观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法
阅读说明：本技术 观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法 (Method for rapid propagation and tissue culture plant regeneration of ornamental sunflower ) 是由 陈珊宇 丁林云 阮关海 张慧 厉宝仙 怀燕 田燕 孟思洁 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法,挑选成熟的比较饱满的种子；温室,播种前催芽,种子尖的一头朝下,插进土壤中,再覆一层薄土,用喷壶喷水,让土壤保持湿润的状态,温室光照下出芽。本发明以观赏向日葵腋芽为外植体,研究了不同种类和浓度的植物生长调节剂对向日葵组织培养过程的影响,建立了其离体快速繁殖的技术体系；在向日葵快繁体系建立的基础上,建立向日葵愈伤胚性体细胞的诱导,以建立稳定、高效组织培养再生体系；在向日葵组织再生体系建立的基础上,不断优化再生体系条件,以建立稳定、高效再生体系为目标,进行基因重组载体构建,并建立向日葵的遗传转化体系,为深入基因功能研究提供服务。(The invention discloses a rapid propagation and tissue culture plant regeneration method for ornamental sunflower, which comprises the steps of selecting mature and plump seeds; and in the greenhouse, pregermination is carried out before sowing, one end of a seed tip faces downwards, the seed tip is inserted into soil, a layer of thin soil is covered, a watering can is used for spraying water to keep the soil in a moist state, and germination is carried out under the illumination of the greenhouse. The invention takes the axillary buds of the ornamental sunflower as the explant, researches the influence of plant growth regulators with different types and concentrations on the tissue culture process of the sunflower, and establishes a technical system for the in vitro rapid propagation of the plant growth regulators; on the basis of the establishment of a sunflower rapid propagation system, establishing the induction of somatic cells of a sunflower callus embryo so as to establish a stable and efficient tissue culture regeneration system; on the basis of establishing a sunflower tissue regeneration system, the conditions of the regeneration system are continuously optimized, a stable and efficient regeneration system is established as a target, the construction of a gene recombination vector is carried out, a genetic transformation system of the sunflower is established, and the service is provided for the deep gene function research.)
技术领域
本发明涉及观赏向日葵领域，尤其涉及观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法。
背景技术
观赏向日葵又名彩色向日葵，包括向日葵属、向日葵种和部分近缘种。其花盘形似太阳，花朵亮丽，颜色鲜艳，力度感好，纯朴自然，具有较高的观赏价值。在国外，观赏向日葵深受人们的喜爱，广泛用于切花、盆花、染色花、庭院美化及花境营造等领域。我国观赏向日葵市场刚刚起步，具有一定的开发潜力。观赏向日葵为菊科，向日葵属，一年生花卉，株高60至300厘米，花期25-35天，花色有黄色、橙色、红色、粉色及复色等。一般连片种植，开花时花色鲜艳，既有野趣，又极为壮观。
利用生物技术手段获得优质的向日葵品种，一直是向日葵栽培育种研究的目标，而生物技术的重要手段之一就是离体组织培养，目前观赏向日葵组织高校再生体系较少，未对其组织建立高效的再生体系。为此，我们提出观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法，以解决背景技术中提出的问题。
本发明提供如下技术方案：
观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法，包括如下步骤：
A、向日葵种植：
a、选种：挑选成熟的比较饱满的种子；
b、播种：温室，播种前催芽，种子尖的一头朝下，插进土壤中，再覆一层薄土，用喷壶喷水，让土壤保持湿润的状态，温室光照下出芽；
c、移栽：向日葵长出三对真叶之后开始移栽；
d、取样：进行快繁与愈伤诱导实验；
B、以腋芽为外植体---进行不定芽诱导：
a、样品处理
(1)田间选取顶花即将开放或者已经开放的向日葵植株；
(2)采回后将整个植株分成几段，保留带腋芽茎段；
(3)用洗洁精清洗干净，然后用清水冲洗0.5h；
b、外植体制备
(1)将所有腋芽切下后，无菌水冲洗一遍，先用75％乙醇浸泡30-60s，再用10％过氧化氢或者3％次氯酸钠溶液消毒15-20min或HgCl2消毒浸泡10-15min，无菌水冲洗4-5次；然后在超净工作台上吸取多余水分；
(2)切取腋芽5mm大小的顶部作为外植体，接种到合适的培养基上；
C、不同激素浓度对不同基因型观赏向日葵腋芽诱导不定芽的影响：
以腋芽为外植体，在加入等量0.03mg/L NAA的MS培养基中添加不同浓度的6-BA，浓度处理包括0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mg/L共6个浓度梯度，以不同供试基因型4-6d的腋芽作为外植体材料，研究不定芽的诱导效果；
D、不定芽的伸长诱导：
设置3-4个组合，摸索适合不定芽伸长诱导的最佳条件，MS+0.1mg/L BA+0.08mg/LNAA。
E、再生诱导：
MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+1.0gMgCl2
MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+1.0g MgCl2
F、生根诱导：
1/2MS+0.5mg/L IBA
G、再生株系的练苗培养：获得根系发达的向日葵再生植株，开盖练苗2-3日，喷施水保持叶面湿润，洗净根系培养基，水培成活后移栽；
H、实验结果：愈伤组织获得，再生植株获得。
优选的，所述步骤B中设置不同的激素配比与浓度，3-4个组合的培养基，1/2MS固体培养基含1.8g/L琼脂，灭菌前调节pH值至5.8-6.0。
优选的，所述步骤B中将向日葵外植体接种于含有不同激素的培养基广口瓶中，外植体在培养25-30d后，分化出初生不定芽，继续培养10-15d后继代培养1次，温度25-28℃，日光/黑夜光照时间12h/12h，光照强度1600lux。
优选的，所述步骤C中在不同的细胞分裂素和生长素的配比情况下，不同材料诱导出不定芽的难易程度和出芽时间并不一致。
本发明提供了观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法，本发明以观赏向日葵腋芽为外植体，研究了不同种类和浓度的植物生长调节剂对向日葵组织培养过程的影响，建立了其离体快速繁殖的技术体系；在向日葵快繁体系建立的基础上，建立向日葵愈伤胚性体细胞的诱导，以建立稳定、高效组织培养再生体系；在向日葵组织再生体系建立的基础上，不断优化再生体系条件，以建立稳定、高效再生体系为目标，进行基因重组载体构建，并建立向日葵的遗传转化体系，为深入基因功能研究提供服务。
附图说明
图1为本发明步骤原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：
观赏向日葵快繁与组织培养植株再生方法，包括如下步骤：
A、向日葵种植：
a、选种：挑选成熟的比较饱满的种子；
b、播种：温室，播种前催芽，种子尖的一头朝下，插进土壤中，再覆一层薄土，用喷壶喷水，让土壤保持湿润的状态，温室光照下出芽；
c、移栽：向日葵长出三对真叶之后开始移栽；
d、取样：进行快繁与愈伤诱导实验；
B、以腋芽为外植体---进行不定芽诱导：
a、样品处理
(1)田间选取顶花即将开放或者已经开放的向日葵植株；
(2)采回后将整个植株分成几段，保留带腋芽茎段；
(3)用洗洁精清洗干净，然后用清水冲洗0.5h；
b、外植体制备
(1)将所有腋芽切下后，无菌水冲洗一遍，先用75％乙醇浸泡30-60s，再用10％过氧化氢或者3％次氯酸钠溶液消毒15-20min或HgCl2消毒浸泡10-15min，无菌水冲洗4-5次；然后在超净工作台上吸取多余水分；
(2)切取腋芽5mm大小的顶部作为外植体，接种到合适的培养基上；
C、不同激素浓度对不同基因型观赏向日葵腋芽诱导不定芽的影响：
以腋芽为外植体，在加入等量0.03mg/L NAA的MS培养基中添加不同浓度的6-BA，浓度处理包括0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mg/L共6个浓度梯度，以不同供试基因型4-6d的腋芽作为外植体材料，研究不定芽的诱导效果；
D、不定芽的伸长诱导：
设置3-4个组合，摸索适合不定芽伸长诱导的最佳条件，MS+0.1mg/L BA+0.08mg/LNAA；
不定芽芽增值，降低6-BA的浓度有利于芽增值，根据实际的状态进行不定芽的切取，继代培养。
MS+0.05mg/L BA+0.03mg/LNAA
MS+0.1mg/L BA+0.08mg/LNAA
MS+0.2mg/L BA+0.06mg/LNAA
生根诱导
在以上实验的基础上，设置生根诱导培养
1/2MS+0.5mg/L IAA
1/2MS+0.5mg/L IBA
E、再生诱导：
MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+1.0gMgCl2
MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+1.0g MgCl2
F、生根诱导：
1/2MS+0.5mg/L IBA
G、再生株系的练苗培养：获得根系发达的向日葵再生植株，开盖练苗2-3日，喷施水保持叶面湿润，洗净根系培养基，水培成活后移栽；
H、实验结果：愈伤组织获得，再生植株获得。
优选的，所述步骤B中设置不同的激素配比与浓度，3-4个组合的培养基，1/2MS固体培养基含1.8g/L琼脂，灭菌前调节pH值至5.8-6.0。
优选的，所述步骤B中将向日葵外植体接种于含有不同激素的培养基广口瓶中，外植体在培养25-30d后，分化出初生不定芽，继续培养10-15d后继代培养1次，温度25-28℃，日光/黑夜光照时间12h/12h，光照强度1600lux。
优选的，所述步骤C中在不同的细胞分裂素和生长素的配比情况下，不同材料诱导出不定芽的难易程度和出芽时间并不一致。
MS+0.8mg/L6-BA+0.05mg/LNAA
MS+1.0mg/L6-BA+0.03mg/LNAA
MS+1.2mg/L6-BA+0.02mg/LNAA
不定芽适合的诱导培养基MS+1.0-1.2mg/L6-BA+0.03mg/LNAA。经过实验条件的筛选，在细胞分裂素浓度在1.0左右的条件，不定芽诱导比例为50-60％。
观赏向日葵组织培养及植株再生--筛选目标基因型
外植体扦插于含有1/2MS+0.001g/L CuSO4+20g/L蔗糖+0.1g/L活性炭培养基中。预培养处理7-10D，培养温度为(26±1)℃；相对湿度为70％～80％；光照时间为14h/d；光照强度为2000lx。
1、子叶、子叶节、下胚轴、真叶等，进行愈伤诱导
MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5mg/L KT+0.2mg/L GA3
MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LIAA
MS+1.2mg/L 6-BA+0.03mg/L IAA
2、愈伤增值诱导---体细胞诱导---再生诱导
MSB+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA
MSB*+0.1mg/LIAA+0.5mg/L KT
MSB2+0.5mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D+1.0g/L谷氨酰胺+0.5g/L天门冬酰胺+1.9g/LKNO3+3.0g/L Phytagel
不同组织子叶、子叶节、下胚轴、真叶诱导愈伤组织的条件摸索
将不同基因型观赏向日葵外置体，接种在含有不同浓度的培养基上，所有组织接种到三种培养基上，形成愈伤组织或者愈伤组织很小，但是随着时间的推移，愈伤在明显增值。
摸索了向日葵材料在一定的激素诱导下，可以成功产生不定芽，不同材料之间在条件和有一定的差异；愈伤诱导情况：初生愈伤明显，材料之间的差异还没有稳定；次生代谢物存在，需要摸索条件去除，愈伤活性在一定激素调整下有所改善。
再次处理
1.种子种植盆栽向日葵幼苗，进行取样，消毒处理，愈伤与不定芽诱导；
2.确定不定芽诱导的激素组合与配比，统计不同基因型材料之间的差异；
3.解决次生代谢物，进行预处理培养；
4.外植体制备：需要切取大小合适的外植体，试着剥取茎尖培养；叶片幼叶，未成熟花絮，横切幼茎进行诱导愈伤再生；
5.外植体愈伤诱导并增值培养后，体细胞诱导。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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