发获得的数据，因此主要显示了CD86的染色(深灰色条)。在没有染色抗体的情况下进行了对照实验(黑条)。

数据证明，本发明的激动剂抗CD40mAb 12D6的改进形式(L4H1和L4H4)至少与未修饰的mAb 12D6在诱导未成熟树突状细胞表面上的CD83和CD86表达方面同样有效。因为抗体L4H1和L4H4保留CD40结合亲和力和生物学活性，且仍显示出提高的产率和纯度，因此它们代表了临床开发的优良候选者。

表7

序列表总结

序列表提供了成熟的重链和轻链的序列(即，序列不包括信号肽)。SEQ ID NO：46中提供了用于例如在人细胞中产生本发明抗体的信号序列。如本文所用，“SEQ ID NO：54的残基1-119”与“SEQ ID NO：54”同义，因为SEQ ID NO：54由119个残基组成。有时为SEQ IDNO：54包括残基编号，只是为了有利于以同一短语或权利要求要素提及可变区序列和全长重链或轻链序列。

等同物：

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文公开的特定实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由所附权利要求书涵盖。

序列表

<110> 百时美施贵宝公司

赛托姆克思治疗学股份有限公司

<120> 抗CD40抗体及其用途

<130> 3338.112PC01/ELE/PAC/DKC

<150> US 62/610,642

<151> 2017-12-27

<160> 54

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(20)

<220>

<221> 肽

<222> (21)..(277)

<220>

<221> 域

<222> (21)..(193)

<223> 细胞外域

<220>

<221> 域

<222> (194)..(215)

<223> 跨膜域

<220>

<221> 域

<222> (216)..(277)

<223> 细胞内域

<400> 1

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu

20 25 30

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val

35 40 45

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu

50 55 60

Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His

65 70 75 80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr

85 90 95

Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr

100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys

145 150 155 160

Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln

165 170 175

Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu

180 185 190

Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile

195 200 205

Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn

210 215 220

Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp

225 230 235 240

Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His

245 250 255

Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser

260 265 270

Val Gln Glu Arg Gln

275

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

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Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

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Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

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180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

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210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 3

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠可变域、人恒定域的嵌合抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(108)

<223> CDRH3

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

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Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 4

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

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<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(108)

<223> CDRH3

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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

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<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 6

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<210> 7

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(119)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(108)

<223> CDRH3

<400> 7

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<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

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<220>

<221> MISC_特征

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<213> 人工序列

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<220>

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<220>

<221> MISC_特征

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<220>

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<221> MISC_特征

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<221> MISC_特征

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<220>

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<221> MISC_特征

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<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

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<221> MISC_特征

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(38)

<223> CDRL1

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<221> MISC_特征

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<223> CDRL2

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<221> MISC_特征

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<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

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<221> MISC_特征

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<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(111)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(38)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

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<220>

<221> MISC_特征

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

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<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

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<220>

<221> MISC_特征

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<220>

<221> MISC_特征

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<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(38)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

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<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (93)..(101)

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<213> 人工序列

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<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

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<221> MISC_特征

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<221> MISC_特征

<222> (99)..(111)

<223> CDRH3

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<220>

<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体

<220>

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<221> MISC_特征

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(111)

<223> CDRH3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

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<220>

<221> MISC_特征

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<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

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<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

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<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(122)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(111)

<223> CDRH3

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Gln Val Gln Phe Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 25

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1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg

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<210> 26

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(122)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(111)

<223> CDRH3

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435 440 445

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450

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<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 27

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<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

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<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

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<221> MISC_特征

<222> (99)..(111)

<223> CDRH3

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435 440 445

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450

<210> 29

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 29

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<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(122)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(111)

<223> CDRH3

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Gln Val Gln Phe Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 31

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<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(102)

<223> CDRH3

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<210> 33

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(34)

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<220>

<221> MISC_特征

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<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (89)..(97)

<223> CDRL3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(113)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(102)

<223> CDRH3

<400> 34

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(34)

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<220>

<221> MISC_特征

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<220>

<221> MISC_特征

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<220>

<221> 域

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<220>

<221> MISC_特征

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<221> MISC_特征

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

<221> 域

<222> (1)..(107)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(34)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(56)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (89)..(97)

<223> CDRL3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体

<220>

<221> 域

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

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<220>

<221> MISC_特征

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<220>

<221> MISC_特征

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<223> CDRH3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(101)

<223> CDRH3

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

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<221> MISC_特征

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<223> CDRL3

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<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<222> (1)..(112)

<223> 可变域

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDRH1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDRH2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(101)

<223> CDRH3

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有小鼠CDR和人框架和恒定区的人源化抗体

<220>

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<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(39)

<223> CDRL1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (55)..(61)

<223> CDRL2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (94)..(102)

<223> CDRL3

<400> 43

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 44

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 45

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 47

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Leu Thr Asn Arg Phe Phe Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile His Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 48

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Leu Thr Asn Arg Phe Phe Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile His Val Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 49

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Thr Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Ile His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 50

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 50

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Thr Asn Arg Phe Phe Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile

85 90 95

His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 51

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Thr Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

85 90 95

Ile His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 52

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化小鼠抗体可变区

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Thr Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Leu Gln Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115