阅读说明：本技术 用于治疗脑内出血的多潜能成体祖细胞 (Multipotent adult progenitor cells for the treatment of intracerebral hemorrhage ) 是由 R·梅斯 于 2020-01-30 设计创作，主要内容包括：本文所描述的发明的各方面涉及给予多潜能成体祖细胞用于治疗脑内出血。(Aspects of the invention described herein relate to the administration of multipotent adult progenitor cells for the treatment of intracerebral hemorrhage.)

具体实施方式

仅通过示例的方式提供以下实施例，决不限制、排他或穷尽本文公开的本发明的许多方面和实施方案。

实施例1-制备MAPC

在以下所述的实施例中使用Athersys Inc.Cleveland的人MAPC。这些为源自人骨髓的MAPC，其分离自骨髓抽吸物，在健康供体同意的情况下获得，并根据先前描述的方法进行处理，基本上记载于Penn,MS等人,Circ Res 2012；110(2):304-11；Maziarz,RT等人，Biology of Blood and Marrow Transplantation 2012；18(2Sup)：S264-S265；和clinicaltrials.gov#NCT01436487、#NCT01240915以及#NCT01841632)。简而言之，在纤连蛋白包覆的塑料组织培养瓶中、在低氧张力下、在5％的CO₂的潮湿气氛中，培养MAPC。细胞在MAPC培养基(低葡萄糖DMEM[Life Technologies Invitrogen]中培养，该培养基用以下补充剂进行补充：FBS(Atlas Biologicals,Fort Collins,CO)、ITS液体培养基补充剂[Sigma]、MCDB[Sigma]、血小板衍生生长因子(R&D Systems,Minneapolis,MN)、表皮生长因子(R&D Systems)、地塞米松([Sigma]，青霉素/链霉素[Life Technologies Invitrogen]、2-磷酸-L-抗坏血酸[Sigma,St.Louis,MO)和亚油酸白蛋白(Sigma)。细胞每3-4天传代一次，使用胰蛋白酶/EDTA(Life Technologies Invitrogen，Carlsbad，CA)收获。细胞的CD49c和CD90呈阳性，且MHC II类和CD45呈阴性。随后将细胞以群体倍增30-35次、在液氮的气相中以1ml中1-10×10⁶的浓度(PlasmaLyte、5％HSA和10％DMSO)在冷冻管中冷冻。在即刻使用前，将MAPC解冻，然后直接使用。

实施例2-大鼠中的胶原酶ICH诱导

将ICH的小鼠胶原酶模型用于研究，如前所述(Sukumari-Ramesh等人，JNeurotrauma 29(18):2798-804(2012))。简而言之，将成年雄性C57B1/6J小鼠(8-10周龄)放入立体定向框架中，在前囟外侧2.2mm的顶叶皮层上钻一个直径为0.5mm的钻孔。将一个装有在0.5μI盐水中的0.04μI细菌IV型胶原酶的26-GHamilton注射器从颅骨表面降低3mm深,直接进入左侧纹状体。注射器以450nl/min的速度压下，并在该步骤后留在原处几分钟，以防止溶液回流和过量扩散。取下注射器后用骨蜡封闭钻孔，手术缝合切口，将小鼠保持温暖直到翻正反射恢复。对于所有研究，使用同窝仔(littermates)以减少实验差异性的来源。

动物在损伤后随机接受静脉内(IV)盐水(对照；n＝10)或细胞(n＝11)。

出血开始后2小时(注射胶原酶后2小时)静脉内给予细胞或盐水。所有细胞治疗的动物都接受了100万个细胞。

如下所述，在损伤后三周内通过磁共振成像(MRI)评估血肿体积和脑灌注。

如下所述，在损伤后第7天评估神经行为结果，包括握力测试、窄梁试验和抬高身体摆动试验。

实施例3-ICH后MAPC减小血肿体积

早在损伤后1天，静脉注射细胞显著减小血肿体积。这种影响在ICH后的第一周持续存在。与加速血肿消退一致。用异氟烷麻醉小鼠(3％用于诱导，1.5％用于维持在N₂/O₂的2:1的混合物中)，并使用配备12-cm自屏蔽梯度装置(最大45高斯/cm)的水平7Tesla BioSpec MRI光谱仪(Bruker Instruments)成像。使用标准发射/接收体积线圈(内径72-mm)施加射频脉冲，该线圈与位于动物头骨中心线上的双通道Bruker正交接收器线圈主动解耦。在成像过程中利用立体定向耳棒(stereotaxic ear bars)使移动降到最小。使用由循环水浴加热的垫将小鼠温度保持在37±0.5℃。使用三平面快速低角度拍摄序列定位后，使用T2’-加权MRI扫描进行MR。使用以下参数获取MRI：T2*映射序列(具有多重回波的二维梯度回波序列；TE·5、10、15、20、25和30ms；TR·3,000ms；FOV＝32mm；1-mm切片厚度(IS切片]；256x256矩阵；NEX＝2)。使用ImageJ软件对获得的图像进行体积分割，并计算血肿体积。使用Bruker软件进一步处理T2*W图像以产生磁敏感加权图像(Sehgaletak，2006)，为血块体积的分割和质量控制参考提供了替代方法。通过在包含损伤/脑室的所有MRI切片上绘制不规则的感兴趣区域(ROI)来确定血肿和脑室容积，并将总和值(面积)乘以切片厚度以计算体积。使用ImageJ软件进行分析。

细胞处理的动物在处理的一天内显示血肿体积在统计学上显著减小(约减小4倍)。至少在前7天，细胞处理的动物相对于盐水处理的动物的降低在统计学上为显著的。

结果显示在图1中。在胶原酶诱导ICH后2小时向小鼠静脉内给予安慰剂(PBS，n＝10)或(n＝11)。使用7T小动物MRI通过MRI(T2W)评估血肿体积。提供了第3天和第7天的代表性的冠状脑图像，图A显示了对血肿体积的显著益处。图B描述了所有小鼠在21天评估期内的数据。数据表示为平均值+/-SEM，并在每个时间点内通过学生t检验进行分析。**p<0.01相比于安慰剂治疗的ICH小鼠。

实施例4-MAPC改善ICH后的脑灌注

在ICH后超过1周内，改善了损伤的纹状体内部和周围的脑灌注。用异氟烷麻醉小鼠(3％用于诱导，1.5％用于维持在2:1的N₂/O₂的混合物中，并使用配备12-cm自屏蔽梯度装置的水平7 Tesla BioSpec MRI光谱仪(Bruker Instruments)成像(最大45高斯/cm)。使用标准发射/接收体积线圈(内径72毫米)施加射频脉冲，该线圈与位于动物头骨中心线上的双通道Bruker正交接收器线圈主动解耦。在成像过程中利用立体定向耳棒使移动降到最小。使用由循环水浴加热的垫子将小鼠温度保持在37±0.5℃。在使用三平面快速低角度拍摄序列定位后，使用T2-加权MRI扫描进行MR研究。使用以下参数获取MRI：T2-流体衰减反转恢复序列(RARE-IR，T1·2000；TR·10,000ms；TE·36ms；RARE因子＝8；FOV＝32mm；256x256矩阵；l-mm切片厚度；JS切片。使用ImageJ软件进行分析。

与用生理盐水治疗的受伤动物相比，细胞治疗动物的血流在治疗后的前7天在统计学上有显著改善。这说明静脉输注细胞产品对于出血性中风发作后大脑中的脑血流产生了急剧改善的效果，可能产生水肿、组织损伤和神经回路中断的减少。

结果显示在图2中。在胶原酶诱导ICH后2小时向小鼠静脉内给予安慰剂(PBS，n＝10)或(n＝11)。使用7T小动物MRI通过MRI(ASL；FAIR-RARE)评估脑灌注。图A提供了代表性的冠状脑图像，图B中示出量化数据。数据表明在ICH后的第一周内，改善了脑灌注。数据表示为平均值+/-SEM，并在每个时间点内通过学生t检验进行分析。*p<0.05，**p<0.01相对于安慰剂治疗的ICH小鼠。

实施例5-在ICH后MAPC减少了功能性缺陷并改善了行为

观察到的梗死体积减小和脑灌注改善的变化反映在握力测试中运动行为的功能改善、通过梁的时间减少和标准化的左/右摆动比。

行为测试

挂线测试(Hanging wire test)

通过将小鼠放在一个装置上进行握力评估，该装置由拉在两个垂直支撑物之间的50-cm的绳子组成。如下评价小鼠：0：掉落；1：用两只前爪挂在绳子上；2：与1相同，但尝试在绳子上攀爬；3：用两只前爪加上一只或两只后肢挂在绳子上；4：前爪挂在绳子上，同时尾巴绕在绳子上；和5：逃脱。在每个时间点对每只动物取三次连续试验的最高读数。

窄梁行走(Narrow beamwalk)

连续三天在固定的窄梁(6mm宽，1m长)上评估运动协调性。前两天包括训练，第三天通过测量横穿横梁所需的时间来量化横梁上的行为。每只小鼠由不知情的研究人员测试3次，并记录平均值。

抬高身体摆动试验

握住动物距尾巴根部1cm处并悬挂在平面上方1-5cm处。每次悬挂都记录一次摆动。摆动被定义为偏离身体中线>10度或绕垂直轴旋转。在两次悬挂之间将小鼠置于表面上，允许明显地重新定位以便观察不到侧向偏好，然后重新悬挂。评估者改变手和站立的位置，测试区域没有视觉提示，以避免偏离摆动方向。每次试验记录20次摆动，侧向偏好计算为一侧的摆动/总摆动。

这些数据表明，与仅用盐水治疗的动物相比，在对动物进行的三项测试中证明，在出血性中风发作后用进行急性治疗可显著改善运动和神经系统的益处。

结果显示在图3中。在胶原酶诱导ICH后2小时将安慰剂(PBS，n＝10)或(n＝11)静脉内给予小鼠。在受伤后第7天(或在假手术小鼠中；n＝8)评估运动功能的神经学评价。(A)握力测试。(B)窄梁任务。(C)抬高身体摆动任务。数据为平均值+/-SEM，并使用因素方差分析和随后的Tukey事后检验法进行比较。*p<.05，**p<0.01，***p<0.001，ns＝不显著。

上述结果出人意料地好，特别是考虑到除了在血块位置和大小适合手术时在患者中进行手术清除外，目前尚无被批准的针对患有出血性中风患者的治疗。不存在批准的药物或疗法。

Dhandapani小组于2018年9月发表了评估实验疗法的最新临床前论文，专注于通过抑制腺苷单磷酸激酶α-1(AMPKal)来减小血肿体积(Vaibhav，2018年)。在该论文中，评估了与本申请中相同类型的MRI结果以及运动和神经学终点。

与本申请中提供的结果相比，给予细胞在减少血肿和血流结果方面始终更好，并且在运动结果方面即使不是更好也达到一样好的程度。这些是在ICH治疗研究中看到的最好结果。

如所属领域的技术人员将理解的，前述说明和实施例为说明性的，但并非穷尽本文公开的发明所涵盖的许多方面和实施方案。

前述公开中提及的所有出版物通过引用其整体并入本公开中，特别是在它们已被具体引用的与主题最相关的部分中。